葱鳞葡萄孢菌诱导下韭菜RT-qPCR内参基因的筛选和验证

葱鳞葡萄胞菌引起的韭菜灰霉病是影响韭菜产量和品质的主要因素之一。为了筛选出感染灰霉病后韭菜叶片中稳定表达的内参基因用于基因定量表达分析,以模拟接种和接种葱鳞葡萄孢菌24、48、72 h的韭菜叶片为材料,基于前期的转录组测序结果选取UBC1、UBC2、UBQ1、UBQ2、GAPDH3、GAPDH4、TUB、EF-1α、40S RP、DDX、eIF-1A、PABP和DnaJ共13个基因为候选内参基因,利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测13个基因的表达情况,采用geNorm、NormFinder、BestKeeper软件和Reffinder在线程序对候选内参基因的表达稳定性进行评估。结果表明,13个候选内参基因中UBQ1的Ct值变化范围最小,表达水平最稳定。GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件筛选出的最佳内参基因不同,RefFinder综合评估显示,UBC2和UBQ1是韭菜叶片接种葱鳞葡萄孢菌后表达稳定性较好的基因,DDX是稳定性较差的基因。为了验证所筛选内参基因的可靠性,选择6个稳定性不同的候选内参基因分别作为定量分析的内部参照,对接种葱鳞葡萄孢菌后不...     

三叶木通转录组分析及三萜皂苷生物合成途径关键酶基因的发掘

为了解三叶木通(Akebia trifoliata(Thunb.)Koidz.)的三萜皂苷合成途径及其关键酶,本研究对其花、叶、根、茎进行转录组测序,组装获得了57.25 Gb数据,含140 859个unigenes,序列平均长度为1350 bp。KEGG代谢通路富集结果显示,517个unigenes参与三萜皂苷合成相关的3条代谢途径,其中415个unigenes编码三萜皂苷生物合成途径的19个关键酶。对三萜皂苷生物合成过程中的关键酶角鲨烯环氧酶(SE)进行序列分析和同源建模,发现其具有保守的底物结合结构域。将三叶木通茎与花、叶、根的基因表达水平进行比较,发现茎与根相比较其上调基因数目最多,其中295个差异表达基因(DEGs)与三萜皂苷生物合成途径相关。     

斑地锦RT-qPCR内参基因的筛选

实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的前提条件之一是具有合适的内参基因。为筛选斑地锦(Euphorbia maculata)合适的RT-qPCR内参基因,该文利用同源克隆法克隆斑地锦GAPDH、EF-1α、act、UBQ、TUB-α、eIF-4A、CYP等基因片段,RT-qPCR检测7个候选内参基因在斑地锦不同生长期根、茎、叶和果实中的表达情况,并用geNorm、NormFinder和BestKeeper等生物学软件对各候选基因表达稳定性进行评价。结果表明:(1)克隆的GAPDH、EF-1α、act、UBQ、TUB-α、eIF-4A、CYP基因片段为729、808、753、422、233、656、313 bp,分别编码242、269、250、140、77、218、103个氨基酸,与其他植物相应氨基酸序列的最高同源性均在85%以上。(2)综合3个分析软件分析内参基因表达稳定性得出,表达稳定性排名为UBQ>EF-1α>TUB-α>eIF-4A>GAPDH>CYP>act。因此,可以选取UBQ作为斑地锦RT-qPCR分析的内参基因,用于不同生长期基因组织特异性表达研究。     

