产L-天冬氨酸α-脱羧酶细菌的分离、鉴定及发酵条件优化

【目的】从葡萄园土壤中分离L-天冬氨酸α-脱羧酶的产生菌株,对其进行分类鉴定,优化其产生L-天冬氨酸α-脱羧酶的发酵条件,为β-丙氨酸的生物合成提供基础。【方法】采用变色圈法和液体复筛培养基分离筛选具有L-天冬氨酸α-脱羧酶活力的菌株,对菌株进行形态、生理生化特征试验及16S r RNA序列同源性分析鉴定菌株的系统发育学地位,采用单因素及正交设计试验优化培养基及发酵条件。【结果】筛选到一株L-天冬氨酸α-脱羧酶高产菌株Pan D37,其亲缘关系和特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)较近,且形态与培养特征、生理生化特性与特基拉芽孢杆菌基本相符。研究表明其最佳发酵配方和培养条件为:蔗糖22.5 g/L、富马酸7.5 g/L、蛋白胨20 g/L、L-天冬氨酸6 g/L、Triton X-100 2g/L,起始p H为7.0,装液量50 m L/500 m L,摇床转速220 r/min,种子液接种量为5%(V/V),35°C培养28h。在最优条件下L-天冬氨酸α-脱羧酶活力可达44.57 U/m L,比初筛时提高2.57倍。【结论】分离并获得一株特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)Pan D37,经条件优化后具有较高的L-天冬氨酸α-脱羧酶产生能力,有望应用于β-丙氨酸的工业生产。     

谷氨酸棒杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶在大肠杆菌中的表达及酶转化生产β-丙氨酸

【目的】克隆谷氨酸棒杆菌来源L-天冬氨酸α-脱羧酶基因, 实现其在大肠杆菌中的异源表达, 并进行酶转化L-天冬氨酸合成β-丙氨酸的研究。【方法】PCR扩增谷氨酸棒杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶基因pand, 构建表达载体pET24a(+)-Pand, 转化宿主菌大肠杆菌BL21(DE3), 对重组菌进行诱导表达, 表达产物经DEAE离子交换层析和G-75 分子筛层析纯化后进行酶学性质研究, 然后进行酶转化实验, 说明底物和产物对酶转化的影响。【结果】重组菌SDS-PAGE分析表明Pand表达量可达菌体总蛋白的50%以上, AccQ·Tag法检测酶活达到94.16 U/mL。该重组酶最适反应温度为55 °C, 在低于37 °C时保持较好的稳定性, 最适pH为6.0, 在pH 4.0?7.0范围内有较好的稳定性。酶转化实验说明: 底物L-天冬氨酸和产物β-丙氨酸对转化反应均有抑制作用; 实验建立了较优的酶转化反应方式, 在加酶量为每克天冬氨酸3 000 U时, 以分批加入固体底物L-天冬氨酸的形式, 使100 g/L底物转化率达到97.8%。【结论】重组L-天冬氨酸α-脱羧酶在大肠杆菌中获得高效表达, 研究了酶转化生产β-丙氨酸的影响因素, 为其工业应用奠定了基础。     

3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体文库高通量筛选方法的建立

[目的]建立一种快速、高通量筛选3-甾酮-Δ¹-脱氢酶(KstD)突变体库的方法。[方法]基于已发表KstD蛋白晶体结构,设计饱和突变引物,构建突变体文库,优化蛋白表达条件,利用冻融法结合溶菌酶法获得粗酶液;基于分光光度法原理,优化检测反应体系,利用酶标仪检测吸光度的变化来反映酶活力。[结果]利用饱和突变引物成功构建突变体文库,表达KstD最佳条件为：IPTG终浓度0.3 mmol/L,20℃诱导20 h;缓冲液中溶菌酶浓度为0.5 mg/mL时上清目的蛋白含量最高。优化后的酶活检测条件为：Tris-HCl缓冲液50 mmol/L、pH 8.0、0.4 mmol/L DCPIP、1.5 mmol/L PMS、0.7 mmol/L雄烯二酮(4AD)和适量的酶液组成,温度30℃、酶反应时间5 min,于600 nm波长下测定。[结论]成功建立了一种5 min检测96个3-甾酮-Δ¹-脱氢酶(KstD)突变体的高通量筛选方法,重复性变异系数在3%以下。     

