人类博卡病毒(HBoV)非结构蛋白NS1基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

目的:克隆、表达、纯化人类博卡病毒(HBoV)非结构蛋白NS1,制备抗NS1多克隆抗体。方法:利用PCR扩增HBoV非结构蛋白NS1基因,将其克隆至pMAL-c2X表达载体上,重组质粒转化大肠杆菌DH10B,IPTG诱导表达。表达的融合蛋白经Amylose Resin亲和层析柱纯化后,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。用间接ELISA法检测抗体效价。结果:原核表达融合蛋白MBP-NS1,并获得了其多克隆抗体,抗体效价达到1∶32000。结论:在原核表达系统中表达、纯化了融合蛋白,制备抗NS1多克隆抗体,为进一步研究该病毒非结构蛋白基因的转录和翻译机制提供可靠的工具。     

甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2 EGF片段多克隆抗体的制备及鉴定

目的制备甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2(MBL-associated serine protease-2,MASP-2)EGF功能区蛋白的多克隆抗体并进行鉴定,为后续研究奠定基础。方法利用带有EGF基因片段的p GEX-6P-2原核载体诱导表达GST-EGF融合蛋白,并采用商品化GST-Beads进行纯化;将纯化的融合蛋白作为抗原,与弗氏完全佐剂充分混合后,免疫5周龄BALB/c雌性健康小鼠,制备多克隆抗体;利用琼脂双扩散法检测多克隆抗体的效价,并进一步应用Western blot鉴定多克隆抗体的特异性及效价。结果成功表达并纯化EGF蛋白,以此成功制备出特异性强的GST-EGF融合蛋白的多克隆抗体,与其他蛋白无交叉反应;琼脂双扩散法检测的EGF抗体效价为1∶8;Western blot检测的EGF抗体效价大于1∶2 000。结论成功制备出具有特异性强且效价高的GST-EGF蛋白的多克隆抗体。     

OS-9基因的融合表达、纯化及多克隆抗体制备

OS 9基因广泛表达于人体多种组织 ,该基因的表达产物可能与肿瘤的发生相关 .为获得可溶性表达的OS 9蛋白 ,制备多克隆抗体 ,深入了解OS 9基因的功能 ,将OS 9基因片段克隆入组氨酸标签融合的表达载体pET2 8a中 ,IPTG诱导 ,利用金属螯合亲和层析 (MCAC)进行纯化 ,薄层扫描及Bradford法检测纯化蛋白的纯度与含量 .免疫家兔制备多克隆抗体 ,利用间接ELISA法检测抗体效价 ,Western印迹检测抗体特异性 .经表达形式分析证明 ,融合蛋白大部分可溶 .薄层扫描分析纯度可达 90 %以上 ,Bradford法检测蛋白浓度约 0 1mg ml.抗血清效价可达 1∶32 0 0以上 ,Western印迹检测证明抗体特异性良好 .经诱导表达及纯化制备出可溶的纯度较高的OS 9蛋白产物 ,并获得高效价特异性良好的多克隆抗体     

小麦TaMAPK2基因的克隆及表达分析

该研究从小麦中克隆了1个MAPK基因TaMAPK2。序列分析表明,TaMAPK2基因的ORF为1 110bp,编码369个氨基酸。序列比对分析表明,该基因所编码的蛋白与粗山羊草、水稻、谷子等MAPK蛋白具有较高的一致性,分别为99%、94%、94%。进化树分析表明,TaMAPK2与水稻OsMAPK2的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析表明,该基因的表达显著受渗透胁迫、低温胁迫、高盐胁迫、乙烯和双氧水诱导,受ABA抑制。研究表明,TaMAPK2可能参与非生物逆境胁迫及相关信号分子应答。     

青杄FKBP12基因原核表达和多克隆抗体的制备

目的:制备青杄FKBP12基因的多克隆抗体,为进一步分析FKBP12的蛋白定位、表达等提供基础。方法:采用PCR方法扩增FKBP12基因得到其全长cDNA序列,并将其克隆至原核表达载体pET-48b中,转化入BL21菌株。经IPTG诱导,表达了分子量约为33kD的重组蛋白,SDS-PAGE和Western blotting检测鉴定表达产物。此蛋白经亲和纯化后,作为抗原注射新西兰兔,进行抗体制备。结果:成功获取了多克隆抗体,制备的FKBP12兔抗血清效价在1∶729 000以上,ELISA结果表明融合蛋白具良好的免疫原性。间接ELISA法检测纯化后抗体效价,表明纯化后抗FKBP蛋白兔多克隆抗体效价高,检测灵敏度为16ng/mL。结论:所制备的抗体能满足后续试验要求的效价值,为进一步研究提供基础。     