绿豆象实时荧光定量PCR内参基因的筛选

绿豆象Callosobruchus chinensis是一种世界性分布的害虫,对绿豆、豇豆等豆科作物的产量与品质造成严重影响。本研究旨在筛选出适合分析绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中稳定表达的内参基因,根据绿豆象转录组测序以及相关参考文献报道,筛选出8个候选内参基因(β-Actin、β-Tubulin、α-Tubulin、AK、GAPDH、RPL40、Hsc70、eEF1-α),采用qRT-PCR技术分析在绿豆象不同发育阶段(幼虫、蛹、雌雄成虫)以及成虫不同组织中的(触角、头、腹、足、翅)各候选基因的表达量;利用GeNorm、NormFinder、BestKeeper和在线网站RefFinder并结合△Ct值评估8个候选内参基因的稳定性。结果显示,在绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中,各候选内参基因Ct值和跨度均不同,表明各候选内参基因表达量存在差异。不同算法综合比较内参基因稳定性以及GeNorm软件最佳内参基因数目的分析显示,在绿豆象虫不同发育阶段中推荐采用β-Act、β-Tub作为内参基因,而在绿豆象成虫不同组织中推荐采用β-Tub、α-Tub作为内参基因,这有利于在绿豆象的...     

大灰象甲实时定量PCR内参基因的筛选

【目的】筛选出适合分析大灰象甲Sympiezomias velatus成虫不同组织中基因表达水平的内参基因。【方法】利用转录组测序技术获得大灰象甲管家基因序列作为候选内参基因,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析候选基因在大灰象甲雌雄成虫触角、头、胸、腹和足中的表达量;并利用geNorm, NormFinder和BestKeeper软件及在线工具RefFinder评价候选基因的表达稳定性。以大灰象甲气味结合蛋白1(odorant bindng protein 1, OBP1)基因为目标基因验证候选基因在大灰象甲成虫不同组织中的表达稳定性。【结果】基于大灰象甲转录组数据首次鉴定得到β-肌动蛋白基因(ACT)、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)、18S核糖体RNA基因(18S rRNA)、60S核糖体蛋白L12基因(RPL12)、60S核糖体蛋白L32基因(RPL32)、40S核糖体蛋白S20基因(RPS20)、延伸因子2基因(EF2)、α-微管蛋白基因(TUA)和β-微管蛋白基因(TUB)共9个管家基因序列。geNorm分析结果显示,RPL12和RPS20是最稳定表达的内参基因,而BestKeeper和NormFinder分析结果显示最稳定表达的内参基因分别是TUA和TUB。综合各分析方法得出9个候选基因中TUB,TUA,RPS20和RPL12是最稳定表达的内参基因,而18S rRNA,ACT和GAPDH这3个广泛应用的内参基因则表现出最低的表达稳定性。最后以OBP1为目标基因对稳定性不同的4个候选基因进行稳定性验证,发现以TUB和RPL12为内参基因,OBP1在成虫不同组织之间的表达模式基本一致;而以RPL32为内参基因,表达模式与应用TUB作为内参基因时稍有不同,使用18S rRNA作为内参基因得到的OBP1表达模式则与应用TUB作为内参基因时的完全不一致。【结论】TUB,TUA,RPS20和RPL12可以作为分析大灰象甲成虫不同组织中基因表达水平的内参基因,为后续基因表达研究奠定了基础。     

紫玉兰‘红元宝'花芽分化阶段基因定量分析的内参基因筛选

为筛选紫玉兰‘红元宝’(Magnolia liliflora‘Hongyuanbao’)二次花芽分化阶段稳定表达的内参基因,该研究以‘红元宝’不同花芽分化时期的花芽和叶为材料,基于转录组数据,筛选出8个候选内参基因,即泛素酶基因(UBC)、肌动蛋白(ACT)、微管蛋白β链(β-TUB)、微管蛋白β-5链(β-TUB5)、微管蛋白α-3链(α-TUB3)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)、酰基载体蛋白2(ACP2)、酰基载体蛋白3(ACP3)。运用Primer Premier 5设计引物,简单克隆和熔解曲线验证引物特异性;利用qRT-PCR技术检测各个候选内参基因的表达情况,结合GeNorm、NormFinder、BestKeeper软件和RefFinder在线工具综合评估其表达稳定性,并通过目的基因TFL1的表达分析验证其可靠性。结果表明:(1)8个候选内参基因条带位置正确,熔解曲线呈单一峰,说明引物特异性良好。(2)β-TUB、β-TUB5和α-TUB3是‘红元宝’不同花芽分化时期较为稳定的内参基因,而UBC和ACT为稳定性最低的内参基因。(3)β-TUB5、α-TUB3、β-TUB及其组合的相对表达量趋于一致,而ACT和UBC并未对目的基因的表达量进行有效的标准化。因此,β-TUB、β-TUB5和α-TUB3可作为‘红元宝’二次花芽分化研究中稳定表达的内参基因。该研究结果将为木兰属植物二次成花分子调控机制研究提供依据。     

