基于RNA-Seq数据识别果蝇剪接位点和可变剪接事件

完整基因结构的预测是当前生命科学研究的一个重要基础课题,其中一个关键环节是剪接位点和各种可变剪接事件的精确识别.基于转录组测序（RNA-seq）数据,识别剪接位点和可变剪接事件是近几年随着新一代测序技术发展起来的新技术策略和方法.本工作基于黑腹果蝇睾丸RNA-seq数据,使用TopHat软件成功识别出39718个果蝇剪接位点,其中有10584个新剪接位点.同时,基于剪接位点的不同组合,针对各类型可变剪接特征开发出计算识别算法,成功识别了8477个可变剪接事件（其中新识别的可变剪接事件3922个）,包括可变供体位点、可变受体位点、内含子保留和外显子缺失4种类型.RT-PCR实验验证了2个果蝇基因上新识别的可变剪接事件,发现了全新的剪接异构体.进一步表明,RNA-seq数据可有效应用于识别剪接位点和可变剪接事件,为深入揭示剪接机制及可变剪接生物学功能提供新思路和新手段.     

环状RNA作为生物标志物的研究进展

环状RNA(circRNA)是一种共价闭合环状结构的非编码RNA,与线性RNA有显著差别。circRNA通过外显子或内含子的反向剪接进而环化形成完整的环形结构。近年研究已证实circRNA在基因的表达调控和肿瘤等疾病的发生和发展中发挥着重要作用,提示circRNA可能具有巨大的临床诊疗价值。就circRNA的形成、特征、功能,特别是其作为肿瘤生物标志物的研究进展做简要综述。     

植物环状RNA研究进展北大核心CSCD

随着高通量测序技术的发展,环状RNA (circular RNA, circRNA)逐渐成为非编码RNA研究领域的热点。CircRNA是由3′端下游供体和5′端上游受体经反向剪接形成的共价闭合环状分子,普遍存在于真核生物中。CircRNA过去被认为是错误剪接的副产物,近年来相关研究爆炸式增长,才将这种错误概念推翻。相较于动物中的大量研究,植物circRNA的研究还处于起步阶段。文中从植物circRNA的发现引入,总结了植物circRNA的环化特征、表达特异性、保守性和稳定性等特征;关注了circRNA的鉴定工具、主要类型和生成机制;归纳了植物circRNA作为microRNA(miRNA)海绵和翻译模板的潜在功能,以及在生物/非生物胁迫应答中的重要作用;简单概括了植物circRNA的降解与定位。最后讨论了植物circRNA研究存在的问题并对进一步开展植物circRNA研究进行了展望。     

黑曲霉木质纤维素降解酶基因的可变剪接分析及验证

黑曲霉Aspergillus niger因能够产生大量的木质纤维素降解酶而在木质纤维素资源利用中发挥重要作用。目前,有关黑曲霉基因组中与木质纤维素降解相关的基因是否存在可变剪接的情况尚不清楚。本研究以黑曲霉CBS513.88菌株为研究对象,采用rMATS和ABLas两种方法对黑曲霉在葡萄糖为唯一碳源(G组)和小麦秸秆为唯一碳源(WS组)下的56个木质纤维素降解酶基因的可变剪接事件进行分析,并通过RT-PCR扩增和内含子特异性扩增对3个典型基因的可变剪接体进行了验证。结果表明,ABLas可变剪接分析算法相较于rMATS分析算法更为准确,ABLas分析算法显示G组和WS组共有21个木质纤维素降解酶基因出现了可变剪接,可变剪接类型以内含子保留(IR)为主,占所有可变剪接事件的82.85%。另外,G组和WS组发生可变剪接的木质纤维素降解酶基因也有所不同：G组发生可变剪接的基因为13个,WS组发生可变剪接的基因为14个,两组都发生可变剪接的基因为6个,这表明黑曲霉木质纤维素降解酶基因的可变剪接在不同生长条件下存在差异,另一方面,黑曲霉中众多可变剪接体的存在也为开发新型的木质纤维素降解酶资源提供基础。     

环状RNA计算预测方法的研究进展

环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类具有重要生物作用的内源性RNA,大多在可变剪接过程中通过5'端和3'端反向共价连接形成闭合环状结构.目前,环状RNA的识别策略主要分为两大类:一类方法从高通量测序(RNA-seq)数据中检测反向剪接位点,另一类直接从RNA序列中检测成环特征.由于数据本身和识别...     