细菌L-天冬氨酸α-脱羧酶的分子机制及分子改造研究进展

L-天冬氨酸α-脱羧酶能够催化L-天冬氨酸生成β-丙氨酸,是泛酸代谢中的关键酶之一,对生物体中的能量代谢和脂肪代谢至关重要。细菌L-天冬氨酸α-脱羧酶属于丙酮酰依赖型的一类酶,具有特别的翻译后加工机制和底物失活作用,本文对L-天冬氨酸α-脱羧酶的分子机制和分子改造进行了综述,并对其在β-丙氨酸合成方面的应用进行了展望。     

L-天冬氨酸脱羧酶研究进展

根据作用于L-天冬氨酸的位置不同,L-天冬氨酸脱羧酶可分为L-天冬氨酸α-脱羧酶和L-天冬氨酸β-脱羧酶,本文综述了两种酶在结构特点、酶学性质、基因表达、酶的应用等方面的研究进展。     

双酶偶联转化富马酸制备β-丙氨酸的工艺的建立与优化

酶转化法是生产β-丙氨酸的重要途径,但单一酶法转化存在底物价格较高的问题。通过构建双酶催化体系制备β-丙氨酸,即将来源于大肠杆菌的天冬氨酸酶(AspA)和来源于谷氨酸棒杆菌的L-天冬氨酸α-脱羧酶(PanD)偶联,以富马酸和氨为底物进行酶促反应合成β-丙氨酸。催化反应中AspA与PanD的最适加酶比例为1∶80,其中AspA的浓度为10μg/mL,转化温度为37℃,pH为7.0;浓度为100 mmol/L的富马酸可在8 h内被完全转化,转化率为100%,摩尔产率为90.9%,β-丙氨酸的产量为90 mmol/L,约为7 g/L;浓度为200 mmol/L的富马酸在反应8 h后,体系中β-丙氨酸的产量为126 mmol/L,约合9.8 g/L,继续延长反应时间,转化率并没有明显提高。根据该研究提出的双酶偶联转化工艺可将价格低廉的富马酸一步转化为具有高附加值的β-丙氨酸。     

谷氨酸依赖型氨基转移酶的高通量筛选方法及其应用

目的:建立谷氨酸依赖型氨基转移酶-谷氨酸脱氢酶偶联反应的96孔板高通量筛选方法,并用于大肠杆菌氨基转移酶Wec E突变库的筛选。方法:通过优化偶联指示酶-谷氨酸脱氢酶、信号分子NADH浓度及双酶偶联反应时间,建立了光学法测定氨基转移酶活性的氨基转移酶-谷氨酸脱氢酶偶联反应方法;通过定点饱和突变技术构建了大肠杆菌氨基转移酶WecE的突变库;采用96孔板高通量初筛、摇瓶复筛获得了高活性的转氨酶突变体,并对纯化的突变体进行催化活力分析。结果:建立了谷氨酸依赖型氨基转移酶目标反应与0.5 U/ml L-谷氨酸脱氢酶和0.4 mmol/L NADH信号指示反应相偶联的筛选方法;构建了氨基转移酶WecE Tyr 321饱和突变库,通过96孔板高通量筛选,获得了催化活性比野生型提高3.4倍的突变体Y321F。结论:所建立高通量筛选方法背景干扰小,准确性高,为谷氨酸依赖型氨基转移酶分子进化提供了可行性方案。     

