拟南芥CKI1基因上游转录调控因子筛选及鉴定

拟南芥CKI1(cytokininindependent 1)是双组分信号系统中一个组氨酸激酶蛋白,通过作用于下游组氨酸磷酸转移蛋白激活双组分信号通路,在调控胚囊中央细胞命运分化和发育过程中具有重要作用。然而目前对于CKI1基因上游转录调控因子还知之甚少。本研究分析了不同长度的CKI1启动子在拟南芥胚囊中的活性,并利用酵母单杂交技术对CKI1上游转录调控因子进行了筛选和鉴定。结果表明,位于内含子区域中的F5/R2片段表现出与CKI1启动子全长相一致的表达活性。进一步选取3个串联重复的F5/R2片段用于构建诱饵表达载体,同时,选取拟南芥雌蕊构建cDNA文库,通过酵母单杂交筛选获得226个阳性克隆。去除低质量及冗余重复的序列后共获得66条可读序列,其中8条序列对应的基因编码具有DNA结合功能的蛋白。研究结果为进一步揭示CKI1基因的转录调控机制提供了重要参考信息。     

筛选G-box结合蛋白的酵母单杂交文库的构建

目的：筛选花青素合成中的关键基因查尔酮合成酶基因CHS启动子中G-box的结合蛋白,从而找到调节CHS表达的转录因子。方法：采用Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System,将CHS启动子G-box序列串联后整合入酵母染色体,构建诱饵菌株;采用SMART技术合成芜菁幼苗下胚轴cDNA,将该cDNA与pGADT7-Rec表达载体共同转化诱饵菌株,通过同源重组在酵母细胞内同步进行cDNA文库的构建和筛选;用酵母菌落PCR法获得阳性克隆中的cDNA插入片段,测序后在NCBI网站进行Blast分析。结果：共筛选了2.52×106个酵母克隆,得到94个阳性克隆,菌落PCR获得了长度为0.4~2.0 kb的cDNA插入片段,并通过Blast推测了其编码蛋白。结论：实验结果证明酵母单杂交文库构建成功,初步筛选获得了G-box结合蛋白的候选蛋白,为研究CHS的表达调控奠定了基础。     

早幼粒细胞白血病基因结构域诱饵载体的构建及鉴定

目的研究早幼粒细胞白血病基因（promyelocytic leukemia,PML）中含环指／B—BOX结构与含coiled—coil结构的两个结构域的功能,构建含其结构域序列的诱饵表达载体,为进一步应用酵母双杂交系统筛选与之相互作用的蛋白建立实验基础。方法PCR扩增PML的两个结构域序列,克隆人诱饵载体pG—BKT7中,经测序鉴定后,将诱饵载体转化到酵母细胞AH109中,检测诱饵蛋白有无毒性,渗漏和自激活作用,同时利用蛋白印迹法分析诱饵蛋白的表达。结果成功扩增了PML两个结构域的基因片段,并正确克隆入pGBKT7中。诱饵载体成功转化到酵母细胞AH109中,其中一个诱饵蛋白BD—PML—B无毒性,但具有渗漏和自激活作用,另一个诱饵蛋白BD—PML—C无毒性,渗漏和自激活作用,蛋白印迹法分析证实酵母细胞表达诱饵蛋白。结论含环指／B—BOX的结构域具有转录因子活性,全长PML的转录活性与之有关;成功构建了含coiled—coil结构的PML结合域的酵母诱饵表达载体,为运用酵母双杂交技术筛选与之作用的蛋白并探讨其功能奠定了基础。     

DREB1A类转录调控域中对转录激活功能起关键作用的氨基酸

从烟草品种k326中克隆到2个干旱应答元件结合蛋白类(DREB-Like)转录因子基因,命名为NtDREBI和NtDREB1A.序列分析发现,NtDREBI和NtDREB1A编码的蛋白质具有典型的AP2/EREBP转录因子家族EREBP亚族A类特征.酵母单杂交结果显示,NtDREBI具有激活功能, 而NtDREB1A不能激活下游基因,但可以与DRE元件结合.将NtDREBI、NtDREB1A与其它AP2/EREBP类转录因子序列比对,发现在C末端第148位氨基酸有显著差别.采用定点突变方法进一步研究表明,DREB1A类转录因子的第148位氨基酸残基与其邻近氨基酸残基的相互作用对调控转录激活功能起关键作用.     