弓形虫MIC2胞质尾段蛋白及其多克隆抗体的制备

目的:制备弓形虫微线体蛋白2胞质尾段(MIC2C)蛋白片段及其多克隆抗体。方法:以弓形虫cDNA文库为模板,PCR扩增135bp MIC2C基因片段,构建MIC2C/pGEX-4T-1原核表达系统;IPTG诱导表达GST-MIC2C融合蛋白;用纯化的融合蛋白加免疫佐剂背部皮内注射免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,亲和层析纯化并分析抗体的效价。结果:构建了MIC2C原核表达系统,表达并纯化了GST-MIC2C融合蛋白,蛋白的浓度为3.07mg/ml;获得了抗该蛋白的兔源性抗血清,纯化后的多克隆抗体效价为1:16 000。结论:在体外制备并纯化了GST-MIC2C融合蛋白及其多克隆抗体,为后续弓形虫入侵机制的研究奠定了基础。     

Carboxin抗性基因(Cbx~R)原核表达及多克隆抗体的制备

[目的]克隆CbxR基因,进行原核表达,纯化CbxR基因蛋白并制备其多克隆抗体。[方法]CbxR基因克隆至原核表达载体p ET-28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达并纯化,Western blot鉴定分析。制备CbxR蛋白的兔源多克隆抗体,运用间接ELISA方法检测多抗效价,利用Western blot印记检测抗体特异性。[结果]成功获得CbxR基因,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导可大量表达,成功制备CbxR蛋白兔源多克隆抗体,效价为1∶64 000,经Western blot检测表明多克隆抗体特异性良好。[结论]多克隆抗体为CbxR检测及进一步研究CbxR基因功能奠定了基础。     

猪δ冠状病毒(PDCoV)N蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

旨在表达和纯化猪δ冠状病毒(PDCoV)N蛋白并制备该蛋白的多克隆抗体。以RT-PCR扩增PDCoV N基因并与表达载体pET-28a构建重组质粒,转化Transetta(DE3)菌株诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白表达,以纯化的N蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,Western blot验证兔抗血清特异性,间接ELISA测定抗血清效价。利用间接免疫荧光试验(IFA)、免疫荧光试验(IF)、流式细胞术(FCM)鉴定其诊断应用价值。重组N蛋白为可溶性表达,大小约为44 kD,制备的兔抗N蛋白抗体效价可达1∶204 800。IFA与FCM试验证实该抗体能与PDCoV特异性结合,与PEDV及TGEV无交叉反应,IF试验表明该抗体可用于检测小肠组织中的PDCoV。     

茶树咖啡碱合成酶基因原核表达、及其抗体制备与鉴定

克隆出茶树咖啡碱合成酶基因,对其进行原核表达,并制备TCS1抗体,旨在从蛋白水平研究茶树体内TCS1的表达情况。根据Gen Bank登陆的TCS1基因的全长c DNA序列,找出其完整的ORF(开放阅读框),从茶树叶片c DNA中克隆了TCS1基因的开放阅读框,连接到p GEX-4T-2表达载体,经IPTG诱导表达重组蛋白p GEX-4T-2-TCS1。进行体外酶活检测后,亲和层析纯化重组蛋白,作为抗原免疫家兔,制备TCS1多克隆抗体。用ELISA方法检测抗体效价,Western blot检测抗体的特异性。通过优化诱导条件,得出重组蛋白的最佳表达条件为:30℃、4 h。诱导后的总蛋白、可溶性蛋白与包涵体蛋白均出现一条明显的外源蛋白条带。抗体经ELISA检测,效价为1∶2 000,Western blot检测表明抗体具有相对较好的特异性。构建了TCS1原核表达质粒,同时成功制备了抗TCS1的多克隆抗体。     

跨膜逆向转运蛋白NHXFS1多克隆抗体的制备及应用

NHXFS1基因是通过DNA家族改组（DNA family shuffling）技术,以拟南芥、水稻和菊花的液泡膜Na＋/H＋逆向转运蛋白基因（NHX1）为亲本获得的活性显著增强的新基因。为制备该蛋白的多克隆抗体,对该蛋白进行跨膜结构分析,选取跨膜蛋白的C末端为靶标,并将其克隆到原核表达载体pET32a中,成功构建了原核融合蛋白pET32a-NHXFS1-抗原表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）并诱导表达。通过镍柱亲和层析纯化该融合表达蛋白,获得了纯度约为80%的纯化蛋白,用于免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。ELISA实验表明,该抗体的效价达到1：128 000,提取表达NHXFS1蛋白的酵母液泡经该多克隆抗体Western blot检测,证明该抗体具有较好的NHXFS1蛋白特异性。NHXFS1多克隆抗体的制备为进一步认识NHXFS1新蛋白结构与功能以及植物耐盐分子生物学的研究奠定了基础。     

