重组酵母鸡γ干扰素的抗病毒活性测定及临床初步应用

为了获得具有天然抗病毒活性的重组酵母鸡γ干扰素,以Con A(刀豆素A)诱导培养4~10h的鸡全血中提取的淋巴细胞总RNA为模板,通过RT-PCR的方法扩增出鸡γ干扰素成熟蛋白基因。通过EcoRⅠ和XbaⅠ两个酶切位点把鸡γ干扰素成熟蛋白基因插入到酵母表达载体pPICZa-A上,得到了重组酵母鸡γ干扰素表达载体pPICZa-A-CHIFN-γ,经BstxⅠ线性化后的重组载体被转入酵母菌株X33中,通过PCR的方法来筛选重组酵母菌,在甲醇诱导表达后,SDS-PAGE结果显示有两株重组菌在诱导72h后其表达上清中有大小为16kDa的目的条带。干扰素生物活性测定经典实验(微量病变抑制实验)和临床初步应用结果皆说明重组酵母鸡γ干扰素具有较强的抗病毒的生物活性和较好的临床使用前景。     

鸡γ干扰素成熟蛋白基因的表达及其产物抗病毒活性测定

以血淋巴细胞提取的总RNA为模板,通过RT-PCR的方法克隆出鸡干扰素成熟蛋白的基因,把它与非融合表达载体pRLC相重组。通过对阳性宿主菌的不同时间的诱导摸索出最佳表达时间。把表达产物进行变性,复性,纯化后加入鸡胚成纤维细胞上,用水疱性口炎病毒进行攻毒,测出鸡重组干扰素的活性单位为1.0?06U/mL,获得了满意结果。     

鸡α干扰素基因的克隆与表达

通过对鸡α干扰素基因的克隆,获取一定纯度的干扰素蛋白.从NCBI上搜索出鸡α干扰素基因的序列,根据其成熟蛋白编码序列设计引物,通过PCR从家鸡肝脏基因组中扩增出成熟鸡α干扰素的编码基因,利用基因重组技术构建出pUcm-T/IFN-α,再亚克隆至载体质粒pET-43.1a( ),构建出pET-43.1a( )/IFN-α重组质粒,经酶切鉴定、DNA测序,证明重组质粒构建正确.将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行发酵,IPTG诱导表达后进行纯化及SDS-PAGE分析.工程菌诱导表达后的电泳图谱在相对分子量约19kDa的位置出现明显目的条带,约占菌体总蛋白的30%,表达产物主要以包涵体形式存在,经过NI2 -NTA亲和层析纯化,SDS-PAGE电泳后经凝胶扫描纯度达95%以上.获得了纯度较高的目的蛋白,为下一步对鸡α干扰素进行复性及活性研究奠定了基础.     

鸡IFN-γcDNA的克隆及测序

应用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）技术,参照图外报道的鸡γ干扰素（CHIFN-γ）cDNA全基因序列,利用自行设计合成的一对引物,从ConA诱导培养的SPF鸡外周血淋巴细胞中扩增出CHIFN-γcDNA基因,并与PMD18-T载体连接,构建了CHIFN-γ基因重组体,经DNA序列测定,确认为CHIFN-γ基因,为进一步表达CHIFN-γ奠定了基础。     

鸡γ干扰素的可溶性表达及纯化产物的抗病毒活性

【目的】克隆鸡γ-干扰素（chIFN-γ）基因,大肠杆菌表达及产物纯化与活性检测。【方法】通过RT-PCR方法用ConA刺激的20日龄SPF鸡的脾脏淋巴细胞中扩增出chIFN-γ成熟蛋白基因cDNA,克隆至原核表达载体pET-32a (+),构建重组表达质粒pET-32a (+)-chIFN-γ,在大肠杆菌BL21（DE3）中经IPTG诱导表达,利用镍柱亲和层析法纯化可溶性蛋白,并进行SDS-PAGE、Western blot鉴定。利用MDCK-VSV系统测定抗病毒活性。【结果】克隆得到456 bp 的chIFN-γ成熟蛋白编码基因,大肠杆菌中成功表达chIFN-γ蛋白,分子量约为31.0 kDa,能与抗His的单克隆抗体和兔源多抗血清发生特异性反应。表达蛋白一部分形成包涵体,另一部分以可溶形式存在,可溶性蛋白经镍柱在天然条件下的纯化得率为3.0 mg/mL。生物学活性试验表明,1:32 稀释纯化的重组chIFN-γ （rchIFN-γ）孵育MDCK细胞后能抵抗100TCID50的VSV攻击。【结论】通过镍柱天然纯化获得的rchIFN-γ具有较好的抗病毒活性,为研制新型抗病毒干扰素制剂奠定基础。     