脑心肌炎病毒VP1蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及验证

为筛选与脑心肌炎病毒VP1蛋白相互作用的靶细胞cDNA文库蛋白,构建VP1蛋白的诱饵载体pDHB1-VP1。扩增EMCV的VP1基因并克隆至pMD18-T载体中,经测序验证正确后定向克隆至酵母双杂交诱饵载体pDHB1。将重组pDHB1-VP1载体进行酶切验证和测序分析,并转化酵母报告菌株NMY51,检测其在酵母细胞中有无表达和自激活作用。结果表明,构建的p DHB1-VP1基因可以在酵母细胞中正确表达,产物大小约66 kD,而且可以与兔抗EMCV血清发生特异性结合,有较好免疫原性。成功构建了诱饵载体pDHB1-VP1,可以在酵母细胞中表达且其对报告基因无自激活作用,可以应用于酵母双杂交筛选试验中。     

盐穗木转录因子HcSCL13转录激活的体外鉴定及植物表达载体的构建

通过同源重组的方法将盐穗木盐响应GRAS家族转录因子HcSCL13基因(GenBank登录号:KC68640)构建至酵母双杂交诱饵表达载体pGBKT7上,转化酵母菌Y2HGold,通过自激活性和毒性检测确定该转录因子的体外激活能力。试验表明,重组菌株pGBKT7-HcSCL13/Y2HGold对宿主菌无毒性,且该菌株表达的融合蛋白能够激活报告基因的表达,说明HcSCL13具有转录激活域,是一类转录因子。成功构建了HcSCL13基因的植物表达载体和亚细胞定位表达载体,为进一步在体内研究该基因的耐盐功能奠定了基础。     

人类RhoxF1蛋白的生物信息学分析及其自激活检测

目的：生物信息学分析人类RhoxF1蛋白的氨基酸序列,构建RhoxF1酵母双杂交诱饵载体,并检测其自激活活性。方法：生物信息学分析RhoxF1蛋白保守区域,比较小鼠Rhox5与人RhoxF1的氨基酸序列同源性,PCR扩增RhoxF1基因,与PMD-18-T载体连接,然后把RhoxF1克隆到pGBKT7载体中,醋酸锂法将重组质粒pGBKT7-RhoxF1转入酵母菌AH109,观察pG-BKT7-RhoxF1在AH109中的表达情况,检测诱饵载体有无毒性和自激活作用。结果：RhoxF1蛋白保守区域有大量的DNA结合位点,与Rhox5具有30%的同源性。成功构建诱饵载体pGBKT7-RhoxF1,目的片段可在酵母AH109中表达,并且对酵母菌无毒性,对报告基因无自激活功能。结论：探索了RhoxF1的蛋白特性,成功构建pGBKT7-RhoxF1重组质粒,可以作为酵母双杂交诱饵载体筛选与RhoxF1相互作用的蛋白,进而对其进行功能性研究。     

利用酵母双杂交系统筛选水稻组蛋白去乙酰化酶HDA705的互作蛋白

为了解水稻(Oryza sativa)组蛋白去乙酰化酶HDA705的生物学功能,构建了HDA705酵母双杂交诱饵表达载体与双杂交文库,并筛选了与HDA705相互作用的蛋白。结果表明,HDA705的诱饵载体无自激活活性且对酵母无毒性作用,文库的滴度也适合常规的酵母双杂交文库筛选。通过对酵母双杂交文库的筛选,共获得了164个阳性克隆,经DNA测序分析,这些克隆编码47个可能与HDA705相互作用的蛋白,其中包括3个在逆境响应或激素信号转导过程中起到重要作用的(辅)转录因子、6个参与光合作用的叶绿体蛋白、1个含有R3H结构域的蛋白以及22种酶类等。这为进一步研究HDA705的生物学功能提供了重要的线索。     

水稻转录因子OsBP-73靶基因的初步筛选

OsBP-73是用酵母单杂交系统,以水稻蜡质基因(Wx)的顺式作用元件为诱饵,从水稻cDNA表达文库中筛选获得的转录因子。本文以OsBP-73基因为例介绍了用"下拉"(pull-down)方法筛选转录因子靶基因的一般步骤。将含有该基因DNA结合功能域的cDNA片段构建到原核表达载体上,并在大肠杆菌中诱导表达获得其蛋白p73。用纯化后的p73蛋白通过"下拉"实验对OsBP-73靶基因进行初步筛选,获得了22个阳性克隆,为进一步研究转录因子OsBP-73参与的水稻转录调控网络提供依据。     