冬虫夏草菌实时荧光定量PCR内参基因的筛选

以冬虫夏草单子囊孢子分离得到的菌株TZ8-1的3种菌丝形态为实验材料,提取RNA,经反转录获取cDNA,选择了11个持家基因为候选内参基因（18S rRNA、APRTase、β-TUB、RPL2、EF1-α、PGI、PGM、H⁺-ATPase、ACT1、UBQ和GAPDH）,根据该菌基因组注释结果来设计引物,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术进行定量扩增,利用geNorm、NormFinder和BestKeeper算法程序进行表达稳定性评估,并用RefFinder对评估结果进行综合排比,最终筛选得到了最适内参基因。结果表明,所选取的11个候选内参基因均可作为冬虫夏草菌菌丝体时期的内参基因,稳定性最好的3个内参基因分别是UBQ、PGE和ACT1,稳定性较差的3个内参基因分别是GAPDH、RPL2和β-TUB。     

黄精实时荧光定量PCR内参基因的筛选

本研究采用实时荧光定量PCR(quantitative Real-t Time PCR,q RT-PCR)筛选适用于黄精(Polygonatum sibiricum)的内参基因。利用黄精转录组数据库,筛选8个候选内参基因,18S核糖体r RNA基因(18S-r RNA,18S)、肌动蛋白基因(Actin,ACT)、细胞色素基因(cytochrome,CYP)、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)、α-微管蛋白基因(α-Tubulin,TUA)、β-微管蛋白基因(β-Tubulin,TUB)、多聚泛素酶基因(ubiquitin 5,UBQ 5)和(ubiquitin 10,UBQ 10)。应用q RT-PCR技术检测这8个候选内参基因在黄精不同组织器官中(根,根茎,茎,叶,花和种子)的表达情况。利用Ge Norm、Norm Finder和Best Keeper 3种统计学软件综合评价8个内参基因的表达稳定性。研究结果表明,TUB在黄精不同组织部位中表达稳定性最好,运用q RT-PCR技术研究黄精器官基因表达时,可选用TUB作为内参基因。确定黄精q RT-PCR分析的合适内参基因,为后续相关基因表达研究奠定基础。     

梨小食心虫实时荧光定量PCR内参基因的筛选

【目的】本研究旨在探明梨小食心虫Grapholita molesta在不同发育阶段、成虫不同组织以及不同浓度的3种杀虫剂处理后成虫中稳定表达的内参基因,为后续对梨小食心虫目的基因表达的研究奠定基础。【方法】基于梨小食心虫转录组数据筛选10个候选内参基因(β-actin, 18S rRNA,β-tubulin,EF-1α,RPL13,RPL32,RSPL40,UBC7,α-tubulin和RPS20);通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定候选内参基因在梨小食心虫不同发育阶段(卵、1-5龄幼虫、蛹和成虫)、成虫不同组织(头、前肠、中肠、后肠、脂肪体、马氏管、精巢和卵巢)以及不同浓度的3种杀虫剂(阿维菌素：19.819, 72.897和179.663μg/mL;吡虫啉：17.638, 163.323和762.986μg/mL以及高效氯氟氰菊酯：33.791, 96.123和198.282μg/mL)通过玻璃管药膜法处理后成虫中的表达量;利用geNorm, NormFinder,ΔCt, BestKeeper和RefFinder对10个候选内参基因的表达稳定性进行评价。选择梨小食心虫细...     