小鼠膜型抗衰老蛋白Klotho基因特异片段的克隆、原核表达及多克隆抗体制备

目的克隆小鼠膜型抗衰老蛋白Klotho基因特异片段,制备小鼠Klotho多克隆抗体。方法以小鼠基因组为模板进行PCR,克隆了小鼠膜型抗衰老蛋白Klotho基因外显子Ⅳ部分序列,经BamH I和Nhe I双酶切后定向克隆到质粒pET-GST中,构建原核表达质粒pET-GST-Klotho,转化大肠埃希菌BL21（DE3）,用IPTG诱导表达。以重组GST-Klotho融合蛋白免疫家兔,制备Klotho多克隆抗体。结果表达产物经SDS-PAGE检测表明,在大肠埃希菌中成功表达了GST-Klotho融合蛋白,GST-Klotho融合蛋白表达量占菌体总蛋白的15％左右;另外通过ELISA法测得抗血清抗体效价约为1：10000,Western印迹分析验证了抗体特异性。结论GST-Klotho融合蛋白的表达和Klotho多克隆抗体的制备为进一步研究Klotho蛋白在小鼠体内的表达模式以及相关抗衰老药物的研制奠定了基础。     

登革2型病毒非结构蛋白NS4B的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

目的：原核表达、纯化登革2型病毒非结构蛋白NS4B,并制备其多克隆抗体,以研究其结构与功能。方法：扩增编码登革2型病毒NS4B的24-238位氨基酸残基的基因序列,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达;采用蛋白浸提方法从SDS-PAGE胶中回收融合蛋白;用纯化后的融合蛋白免疫BALB／c鼠制备多克隆抗体,采用间接免疫荧光法检测抗体效价。结果：原核表达了NS4B-GST融合蛋白,并获得了其多克隆抗体,抗体效价为1：800。结论：登革2型病毒NS4B的24-238位氨基酸残基可诱导小鼠产生具有较高效价和特异性的多克隆抗体,这为研究NS4B的结构与功能奠定了基础。     

小鼠mP24基因的原核表达及多抗制备

目的：本研究是为后续实验中深入研究小鼠mP24基因的功能及活性提供mP24多克隆抗体。方法：mP24是小鼠中新发现的新基因,通过构建了pET-28a（＋）/mP24原核表达质粒,转化入大肠杆菌BL21（DE3）中,IPTG诱导宿主细菌表达融合蛋白。经过SDS-PAGE分析,结果表明该蛋白能以可溶性蛋白形式存在。利用镍柱纯化融合蛋白,免疫新西兰兔,制备mP24多抗。结果：Western Blot结果显示,制备的抗小鼠mP24多克隆抗体具有较高的特异性。ELISA实验检测,该多抗对免疫抗原的效价高达1：9000,具有较高的效价。结论：本实验成功制备了mP24的多克隆抗体,为进一步开展mP24基因功能的研究奠定了基础。     

棉铃虫核型多角体病毒orf86基因的原核表达、抗体制备与免疫印迹检测

棉铃虫核型多角体病毒(Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus,HearNPV)orf86是一个功能未知的基因。从HearNPV基因组中通过PCR得到orf86基因编码序列,将其构建于原核表达载体pGEX-4T-2,转化大肠杆菌BL21获得融合表达产物。融合表达蛋白经分离纯化后免疫新西兰大白兔,制备其多克隆抗体。用ELISA测定结果表明,ORF86多克隆抗体效价为1:5.12×105。利用该抗体Western印迹检测HearNPV感染的HZAM1细胞,检测到一个36kD的目的蛋白条带,与ORF86预期大小一致。结果表明该多抗可用于对orf86编码蛋白的检测和相关功能研究。     

利用噬菌体展示技术筛选草鱼呼肠孤病毒VP39蛋白相互作用多肽

VP39是草鱼呼肠孤Ⅲ型病毒(GCRV GenotypeⅢ, GCRV-Ⅲ)S9基因编码的蛋白,为研究VP39蛋白在GCRV-Ⅲ感染草鱼细胞过程中行使的生物学功能,将克隆VP39基因序列并构建原核表达载体pET32a-VP39,通过原核表达得到VP39-HIS融合蛋白;利用VP39蛋白溶液免疫小鼠,制备鼠抗VP39多克隆抗体,通过Western Blot对抗体进行评估;利用制备的多克隆抗体探究GCRV-Ⅲ感染细胞过程中VP39蛋白表达动力学;利用噬菌体展示技术筛选与VP39蛋白特异性结合的多肽序列并进行分析。SDS-PAGE电泳结果显示, VP39-HIS融合蛋白可良好溶于PBS中,蛋白大小约为39 kD; Western Blot检测表明实验所制备的VP39多克隆抗体在1:10000稀释比例下,既能识别原核表达的VP39-HIS融合蛋白,也能识别GCRV-Ⅲ感染CIK细胞后表达的VP39蛋白,具有良好的效价与特异性;在病毒侵染过程中, VP39前期表达量较少,在中后期大量表达;噬菌体展示技术筛选出两条多肽与VP39蛋白有高度亲和性,经过在NCBI上比对后发现草鱼基因组中有7个基因与筛...     