酵母双杂交筛选心脏cDNA文库中与人热激蛋白70相互作用的蛋白质

目的:利用酵母双杂交系统从人心肌cDNA文库中筛选与热激蛋白70(HSP70)相互作用的蛋白质。方法:从人心脏cDNA文库扩增Hsp70基因,克隆于pGBKT7载体上,酶切鉴定及序列分析,并检测pGBKT7-Hsp70酵母细胞AH109中的自激活活性;将构建的酵母表达诱饵质粒载体pGBKT7-Hsp70转化AH109酵母细胞,与转化有人心脏cDNA文库的酵母Yl87进行交配实验,筛选与HSP70相互作用的蛋白质,通过一对一的回复杂交实验排除假阳性,对阳性克隆进行序列测定和生物信息学分析。结果:构建了"诱饵"质粒栽体pGBKT7-Hsp70,并证明其在酵母双杂交系统中无自激活活性,筛选得到多个与Hsp70相互作用的阳性转化子,并最终得到HSP70的1个相互作用蛋白质HIP。结论:应用酵母双杂交系统筛选出与HSP70相互作用的1个蛋白质,它们的相互作用可能与HSP70发挥细胞分子伴侣作用有关。     

利用酵母双杂交筛选与丹参R2R3-MYB类转录因子SmPAP1互作的蛋白

根据NCBI数据库公布的R2R3-MYB类转录因子Sm PAP1基因序列(Gen Bank登录号GU218694.2),构建丹参Sm PAP1的酵母双杂交诱饵表达载体p GBKT7-Sm PAP1,检测p GBKT7-Sm PAP1的自激活活性及其对酵母AH109细胞的毒性。以Sm PAP1为诱饵筛选构建到p GADK7中的丹参c DNA文库,挑取阳性克隆进行测序,并在NCBI数据库中进行BLAST比对分析。利用Uniprot在线网站,对筛选到的60个基因进行了功能注释。对其中4个候选互作蛋白,包括病程相关类蛋白AP2/ERF,氧化还原酶类蛋白Sm C4H,逆境胁迫相关类蛋白Sm WRKY及b HLH转录因子类蛋白Sm MYC2进行回转验证实验。通过酵母双杂交实验,确定Sm PAP1与AP2/ERF类、Sm C4H、Sm WRKY及Sm MYC2相互作用。这些数据为深入探究Sm PAP1调控丹参中酚酸类化合物合成的分子机理提供了参考。     

VSV糖蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用的检测

构建水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)酵母双杂交诱饵载体,检测其在酵母细胞中的表达和自激活作用,为进一步研究酵母双杂交系统筛选与VSV-G相互作用蛋白奠定基础。通过RT-PCR方法从水泡性口炎病毒(VSV)克隆糖蛋白(G)基因,BamH I和Sal I双酶切后连接诱饵载体pSos,获得诱饵质粒pSos-VSV-G,经测序鉴定后pSos-VSV-G转化到酵母菌株cdcH25(α),在营养缺陷培养基中观察pSos-VSV-G的自激活作用和毒性作用,同时利用蛋白印迹法分析诱饵蛋白的表达。成功扩增VSV-G基因,并准确克隆入pSos中,诱饵载体pSos-VSV-G成功转化到酵母菌株cdcH25(α)中,经表型筛选检测无自激活作用和毒性作用,蛋白印迹法检测证实pSos-VSV-G在酵母细胞中表达诱饵蛋白。可以利用酵母双杂交系统筛选与VSV-G相互作的蛋白质。     