牧草盲蝽实时定量PCR内参基因的筛选

【目的】筛选出适合牧草盲蝽Lygus pratensis在不同条件下稳定表达的内参基因。【方法】选取编码牧草盲蝽α-微管蛋白、β-微管蛋白、肌动蛋白、延伸因子、琥珀酸脱氢酶复合体A、泛素、转录起始因子TFIID亚基、谷胱甘肽S-转移酶、核糖体蛋白L32及TATA盒结合蛋白的10条基因为候选内参基因,采用qRT-PCR技术测定其在牧草盲蝽不同性别成虫、成虫不同组织、不同龄期、对功夫菊酯不同抗性成虫、不同温度及不同杀虫剂分别处理后的成虫共6类样品中的表达量;采用BestKeeper, geNorm, NormFinder及RefFinder 4种计算程序对各候选基因的表达稳定性进行评价。【结果】依据获得的有效qRT-PCR数据前提,利用不同计算方法综合分析得出：在牧草盲蝽成虫不同组织中和对功夫菊酯不同抗性成虫中最稳定表达的内参基因均为RPL32;不同温度处理、不同性别成虫中、不同杀虫剂处理和不同龄期牧草盲蝽中最稳定表达的内参基因分别为UBQ, SDHA, β-tubulin和TAF。通过geNorm软件判断配对变异数确定的内参基因最佳数目,结合RefFinder对基因表达稳定性综合排序的结果可得：牧草盲蝽不同成虫组织中、不同性别成虫中、不同龄期、对功夫菊酯不同抗性成虫中、不同温度及杀虫剂分别处理的成虫等各组的最优内参基因组合分别为RPL32+TAF, SDHA+GST, TAF+GST+UBQ, RPL32+GST, UBQ+ACT+β-tubulin和β-tubulin+TAF+RPL32。【结论】本研究获得的牧草盲蝽在不同条件下表达最稳定及最适内参基因组合,都可用于后续的基因定量表达研究。     

光裸星虫(Sipunculus nudus)不同发育时期卵细胞内参基因的筛选

内参基因的选择对功能基因表达量的归一化处理尤为重要。为了筛选出光裸星虫不同发育时期卵子的最适内参基因,利用qRT-PCR测定了甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、肽基脯氨酰顺反异构酶A(PPIA)、60S核糖体蛋白L10(60S-L10)、铁蛋白(Ferritin)、β-肌动蛋白(β-actin)、泛素C(UBC)、真核生物翻译起始因子(eIF)、NADH脱氢酶(NDH)、28S核糖体RNA(28S)、TATA盒结合蛋白(TBP)、18S核糖体RNA(18S)和琥珀酸脱氢酶A亚基(SDHA)共12个候选内参基因的表达水平,并通过4个程序(geNorm,NormFinder,BestKeeper以及RefFinder)综合分析了各基因的表达稳定性。结果显示:(1)12个候选内参基因均能获得特异性扩增产物,但表达情况各异;(2)对候选内参基因进行综合打分,得到候选内参基因稳定性排名为18S>GAPDH>28S>β-actin>UBC>e IF>NDH|TBP>PPIA|Ferritin>60S-L10>SDHA。18S和GAPDH稳定性较好,可作为不同发育时期卵细胞基因表达研究的单内参基因,或最优组合内参基因。     

基于转录组测序的姬松茸镉胁迫下内参基因筛选

[目的] 筛选不同实验条件下,尤其是镉胁迫下的姬松茸内参基因,为研究姬松茸镉富集相关基因功能研究奠定基础。[方法] 根据不同浓度Cd（0、2、5 mg/L）胁迫下菌丝中转录组表达量数据,筛选出18个候选基因,设计了30对引物;根据引物扩增的特异性、扩增效率初步筛选出来自不同基因的5对引物;运用qRT-PCR检测了5个基因在不同浓度Cd胁迫下的菌丝样品、原基、菌柄和菌盖中的C_t值,利用geNorm、NormFinder和BestKeeper对这些基因的表达稳定性进行评价。[结果] SGT2和STK是菌丝阶段Cd胁迫下最稳定的2个候选内参基因,GAPDH是不同组织中最稳定的内参基因,SGT2、STK和GAPDH是所有实验条件下最稳定的3个内参基因。[结论] 在姬松茸镉胁迫条件下,本研究筛选出的SGT2和STK比常用的内参基因表现出更强的稳定性。     