鸡γ-干扰素在杆状病毒系统中的表达

目的：获得具有生物学活性的重组鸡γ-干扰素（ChIFN-γ）。方法：应用RT-PCR方法扩增ChIFN-γ基因cDNA,将其克隆入杆状病毒表达系统的转移载体pFastBac1,构建重组质粒pFast-ChIFN-γ,通过位点特异性转座,将ChIFN-γ基因整合到Bacmid穿梭载体中,构建重组质粒pBac-ChIFN-γ并转染昆虫细胞Sf9,采用间接免疫荧光试验（IFA）、ELISA试验鉴定重组ChIFN-γ的表达,通过细胞病变抑制法检测重组蛋白的抗病毒活性。结果：IFA、ELISA与细胞病变抑制试验结果显示,重组ChIFN-γ在杆状病毒系统中获得表达,其抗病毒活性达5×103～1×104U/mL。结论：重组ChIFN-γ的获得为其开发应用提供了重要的生物材料。     

鸡κ干扰素在家蚕杆状病毒表达系统中的表达及其抗病毒活性检测

干扰素（interferon,IFN）是宿主先天免疫系统的重要组成部分,它是抵抗病原体的第一道防御。为了利用家蚕杆状病毒表达系统表达鸡κ干扰素,根据已报道的序列对鸡κ干扰素的基因序列进行家蚕密码子优化,并利用共转染技术成功构建了表达用重组杆状病毒。将重组杆状病毒感染家蚕,成功获得了大量鸡κ干扰素的表达产物,并通过Western blot技术对产物进行了检测鉴定。用细胞病变抑制法对干扰素κ抑制VSV-GFP感染鸡成纤维细胞（CEF）的效果进行检测,结果显示鸡干扰素κ的抗病毒效价可以达到(1.04±0.23)×107 IU·mL-1以上。高效价鸡κ干扰素的成功表达为其在抗家禽疫病等方面提供了重要的试验数据。     

重组鸡γ_干扰素在昆虫细胞中的高效表达

将鸡γ-干扰素(ChIFN-γ)基因克隆到载体pFASTBAC1中,构建转移载体pFASTBAC1-ChIFN-γ,然后转化DH10Bac感受态大肠杆菌,通过位点特异性转座,将ChIFN-γ基因整合到Bacmid穿梭载体中,构建表达质粒Bacmid-ChIFN-γ;通过脂质体将表达质粒转染Sf9昆虫细胞,用间接免疫荧光试验鉴定重组鸡γ-干扰素(rChIFN-γ)的表达;通过水泡性口炎病毒感染鸡胚成纤维细胞(CEF)的细胞病变抑制试验,检测rChIFN-γ的活性。研究结果表明,感染重组杆状病毒的Sf9细胞能高效表达rChIFN-γ,且当每个细胞的感染量为1个病毒时,细胞在感染96h后,rChIFN-γ基因表达产物的活性最高,达到106~107.2U/mL。以rChIFN-γ进行对新城疫病毒(NDV)F48E8株、禽流感H5N1病毒(AIV-H5)和马立克氏病病毒(MDV)GA株的抗病毒活性试验,发现rChIFN-γ对AIV-H5和MDV GA株病毒有明显的抑制其致细胞病变作用,但对NDVF48E8株病毒在体外不能抑制其致细胞病变作用,仅能在病毒滴度上表现抑制效果。     