可变剪接与蛋白质结构多样性

研究可变剪接和蛋白质结构多样性之间的相关性,对于理解可变剪接的功能具有重要意义。已有研究支持可变剪接增加蛋白质结构多样性的观点,但可变剪接影响蛋白质结构的程度、机制等还尚未阐明。作者基于具有确定三维结构的可变剪接蛋白质变体数据,从蛋白质结构差异和结构稳定性两个方面对致病和非致病的可变剪接蛋白质变体对进行了比较分析;通过建立实际可变剪接变体集和随机可变剪接变体集,并定义蛋白质的多样性增量(increment of diversity,ID)和疏水非均一性(hydrophobic non-uniformity,HI),研究了可变剪接发生的非随机性。结果表明:现有的多数可变剪接事件与随机剪接相比,倾向于增加蛋白质结构多样性;产生结构差异较大蛋白质的可变剪接事件倾向于导致疾病的发生。作者还提出了正负选择压力的动态平衡假说解释这一现象,认为与生命活动相联系的正选择压力促使增加蛋白质结构多样性的可变剪接事件在群体中固定,但反向的负选择压力约束着可变剪接改变蛋白质结构的尺度,细胞中现有的可变剪接正是这两种正负选择压力之间保持动态平衡的结果。     

利用RT-PCR技术验证基于小鼠外显子芯片发现的缺血相关基因的表达

目的:利用RT-PCR技术验证并确认基于小鼠外显子芯片发现的部分缺血相关基因的表达,以鉴定候选基因的外显子是否发生可变剪接,从而实现对外显子芯片结果的鉴定。方法:根据生物信息学分析结果,选取小鼠外显子芯片中的3个基因(Ube3c,6330439K17Rik,Atp7a),在预测发生可变剪接的外显子两侧设计上下游引物,PCR后进行凝胶回收,再克隆到载体中进行测序。结果:RT-PCR及测序结果表明,Ube3c基因在6号外显子、6330439K17Rik基因在12号外显子、Atp7a基因在3号外显子发生可变剪接,与芯片预测结果一致。结论:RT-PCR技术可针对外显子芯片的结果进行可靠性验证,为可变剪接基因表达研究提供了一种有效手段。     

真菌基因可变剪接可视化分析的新方法:ZOOM软件的应用扩展（英文）

可变剪接是引起蛋白多样性的主要机制之一,而转录组reads的重新定位是获取可变剪接位点的有效方法,适合在基因组较小的真菌中应用。ZOOM软件是一款可在window系统下运行的reads可视化定位软件,被广泛用于下一代基因组测序(NGS)的reads定位及单碱基多态性位点(SNP)的发掘。本文发现该软件分析可变剪接的新用途,并以禾谷镰刀菌Fusarium graminearum的4个基因为例详细描述该方法在真菌可变剪接位点识别中的应用,这些结果均获得RT-PCR的验证。     

半定量RT-PCR检测跳跃型可变剪接外显子保留率的方法

可变剪接是基因表达调控和蛋白质多样性和复杂性的重要调节机制。多发性神经纤维瘤Ⅰ型(NF1)基因的外显子23a发生外显子跳跃型可变剪接会产生两种功能差异较大的蛋白质异构体。发展一种灵敏、简捷及特异性高的外显子保留率检测方法是研究外显子跳跃型可变剪接机制过程中最基本的实验手段。本研究分别提取了大鼠肺组织及转染含有NF1外显子23a重组质粒的He La细胞的总RNA,以荧光分子Cy3标记PCR引物,采用19个循环的半定量RT-PCR的方法检测外显子23a可变剪接的保留率。实验结果显示,半定量RT-PCR可以灵敏简捷地检测NF1外显子23a可变剪接的模式,利用Cy3荧光标记的信号值计算大鼠肺组织中外显子23a的剪接保留率为(62.38±2.80)%,转染的HeLa细胞中为(75.51±2.25)%。该工作结合荧光标记和半定量RT-PCR的实验方法,为NF1等多外显子基因可变剪接外显子保留率的检测提供了有效的实验方法,有助于可变剪接调控机理的进一步研究。     

环状RNA研究进展

环状RNA(circRNA)是一类内源性非编码RNA(Non-coding RNA;ncRNA),与传统线性RNA不同,它是由反向剪接形成的、没有5'端帽子和3'端多聚腺苷酸尾巴的环状闭合结构。起初人们认为circRNA是错误剪接或者低丰度mRNA转录过程中的副产物,但随着高通量测序技术和生物信息学的发展,越来越多的circRNA已被发现和鉴定。circRNA在哺乳动物细胞中具有内生、丰富、保守、稳定、组织特异性、时空特异性等特点,且亚细胞定位存在差异。大量研究发现它可以通过多种机制参与动物生长发育调控,疾病等的发生和发展。综述了circRNA的发现与形成、特征、作用机制、研究方法及与疾病相关的研究进展,以期为circRNA的进一步研究提供参考。     