黄梁木实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择

为筛选黄梁木(Neolamarckia cadamba)实时定量PCR最佳内参基因, 该研究以黄梁木的根、芽、叶、花、果、皮及形成层为材料, 利用RT-qPCR技术对ACT、CAC、CYP和EF1α等21个管家基因家族43个候选内参基因进行表达量分析, 并利用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件进行内参基因稳定性分析。geNorm的分析结果显示, UPL基因的稳定性最高(M=0.443), UBQ基因的稳定性最低(M=2.859); NormFinder的分析结果显示, UPL基因的稳定性最高(E=0.223), UBQ基因的稳定性最低(M=4.759); BestKeeper分析显示, UPL基因的标准偏差(SD=0.513)最低。研究结果表明, UPL基因作为内参基因稳定性最高, UBQ基因的稳定性最低。因此可以选择UPL基因作为黄梁木不同组织中RT-qPCR定量分析的内参基因。     

Bt毒素诱导下小菜蛾实时定量PCR 内参基因的筛选

【目的】筛选出Bt毒素诱导后的小菜蛾Plutella xylostella (L.)的实时定量PCR最适内参基因。【方法】选取核糖体18S rRNA (18S rRNA)、 肌动蛋白（ACTB）、 延伸因子（EF1）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）、 核糖体蛋白L32 (RPL32)、 核糖体蛋白S13 （RPS13）、 核糖体蛋白S20 （RPS20）和β-微管蛋白(TUB)基因作为候选内参基因, 以geNorm、 Normfinder和BestKeeper软件分析这8个基因在Bt毒素诱导后的小菜蛾不同品系中肠组织中的表达稳定性。并应用筛选出来的内参基因分析小菜蛾氨肽酶2（aminopeptidase N2, APN2）基因的表达水平。【结果】geNorm软件以RPS13和EF1为最稳定内参基因, NormFinder和BestKeeper软件均以RPS13和RPL32为最稳定基因。使用3种不同内参基因分析Bt毒素诱导后的小菜蛾Bt抗性和敏感品系中ANP2表达水平时, 新的内参基因EF1和传统内参基因RPL32表现了良好的稳定性, 二者作为标准化因子, ANP2表达量结果基本一致, 而使用18S rRNA作为内参基因, 却导致部分表达量分析结果有所误差。【结论】筛选出PRS13,RPL32和EF1可以作为小菜蛾某些试验条件下的内参基因, 对小菜蛾基因表达研究奠定了一定基础, 也对其他昆虫内参基因的筛选具有参考价值。     

基因表达研究中内参基因的选择与应用

管家基因是一类无组织特异性的,在物种的所有组织细胞中都表达的基因,被广泛用作内参基因来检测目标基因在不同的组织器官、一定的发育阶段或胁迫的环境条件下的表达规律变化。这些管家基因并不是在所有生理条件下都能作为理想内参基因稳定表达。在基因表达转录分析中,大多数普遍使用的内参基因已不能满足准确定量的要求。基于统计学分析软件,如geNorm、BestKeeper和NormFinder三种分析软件,可以筛选出稳定性较好的内参基因。本文综述了内参基因的选择条件、方法及应用。     

三七鲨烯合酶基因在三七根、茎、芦头中的转录表达与三萜皂苷合成

三萜皂苷是三七、人参等重要药用植物的主要有效成分．采用改进的异硫氰酸胍法提取到三七RNA,经RT-PCR克隆技术获得三七三萜合成通路关键酶之一鲨烯合酶(squalene synthase, SS) cDNA,长1 270 bp,读码框架编码415个氨基酸．比对分析表明,推衍的三七SS氨基酸序列与人参、积雪草、青蒿、拟南芥和水稻SS的一致性分别为98%、89%、81%、78%和71%．利用实时荧光定量RT-PCR技术对三七根、茎、芦头的SS转录表达研究发现,一年生三七根SS基因转录表达量最高,高于茎和芦头的表达;但总皂苷含量是:芦头>叶>根>茎．可能与SS之后其它三萜合成关键酶的活性差异或/和三萜合成后的定向输送及累积有关．     