重组鸡γ_干扰素在昆虫细胞中的高效表达

将鸡γ_干扰素(ChIFN_γ)基因克隆到载体pFASTBAC1中,构建转移载体pFASTBAC1_ChIFN_γ,然后转化DH10Bac感受态大肠杆菌,通过位点特异性转座,将ChIFN_γ基因整合到Bacmid穿梭载体中,构建表达质粒Bacmid_ChIFN_γ;通过脂质体将表达质粒转染Sf9昆虫细胞,用间接免疫荧光试验鉴定重组鸡γ_干扰素（rChIFN_γ）的表达;通过水泡性口炎病毒感染鸡胚成纤维细胞（CEF）的细胞病变抑制试验,检测rChIFN_γ的活性。研究结果表明,感染重组杆状病毒的Sf9细胞能高效表达rChIFN_γ,且当每个细胞的感染量为1个病毒时,细胞在感染96h后,rChIFN_γ基因表达产物的活性最高,达到10.6～10 7.2U/mL。 以rChIFN_γ进行对新城疫病毒(NDV) F48E8株、禽流感H5N1病毒（AIV_H5）和马立克氏病病毒 (MDV) GA株的抗病毒活性试验,发现rChIFN_γ对AIV_H5和MDV GA株病毒有明显的抑制其致细胞病变作用,但对NDV F48E8株病毒在体外不能抑制其致细胞病变作用,仅能在病毒滴度上表现抑制效果。     

鸡α干扰素在家蚕中的表达及抗病毒活性测定

鸡α干扰素在防御病毒感染及治疗病毒性疾病中起着重要的作用。旨在利用家蚕杆状病毒表达系统研制有活性的鸡α干扰素。首先对鸡α干扰素基因(ChIFN-α)进行了优化与合成,将其克隆到杆状病毒转移载体pVL1393中,与ORF1629缺损的亲本病毒BmBcmid共转染,纯化重组病毒,再感染家蚕幼虫,收集蚕血淋巴以检测α干扰素基因的表达。Western blot分析结果显示,成功表达出分子量约为19 kD的鸡α干扰素。采用细胞病变抑制法在Vero-VSV*GFP系统中测定表达产物的抗病毒活性。所的表达的鸡α干扰素具有明显的抗病毒活性,活性不低于3.2×105 U/mL。利用杆状病毒载体系统成功地表达了具有抗病毒活性的鸡α干扰素的成熟蛋白,为开发廉价高效的鸡干扰素生物制剂奠定了物质基础。     

鸡白介素18成熟蛋白突变体在毕赤酵母中的高效表达及其生物活性检测

【目的】通过目的基因克隆,表达获得高产量具有生物活性的鸡白介素18成熟蛋白(maturechickeninterleukin-18,mChIL-18)。【方法】根据毕赤酵母密码子偏嗜性,通过引物设计来定点突变鸡白介素18基因,构建了重组质粒pPIC9K-mChIL-18。将线性化的重组阳性质粒电转到毕赤酵母GS115中,经筛选多拷贝阳性子后进行诱导表达。用MTT法和微量细胞病变抑制法检测其生物活性。【结果】筛选的多拷贝重组菌在诱导温度为28℃,培养液pH值为6.5,甲醇的诱导浓度为2%,诱导时间为120h时表达量最高,约为480mg/L。表达的mChIL-18蛋白能够刺激SPF鸡淋巴细胞大量增殖,用400μg/L的mChIL-18诱导淋巴细胞产生γ-干扰素(IFN-γ),其生物活性最高可达1.7×104U/mL,且能有效抑制水泡性口炎病毒(VSV)在鸡胚成纤维细胞(CEF)上的生长。【结论】毕赤酵母能够高效表达具有生物活性的鸡白介素18,有望作为免疫佐剂运用到工业化生产和兽医临床中。     

短期重复口服鸡α干扰素体内抑制H9N2亚型流感病毒复制

为研究口服鸡α干扰素最佳的给药频率及与灭活病毒联合使用对鸡群的影响,文中将构建的原核表达质粒pET-22b-ChIFN-α转入大肠杆菌Escherichia coli BL21 (DE3),宿主菌经诱导表达收获重组包涵体蛋白,经变性、纯化、复性后获得重组鸡α干扰素。SDS-PAGE结果分析显示,目的蛋白可在原核表达载体中高效表达,发酵液上清中目的蛋白浓度高达0.2 mg/mL,分子量约为20 kDa。将鸡α干扰素稀释至活性为2.5×10~4 U/羽份,与灭活H9N2亚型流感病毒联用以口服的方式免疫无特定病原(SPF)鸡群,试验结果表明,短期(96 h)重复免疫3次,鸡α干扰素具有较好的安全性,可诱导鸡群的外周血、脾脏及胸腺产生较高水平的抗病毒相关的诱导基因,攻毒结果显示鸡α干扰素使用次数为连续使用3–5 d鸡群排毒率最低,体现出较好的抗流感病毒能力。本研究结果获得了鸡α干扰素的最佳免疫频率及免疫时间,为干扰素的最佳临床应用方法提供理论支撑。     