基于RNA-seq测序数据鉴定和分析猪基因组可变剪接事件

可变剪接作为一种增加基因组和蛋白质组多样性的重要机制,广泛发生于真核生物基因转录的过程中.本文采用Illumina Hiseq 2500测序平台对猪睾丸组织4个不同发育时期(60胚龄、90胚龄、30日龄和180日龄)进行转录组测序,以猪基因组数据为参考,鉴定和分析了猪基因组可变剪接事件.从猪基因组中鉴定出20398个基因(80.6%)对应的92738个可变剪接事件.在不同的可变剪接类型中,以第一个外显子可变剪切(alternative 5′first exon,TSS)、最后一个外显子可变剪切(alternative 3′last exon,TTS)、单外显子跳跃(skipped exon,SKIP)和可变5′或3′端剪切(alternative exon ends,AE)4种类型为主,分别占所有可变剪接事件的41.0%,32.9%,7.6%和7.4%.GO功能富集分析显示,发生可变剪接的基因主要富集于物质合成、物质结合及酶活性相关的GO项中,而各发育时期特异的可变剪接基因与发育时期的生理状态密切相关,60胚龄时主要与酶活性和组织形成相关,30日龄时主要与抗环境应激和离子通道活性相关,180日龄时则主要与循环系统相关.此外,在筛选出64个与睾丸素代谢相关的基因中,63个基因发生可变剪接,且以TSS和TTS为主,表明这两种可变剪接类型与睾丸素合成和分泌密切相关.通过对猪基因组可变剪接的分析,为深入研究可变剪接生物学功能及进一步开展分子育种工作提供理论依据.     

基于PCR 技术的人脑基因可变剪接差异性研究

目的:对人脑的基因可变剪接位点差异性进行分析。方法:通过RNA-Seq得到的转录组数据,分析推测出在不同年龄的7对样本的大脑前额叶皮层(prefrontal cortex,PFC)表达的某些基因具有可变剪接位点的差异性;为验证此推测,设计7对引物,提取不同年龄样本的RNA,通过反转录合成cDNA,采用PCR技术扩增目的序列。结果:在已剪接和(或)未剪接产物预期片段处有明显的条带。结论:通过Quantity One软件分析后,确定在不同年龄间存在可变剪接差异。基于PCR技术的基因可变剪接分析对RNA-seq数据集的预测结果进行验证是一种有效新颖的PCR新应用。     

条纹斑竹鲨肝脏环形RNA的筛选、鉴定及功能分析北大核心CSCD

为筛选和验证条纹斑竹鲨肝脏中环形RNA(circRNA)及探究其在肝癌细胞HepG2中过表达对肝癌细胞增殖、迁移能力的影响,本研究主要进行了两项实验:对条纹斑竹鲨肝脏circRNA进行高通量测序和预测,随后设计正、反向引物验证其真实性;构建circRNA过表达载体,将其瞬时转染进肝癌细胞HepG2,进行CCK-8和划痕实验来评价其对肝癌细胞增殖和迁移能力的影响。结果显示:预测到有4558条circRNAs,并确认了14条circRNAs的真实性;qRT-PCR实验表明在肝癌细胞HepG2中能瞬时过表达circRNA 13-566、circRNA 4-475、circRNA 5-402、circRNA 294-177、circRNA 30-219;且CCK-8和划痕实验显示,这5条circRNAs过表达后,均能不同程度地抑制肝癌细胞的增殖和迁移能力,其中circRNA 4-475、circRNA 294-177作用尤为显著。上述结果为深入研究条纹斑竹鲨肝脏中circRNA及其在肝再生、肝癌治疗方面的功能提供了新思路和基础。     

基于加权网络的卵巢癌可变剪接预后特征分析

可变剪接作为转录调节的调控机制,对肿瘤的治疗和预后具有重要意义。本文对卵巢癌预后相关的可变剪接事件进行了系统分析,以挖掘可变剪接在卵巢癌中的预后价值。首先,从TCGASpliceSeq数据库中下载卵巢癌患者数据,运用单因素Cox回归分析筛选得到290个与预后相关的剪接事件(prognostic-associated alternative splicing events, PASEs);其次,融合PASEs对应基因的蛋白质相互作用(protein-protein interaction, PPI)数据构建卵巢癌预后加权网络,同时对网络进行拓扑分析,对PASEs对应基因进行功能富集分析;最后,根据网络中节点的度选出前20个可变剪接事件作为预后特征,利用Cox比例风险模型建立卵巢癌预后预测模型。结果显示,这些可变剪接事件作为预后特征可以较好地预测卵巢癌患者的预后情况,可作为潜在的卵巢癌预后生物标志物。     