利用酵母双杂交技术筛选与生殖支原体黏附蛋白(MgPa)相互作用的宿主蛋白

从利用基于分离的泛素介导膜蛋白酵母双杂交系统构建的人尿道上皮细胞cDNA文库中筛选生殖支原体(Mg)黏附蛋白(MgPa)的互作蛋白。以pET30a-MgPa为模板,经PCR扩增MgPa基因,将其分别连接到pBT3STE和pBT3SUC载体以构建诱饵质粒pBT3STE-MgPa和pBT3SUC-MgPa;将诱饵质粒分别转化到酵母菌株NMY32内,检测其毒性和自激活活性;将人尿道上皮细胞cDNA文库质粒pPR3-N-207-Zeng转入到含pBT3SUC-MgPa诱饵质粒的酵母菌株中,筛选阳性克隆。检测阳性克隆LacZ报告基因的活性。提取阳性克隆质粒进行DNA测序与BLAST分析。结果显示,成功构建的诱饵质粒pBT3STE-MgPa和pBT3SUC-MgPa两者都没有自激活功能,且pBT3SUC-MgPa的活性强于pBT3STE-MgPa。用pBT3SUC-MgPa转化NMY32酵母作为受体酵母细胞。经DNA测序与BLAST分析结果表明筛选到的28个阳性克隆归属于23个不同的蛋白。从利用分离的泛素介导膜蛋白酵母双杂交系统构建的人尿道上皮细胞cDNA文库中筛选到23个与MgPa相互作用的蛋白,为阐明MgPa的功能及Mg可能的致病机制提供参考。     

DEV-NP基因酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活检测

为构建鸭肠炎病毒(DEV)核衣壳蛋白(NP)基因酵母双杂交诱饵载体,采用PCR技术扩增出DEV-NP基因,克隆至酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7中,以PCR检测、限制性酶切和序列测定等方法进行鉴定;然后采用PEG/LiA.法将阳性质粒pGBKT7-NP转化酵母Y2HGold,在不同营养缺失型培养基进行自激活检测,结果显示,经PCR检测和EcoR I/BamH I双酶切,可见到与预期相一致的目的片段;测序表明该片段含DEV NP基因全部序列;转化Y2HGold酵母菌后,在SD/-Trp/X-a-Gal 固体培养基上长出蓝色菌落,而在SD/-Trp/X-a-GaUAbA固体培养基上未见有菌落生长.无自激活作用的诱饵载体pGBKT7NP的成功构建,为DEV NP宿主结合蛋白的筛选莫定了基础.     

鲤疱疹病毒II型ORF25B编码蛋白诱饵载体的构建及其互作蛋白的筛选

【目的】鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)感染养殖鲫引起的鲫造血器官坏死病,给鲫养殖业造成了重大的经济损失。揭示CyHV-2感染宿主细胞的机制,是建立鲫造血器官坏死病有效防治技术的重要基础。【方法】本研究针对CyHV-2富含抗原表位的ORF25B区域设计引物,扩增ORF25B基因截短序列。将扩增产物克隆至酵母双杂交诱饵载体pGBKT7,构建诱饵载体pGBKT7-tORF25B,转化至酵母菌株Y2HGold中。在营养缺陷型培养基上,验证诱饵表达载体pGBKT7-tORF25B对酵母菌Y2HGold自激活现象和毒性作用。利用酵母双杂交技术,将诱饵菌株pGBKT7-tORF25B/Y2HGold与鲫脑组织细胞系(GiCB)cDNA文库杂交。【结果】ORF25B基因截短序列扩增大小约为981 bp,成功构建了诱饵菌株pGBKT7-tORF25B/Y2H Gold,自激活和毒性验证结果表明,诱饵表达载体对酵母菌株无自激活现象,也无毒性作用,初步筛选出4种与tORF25B基因编码蛋白互作的宿主蛋白。【结论】本研究结果为深入开展CyHV-2 ORF25B编码蛋白功能及病毒入侵宿主细胞的机制研究奠定了重要基础。     

马铃薯Y病毒P3N-PIPO酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

P3N-PIPO是马铃薯Y病毒属(Potyvirus)病毒基因组中近年来新鉴定的编码蛋白。为研究P3N-PIPO在病毒与宿主互作过程中的功能,本研究以马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)和马铃薯作为研究系统,用融合PCR技术扩增得到PVY编码蛋白P3N-PIPO的DNA序列,用于构建酵母双杂交诱饵质粒。为钓取马铃薯组织细胞内不同位置的互作蛋白,本研究构建了p BT3-N-P3N-PIPO、p BT3-C-P3N-PIPO、p BT3-STE-P3N-PIPO、p BT3-SUC-P3N-PIPO和p DHB1-P3N-PIPO 5个诱饵质粒,并进行自激活或毒性检测,最终获得p BT3-STE-P3N-PIPO、p BT3-SUC-P3N-PIPO和p DHB1-P3N-PIPO 3个可用于筛选马铃薯c DNA文库的诱饵质粒。     