表达猪瘟病毒石门株E0基因重组鸡痘病毒的构建及动物免疫试验

应用PCR从质粒pMD18-T-E0中扩增编码CSFV E0蛋白的基因片段,定向克隆到重组鸡痘病毒表达载体FPV-P11上,进一步构建出重组鸡痘病毒转移载体FPV-pSY-E0.用脂质体将该质粒转染至鸡痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)后,通过蓝斑纯化实验筛选出重组鸡痘病毒FV282-CSFV-E0.PCR证实E0基因已整合至鸡痘病毒基因组中,Western blot检测到重组病毒感染CEF细胞中E0蛋白的表达.重组病毒3次腹腔接种小鼠,ELISA检测血清抗体滴度高达1∶4 096.重组病毒免疫猪3次之后,接种猪瘟病毒强毒进行攻毒试验,结果对免疫组产生75%的保护率,为研制猪瘟活载体疫苗奠定了基础.     

鸡γ-干扰素基因重组质粒在工程菌株中的稳定性研究

本文通过传代的方法研究了鸡γ-干扰素基因的重组质粒pET-ChIFN-γ在工程菌CH1中的遗传稳定性.结果表明重纽质粒在没有筛选压力下存在质粒不稳定性,100代时质粒稳定性只有69%.适当的筛选压力可以显著降低质粒的遗传不稳定性,100代时稳定性提高到95%.各代重组菌株在生长性能、质粒酶切图谱、蛋白表达等方面均保持一致,未见明显差异.生物活性检测原代和100代均达到1.0×105 IU/mL以上.以上结果表明重组质粒pET-ChIFN-γ在工程菌株CH1中具有良好的遗传稳定性,其质粒遗传不稳定性可由适当的筛选压力来控制.     

北极狐γ-干扰素cDNA的克隆、表达及活性测定

为研究狐γ-干扰素的生物学活性,应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从北极狐外周血淋巴细胞中扩增出γ-干扰素(VuIFN-γ)cDNA.序列分析表明VuIFN-γcDNA全长501 bp,编码23个氨基酸的信号肽和144个氨基酸的成熟肽蛋白,与已发表的银黑狐和犬IFN-γ核苷酸序列同源性为99.8%和99.4%;氨基酸同源性均为100%.应用原核表达系统高效表达北极狐γ-干扰素成熟肽蛋白,SDS-PAGE和Western blotting分析表达的融合蛋白分子量约为19 kD,以不溶性的包涵体形式存在.重组蛋白经纯化和复性,在Vero和MDCK细胞上可明显抑制VSV病毒的复制,并测出北极狐重组γ-干扰素的活性单位分别为1.0×106 u/mg和1.56×105 u/mg,为进一步开发基因工程狐干扰素奠定基础.     

重组IL-18BP拮抗重组鸡IL-18刺激外周血单核细胞产生IFN-γ的作用

【目的】白细胞介素-18通过激活Th1细胞和NK细胞产生IFN-γ而发挥关键的免疫调节作用。人和小鼠分泌的白细胞介素-18结合蛋白(IL-18BP)可以拮抗其活性。推测在鸡痘病毒基因组中也含有IL-18BP基因的同源物,对其表达的蛋白质进行了活性鉴定,为拮抗IL-18主导的疾病提供理论依据。【方法】根据鸡痘疫苗病毒的基因组序列设计特异性引物,使用PCR方法从中分离cIL-18BP基因,将该基因克隆到酵母表达载体pPICZαA中,甲醇诱导后在酵母GS115中进行表达。对表达的重组蛋白进行了活性鉴定。【结果】从鸡痘病毒中克隆到cIL-18BP基因,SDS-PAGE鉴定了该基因在酵母系统中的高效表达。ELISA检测表明纯化后的cIL-18BP与重组鸡(c)IL-18发生特异性结合;通过测定IFN-γ的浓度,表明该蛋白具有拮抗IL-18刺激外周血单核细胞(PBMCs)和MSB1细胞分泌IFN-γ的活性。【结论】实验表明,cIL-18BP通过抑制cIL-18刺激相关免疫细胞分泌IFN-γ而发挥对IL-18的拮抗作用,敲除该基因可能有助于研制更安全和高效的鸡痘疫苗。     