草菇exo-β-1,3-葡聚糖酶基因可变剪接体的克隆与表达分析

可变剪接是基因表达调控的一种重要方式。本研究利用RT-PCR克隆鉴定到草菇exo-β-1,3-葡聚糖酶基因(exg2)的4种可变剪接体(exg2V1,exg2V2,exg2V3和exg2V4),其中,exg2V1第7个内含子保留;exg2V2第11个内含子保留同时剪切掉第12个外显子的后58bp;exg2V3同时保留第7个和第17个内含子;exg2V4同时保留第2、第9和第17个内含子。4种剪接体均在可变剪接位点提前出现终止密码子,导致预测编码的氨基酸序列中包含不完整的结构域。定量PCR结果显示:草菇5个发育时期中,4种可变剪接体表达量均比标准剪接体exg2低,但4种可变剪接体的表达也表现出一定的时期和组织差异性。初步推断发现的草菇exg2基因4种可变剪接体均为无义介导的mRNA降解,通过此方式达到对exg2基因标准剪接转录本的精准调控。     

环状RNA在抑郁症中的研究进展

环状RNA (circular RNA,circRNA)是一类通过非经典方式反向剪接形成的环状非编码RNA,在生物体内表达丰富,具有高度保守性、组织发育阶段特异性,且较线性RNA更稳定,可发挥基因表观调控、细胞通信、蛋白质翻译等多种生物功能.近来研究表明,在抑郁症模型动物研究中,circRNA能够影响星形胶质细胞、小胶...     

环状RNA在胃癌与结直肠癌中的功能和作为临床标志物的潜力

环状RNA（circRNA）是一种广泛存在于生物体内的新型内源性RNA。CircRNA由RNA前体可变剪接产生,比线性RNA有更好的稳定性,是最近几年RNA领域的明星分子。CircRNA来源于内含子或外显子,可充当miRNA海绵或者结合蛋白质来参与基因表达调控,甚至已发现有circRNA能编码蛋白质。越来越多的研究表明,circRNA在肿瘤（如：食管癌、肝癌、胃癌、结直肠癌和膀胱癌等）的发生发展中发挥了重要作用。近年来,circRNA在胃癌、结直肠癌的研究逐渐增加,circRNA可能成为新的生物学标志物发挥诊断和预后的作用。本文将主要介绍circRNA 在胃癌及结直肠癌的功能和作为临床标志物的研究进展。     

circRNA在病毒感染及相关疾病诊断中的研究进展

环状RNA(circular RNA,circRNA)是一种新型非编码RNA,由mRNA在转录后加工过程中反向剪接形成。不同于线性RNA,circRNA是以共价键连接形成的闭合环状结构,缺少5?末端帽子和3?末端poly(A)尾巴结构。circRNA可作为miRNA(microRNA)的分子海绵,也可在细胞发生过程中发挥多种功能。此外,circRNA在机体免疫调控过程中也扮演了重要角色,参与了多种疾病的发生发展,因此对circRNA的深入探索可为治疗人类疾病提供重要的理论依据。该文就circRNA的生物合成、分类和功能作综述,重点讨论circRNA对病毒感染的调控机制以及circRNA作为病毒检测标记物和药物靶点的研究进展,从而为病毒性疾病的诊断提供新的参考依据和方向。     

细胞信号转导与可变剪接调控

大多数真核基因能够发生可变剪接,其调控对于生理和病理状态下细胞功能的实现至关重要,而异常可变剪接则可导致多种疾病。虽然已知可变剪接能够在转录后水平调节基因表达,然而目前仍不清楚特定的可变剪接模式是如何被调控的。越来越多的研究发现细胞信号和外界环境刺激能够调控靶基因的剪接模式,并且已发现一些与可变剪接调控有关的信号转导通路,而后者能够通过修饰剪接因子进而改变剪接因子的亚细胞定位或者活性,从而实现对靶基因可变剪接模式的调控。由细胞信号转导通路所构成的网络能够灵活多样地调控基因剪接,一条信号通路可调控多个基因剪接,而多条信号通路也可调控同一基因剪接,对于理解信号转导过程的分子机制具有重要意义。     

人免疫球蛋白重链可变区基因引物设计方法的改良

针对抗体胚系基因数据库的数据不断更新和完善,为获得人全部免疫球蛋白(Ig)重链可变区基因,改进引物设计方法,自主设计针对可变区基因高度保守的框架区1(FR1)和框架区4(FR4)的引物,提取未经免疫的健康人外周血单个核细胞,通过RT-PCR扩增重链可变区基因.其DNA序列与GenBank数据库和IMGT/V-QUEST软件比对,序列分析符合人免疫球蛋白重链基本框架结构,为胚系基因重排产生的序列.多个克隆的测序结果对比分析显示了良好的多样性.获得的重链序列为研制基因工程抗体及构建噬菌体抗体库奠定了物质基础,也为扩增其他物种Ig可变区基因的引物提供新的设计思路.