大鼠SCN5A基因内含子1＋204bp～＋757bp转录调控功能分析

目的 克隆大鼠心肌SCN5A基因5’端调控区,检测目的片段在HEK293细胞中的转录活性。方法 扩增大鼠心肌SCN5A基因＋204bp-＋757bp、＋204bp-＋385bp和＋204bp-＋329bp片段,构建含目的片段的荧光素酶报告基因——pGL3-P0、pGL3-P1和pGL3-P2,比较HEK293细胞中荧光素酶活性,评价不同长度DNA片段的转录调控活性。结果 成功构建大鼠心肌SCN5A基因5’端3个片断的荧光素酶报告基因,HEK293细胞中pGL3-P1相对荧光素酶活性分别为pGL3-PO、pGL3-P2的4．3倍和2．8倍。结论SCN5A基因内含子1目的片段在HEK293细胞中具有较强的转录调控活性;SCN5A基因＋329bp～＋385bp为正调控区,软件分析MZF1、USF、C-ETs-1等因子能与这些正调控区域结合并可能参与SCN5A基因的表达调控。     

盐碱胁迫诱导的猴樟酵母cDNA文库构建及CbP5CS上游调控因子筛选

盐碱土壤环境是限制猴樟引种推广的主要因素，脯氨酸是植物适应盐碱胁迫过程中主要的渗透调节物质，筛选并鉴定出调控脯氨酸合成的转录因子对于猴樟耐盐碱分子机理研究具有重要意义。以猴樟实生苗为材料，在水培培养基础上，采用0 mmol/L和10 mmol/L的Na₂CO₃溶液分别进行处理，选取处理6 h、48 h的根系组织，提取总RNA，构建盐碱胁迫诱导的猴樟根系酵母c DNA文库；以猴樟根系总DNA为模板，克隆CbP5CS启动子序列，采用Y1H酵母单杂交技术筛选出与CbP5CS启动子存在互作的蛋白，并通过高通量测序技术鉴定出调控猴樟脯氨酸合成的转录因子。结果表明，所构建的cDNA文库库容为4.88×10⁷CFU/mL，总克隆数为9.76×10⁷ CFU，文库插入片段平均长度在1 000 bp左右，cDNA片段重组率为100%，符合酵母杂交试验的要求。克隆出的CbP5CS启动子序列长2 012 bp，成功构建出诱饵质粒pHIS2-CbP5CS，利用共转化方法从文库中筛选到31个与CbP5CS互作的EST序列。经...     

利用酵母双杂交技术筛选与AtbZIP1相互作用的蛋白质

碱性亮氨酸拉链bZIP类转录因子在植物的生长发育、光形态建成、光信号传导及非生物胁迫反应中发挥重要的作用.为研究AtbZIP1基因的作用机理,本研究首先验证了该基因的自激活转录活性,通过缺失突变确定了该转录因子的转录激活结构域;以AtbZIP1缺失突变体AtbZ3为诱饵蛋白,采用Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System(Clonetch),共筛选获得5个与诱饵蛋白相互作用的蛋白质;并通过AbA(Aureobasidin A)抗生素标记基因,His营养缺陷和LacZ蓝白斑检测验证了阳性克隆.亚细胞定位分析发现,AtbZIP1蛋白除了定位于细胞核外,还定位于叶绿体细胞.通过分析这些靶蛋白的已知功能,为研究AtbZIP1蛋白的未知生物学功能提供重要信息.     

抗增殖蛋白在酵母双杂交系统中转录激活作用的检测

目的:检测抗增殖蛋白在酵母双杂交系统中是否具有转录自激活作用。方法:采用PCR方法扩增抗增殖蛋白基因全长序列,构建酵母双杂交系统的诱饵载体pGBKT7-PHB,制备酵母菌AH109感受态细胞,将pGBKT7-PHB转化感受态酵母菌AH109后培养于含缺失培养基的平板上,检测β-半乳糖苷酶活性,判定其是否具有转录自激活作用。结果:扩增出抗增殖蛋白基因全长序列,构建了诱饵载体pGBKT7-PHB,转化酵母菌AH109后在双缺和三缺培养基上未能使β-半乳糖苷酶活性滤纸片变蓝,说明报告基因未被激活。结论:抗增殖蛋白没有转录自激活作用,可用于酵母双杂交系统。