携带猪γ干扰素基因逆转录病毒载体的构建及其在猪肾细胞(PK-15)中的表达

将梅山猪γ干扰素基因定向插入逆转录病毒载体pLXSN(neor),构建逆转录病毒重组质粒,利用脂质体介导法将重组质粒转染逆转录病毒包装细胞系PA317,转染细胞经含G418(400μg/mL)培养基筛选一周后获得稳定产毒的PA317细胞系。从细胞培养上清中提取RNA,进行RT-PCR检测,扩增到目的片段;将上清感染猪肾细胞(PK-15),经含G418(400μg/mL、600μg/mL和800μg/mL)的DMEM筛选一周,间接免疫荧光表明表达的猪γ干扰素主要锚定于细胞膜。收取PK-15细胞上清,在牛肾细胞(MDBK)上进行干扰素抗病毒活性检测,结果显示重组病毒表达的猪γ干扰素抗水泡性口炎病毒(VSV)的活性为1200IU/106cells.48h。以表达的干扰素处理PK-15细胞后,经细胞病变抑制法测定,重组猪γ干扰素可以抵抗口蹄疫病毒(FMDV)感染。试验结果表明猪γ干扰素基因已成功插入逆转录病毒基因组并在PK-15细胞中表达,表达的重组猪γ干扰素具有较强的抗病毒生物活性。     

猪γ干扰素在家蚕中的表达和抗病毒活性检测

干扰素在畜牧养殖业中可以用于病毒性传染病的治疗和疫苗免疫效力的提高,用杆状病毒表达系统在家蚕中表达了猪γ干扰素。根据已发表的序列对猪γ干扰素基因的密码子进行优化并合成,将其克隆到杆状病毒转移载体p VL1393上,与Bm Bacmid病毒基因组DNA共转染Bm N细胞系,获得重组病毒,猪γ干扰素基因位于重组Bm NPV病毒的多角体基因启动子下游。用该重组病毒感染家蚕获得含有猪γ干扰素的表达产物。Western blotting检测到表达产物中的猪γ干扰素,用微量细胞病变法利用干扰素抑制VSV-GFP感染VERO细胞的方法来测定干扰素活性,结果显示干扰素效价可以达到6×105 IU/m L以上。在家蚕幼虫体内成功表达并获得了有活性的猪γ干扰素。     

斑马鱼干扰素γ的克隆表达研究

目的：通过人工诱导斑马鱼干扰素的产生,证实两种斑马鱼干扰素γ基因ifng1-1和ifng1-2的存在,并克隆这两种干扰素基因,构建高效表达载体并做原核表达。方法：通过conA药浴,诱导斑马鱼干扰素γ的表达,即刻提取组织总RNA,并通过RT-PCR方法扩增两种干扰素γ基因。将目的基因连入表达载体pET24a,构建重组载体pET24a-ifng1-1和pET24a-ifng1-2。将载体转化BL21,并用IPTG诱导融合蛋白的表达。产物经SDS-PAGE检测,分析蛋白表达情况。结果：成功克隆了两种斑马鱼干扰素γ基因,构建了pET24a-ifng1-1和pET24a-ifng1-2重组载体,并实现了原核融合表达。结论：两种干扰素γ基因都能够被conA所诱生,且具有相似特性,表明两种干扰素γ都不是假基因,都有可能在免疫系统中发挥作用,本实验为进一步研究两种干扰素γ的功能奠定了基础。     

鸡碳酸酐酶4基因在毕赤酵母中的表达

[目的]通过毕赤酵母的表达获得鸡碳酸酐酶4(CAⅣ)蛋白。[方法]根据鸡CAⅣ的序列,结合毕赤酵母密码子的偏好性,合成CAⅣ基因。将CAⅣ基因克隆到pPICZαA真核表达载体,获得重组表达质粒pPICZαA-CAⅣ。将其电转毕赤酵母GS115后,获得重组毕赤酵母菌GS115/pPICZαA-CAⅣ。用终浓度为1%的甲醇对重组阳性菌进行诱导表达,通过SDS-PAGE和Westernblot法检测蛋白的表达,并用Ni离子亲和层析法对表达出的蛋白进行纯化。[结果]成功构建了表达载体pPICZαA-CAⅣ,转化重组酵母菌后可分泌出36kDa左右的CAⅣ蛋白,并通过Ni离子亲和层析法获得了单一性的目的蛋白CAⅣ。[结论]获得分子量约36kDa的鸡CAⅣ蛋白。