发菜NdhK的抗体制备与蛋白表达

发菜是一种陆生蓝藻,分布于一些干旱和半干旱区域。其NADPH脱氢酶(NDH-1)是一种重要的光合膜蛋白复合体,参与CO₂吸收、围绕光系统Ⅰ的循环电子传递和细胞呼吸。为研究该物种中ndhK基因的功能,本研究利用特异性引物,通过PCR方法从发菜中扩增ndhK基因并克隆到原核表达载体pET-32a上,得到表达载体pET-32a-ndhK,将其转入大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,得到分子量大小为43 kDa的融合蛋白NdhK。随后,采用亲和层析,对融合蛋白进行纯化回收,并以此回收蛋白作为抗原进行免疫,制备NdhK的多克隆抗体。最后,利用Western blot蛋白免疫印迹对所得抗体的特异性进行验证。从而为进一步探索发菜ndhK基因的功能以及发菜中NDH-1复合体各亚基的作用进行前期准备。     

拟南芥WUSCHEL蛋白的原核表达、亲和纯化和多克隆抗体制备

本研究构建了带有His标签的拟南芥(Arabidopsis thaliana)WUSCHEL基因原核表达载体pET-31b(+)-WUS-His(6),优化了大肠杆菌(Escherichia coli)诱导表达体系,将亲和层析纯化后的WUS融合蛋白,经尿素梯度透析复性溶解,免疫新西兰大白兔,成功制备了WUS蛋白多克隆抗体。通过琼脂糖免疫扩散检测确定了抗血清效价和特异性,并以斑点杂交和Western blotting检验其灵敏性。结果表明,成功构建的拟南芥WUS原核表达载体,在E.coli中以0.5mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)28°C诱导表达10h后,融合蛋白得到高水平表达,亲和纯化后目标蛋白纯度达96%以上,所制备的多克隆抗体具有较高特异性和灵敏性,可用来检测纳克级蛋白抗原。     

猪FcγRIII的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：构建猪FcγRIII 基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备鼠抗猪 FcγRIII 抗血清。方法：从质粒pTG19-T-FcγRIII中用PCR方法克隆到编码完整猪FcγRIII蛋白分子的基因片段,将其插入到原核表达载体pET-32a中,构建了猪FcγRIII 原核表达载体pET-FcγRIII ,转化大肠杆菌BL21 (DE3) ,IPTG诱导蛋白表达,经尿素洗涤纯化后,以纯化后的融合蛋白FcγRIII-His 为抗原免疫小鼠,获得抗血清。Western blotting、ELISA 法鉴定获得的抗血清,ELISA 结果显示抗体效价为1∶16000,具有高度特异性,免疫印迹结果显示制备的多抗可以与重组猪FcγRIII蛋白特异性结合。结果：成功构建猪FcγRIII原核表达载体,纯化到融合蛋白FcγRIII-His,用纯化的融合蛋白免疫小鼠制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA 法证实多克隆抗体制备成功。结论：成功获得了猪 FcγRIII 多克隆抗体,为进一步研究猪FcγRIII 蛋白的功能奠定了基础。     

转录因子XBP1的融合表达、纯化及多克隆抗体的制备

人X盒结合蛋白 1(XBP 1)为一种转录因子 ,与多种肿瘤的发生、发展有密切关系 .XBP 1有2种剪切形式 ,即XBP 1S和XBP 1U .将这 2种剪切形式中的一段相同编码序列 (编码 82～ 14 7位氨基酸 )重组于谷胱甘肽S转移酶 (GST)融合蛋白表达载体pGEX KG中 ,构建成重组质粒pGST XBP 1(82～ 14 7位氨基酸 ) .将该重组质粒转化E .coliDH5α后 ,表达GST XBP 1(82～ 14 7位氨基酸 )融合蛋白 ,经谷胱甘肽 Sepharose 4B亲和层析获得纯化的融合蛋白 .用此融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体 .利用制备的抗体分别用Western印迹和免疫细胞化学检测XBP 1的 2种剪切形式在哺乳动物细胞中的表达 .结果表明 ,该抗体对XBP 1的 2种剪切形式均具有反应原性 ,效价高 ,特异性好 ,可以用于进一步研究XBP 1的功能