利用表达谱芯片数据筛选不同表达丰度的内参基因

目的基于表达谱芯片的检测结果,筛选多个内参基因,用于小家鼠肝脏组织中具有不同表达丰度基因的定量检测。方法应用表达谱芯片技术,完成小鼠肝脏组织的表达谱检测;依据基因表达丰度将基因分为3组,并进一步通过变异系数(coefficient of variation,CV)组内筛选候选内参基因;采用实时荧光定量PCR技术(realtime quantitative polymerase chain reaction,q PCR)和ge Norm软件确定内参基因。结果表达谱芯片成功采集超过60000个小鼠肝脏组织中转录本的表达量数据,并将之分为低、中、高3个组合。最终筛选了低表达Casp2和Lrrc14、中表达Nrd1和Trpc4ap、高表达Atp5a1和Clu,共6个内参基因。结论基于表达谱芯片数据筛选的6个内参基因,可适用于q PCR技术准确定量小家鼠肝组织转录组中不同表达丰度基因的表达量。     

糙皮侧耳热胁迫背景下RT-qPCR内参基因的筛选

通过文献报道和对糙皮侧耳基因组进行搜索,得到14个候选基因。以40℃热胁迫不同时间（0, 1,2, 4, 8, 12 h）的菌丝作为材料,通过反转录得到的候选基因片段,进行实时荧光定量PCR筛选,使用geNorm、NormFinder、BestKeeper 3种软件对结果进行分析,筛选得到稳定的内参基因β肌动蛋白（β-actin）、假定蛋白（sar1）。此外,选取2种热应激反应基因Hsp9、Hsp90作为靶基因,分别以筛选得到的稳定、不稳定基因以及多个内参基因作为内参进行分析,结果显示选用多个内参基因时能够缩小不同基因作为内参导致的结果差异。     

岩白菜实时荧光定量PCR分析的内参基因的筛选

本研究为筛选在岩白菜中稳定表达的内参基因,以用于岩白菜实时荧光定量PCR研究,以岩白菜的幼叶、成熟叶、叶柄、根、一年生根状茎和二年生根状茎为材料,采用实时荧光定量PCR技术比较了GAPDH、18S rRNA、β-actin、TUA、UBQ5和TUB等6个候选内参基因的表达情况,并经Ge Norm、Norm Finder和Best Keeper等3种软件分析,分析表明6个候选内参基因在岩白菜不同器官中的表达情况存在差异,其中GAPDH和18S rRNA的表达都较为稳定,可作为岩白菜实时荧光定量PCR分析的内参基因。     

人参植物皂苷生物合成相关新基因的筛选与鉴定

人参植物根进行的特定发育过程在药用次生物———人参皂苷生物合成和累积中发挥重要作用。为从人参根中分离出人参皂苷生物合成相关基因 ,采用抑制差减杂交技术 ,构建四年和一年生人参根组织mRNA群体间正向差减cDNA文库。对从差减文库中筛选的 4 0个阳性cDNA克隆进行酶切、PCR与逆向Northern斑点杂交鉴定、DNA测序以及核苷酸序列同源性比较。结果表明 ,获得的 6个差减克隆在GenBank/DDBJ/BMBL无对应的同源基因 ,代表新基因序列。与此同时 ,使用Northern印迹杂交验证及半定量RT PCR进一步确认 ,6个转录本为根发育阶段差异性表达基因。因而提示 ,它们可能在人参皂苷生物合成中发挥了重要作用。此外 ,在人参茎、叶与种子中亦能检测到上述基因转录本的表达。目前 ,6个新基因已被命名 ,在GenBank注册并获登录号 ,为克隆上述新基因cDNA全长序列及深入鉴定其在人参皂苷生物合成中的功能提供了重要实验依据。