基于光谱法-图像灰度法高通量筛选高效固定CO2的苯甲酸脱羧酶*

目的:苯甲酸脱羧酶能够催化羧化反应固定CO₂,为了获得高效的苯甲酸脱羧酶,需要利用高通量分子克隆与突变体筛选系统对产生的大量突变体进行筛选,因此建立、开发高效的筛选评价方法对于获得高羧化效率的突变体至关重要。方法:利用2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶催化邻苯二酚固定CO₂的反应体系,建立了光谱法-图像灰度法高通量筛选和评价固定CO₂的苯甲酸脱羧酶突变体。利用分光光度法在308 nm快速定量羧化产物2,3-二羟基苯甲酸。同时利用高效液相色谱(HPLC)法对分光光度法的测定结果进行了校正,确定了分光光度法估算的2,3-二羟基苯甲酸浓度与HPLC方法测定的准确浓度之间具有良好的线性关系(R² = 0.996)。利用HPLC-分光光度法的相关性可以获得实际样品中准确的2,3-二羟基苯甲酸浓度。利用Image J软件获得蛋白质标准品和突变体的灰度均值,根据灰度法定量蛋白质标准品的标准曲线计算突变体的蛋白质表达量。利用单位酶量催化邻苯二酚获得2,3-二羟基苯甲酸的浓度比较突变体的催化活性。结果:纯酶和粗酶体系下HPLC法测定的2,3-二羟基苯甲酸浓度与分光光度法测定的吸光度值的关系分别为C₁=0.500A₁-0.010(R² = 0.996)和C₂=1.458A₂+0.431 9(R² = 0.991)。从13个突变体中获得了两个正向突变体,羧化活性分别是WT的3.5倍和1.7倍。结论:基于光谱法-图像灰度法可以实现高通量筛选固定CO₂的苯甲酸脱羧酶,该方法可用于具有相似功能的苯甲酸脱羧酶对其他取代基的酚类和水杨酸类似物的底物选择性筛选。     

L-天冬氨酸-α-脱羧酶高产菌株初筛方法的建立

通过试管法、平板法、Berthelot法和纸层析法对L-天冬氨酸-α-脱羧酶(PanD)高产菌株的初筛方法进行研究。分别检测转化体系中底物L-天冬氨酸减少引起的pH变化及产物CO2和β-丙氨酸的增加量,并用高效液相色谱法比较这四种方法的准确性。结果表明:CO2能溶于转化液,难以用倒置管收集完全;PanD系胞内酶,难以用平板点种法改变平板的pH;β-丙氨酸和L-天冬氨酸在Berthelot检测中吸收值均偏低,不适用于PanD高产菌的筛选;纸层析法可以直接检测β-丙氨酸和L-天冬氨酸,成本低,操作简单,具一定的精确度,可以较大规模地筛选PanD高产菌株。     

L-脯氨酸-4-羟化酶的异源表达和合成反式-4-羟基-L-脯氨酸的条件优化

L-脯氨酸-4-羟化酶(L-Proline-4-hydroxylase,P4H)是依赖α-酮戊二酸(α-KG)和Fe2+的双加氧酶成员之一,在反式-4-羟基-L-脯氨酸(trans-4-hydroxy-L-proline,t-4Hyp)等重要手性化合物的生物合成中发挥关键作用。本研究构建了来源于Bradyrhizobium japonicum USDA 6的P4H重组大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)/p ET-28b-p4h BJ,SDS-PAGE和酶活检测结果表明,该菌株具有表达可溶性P4H和催化合成t-4Hyp的能力。通过优化,确定了该重组菌全细胞催化合成t-4Hyp较优的反应体系和条件:10 m L p H 6.5 80 mmol/LMES缓冲液、9 mmol/L L-Pro,6 mmol/L L-抗坏血酸,6 mmol/Lα-KG,0.8 mmol/L Fe SO4·7H2O,反应温度为35℃;在20 g/L湿细胞的催化反应中,t-4Hyp的合成量达到34.86 mg/L,比优化前(17.53 mg/L)提高了98.86%。该工作为进一步利用P4H生物催化法合成t-4Hyp奠定了一定的技术基础。     

杰氏棒杆菌L-天冬氨酸α脱羧酶半理性改造及全细胞催化合成β-丙氨酸

β-丙氨酸是多个药物合成的重要砌块，可以通过天冬氨酸α脱羧酶（Pan D）催化L-天冬氨酸脱羧来合成，但普遍在用的Pan D酶活性不高是制约全细胞催化合成β-丙氨酸的瓶颈。因此，本研究通过酶的挖掘，选择将杰氏棒杆菌来源（Corynebacterium jeikeium）Pan D在Escherichia coli中异源表达。对杰氏棒杆菌来源Pan D进行Alaph Fold2建模和分子对接，采用Rosetta虚拟突变确定突变热点，结合薄层层析初筛和纯化后复筛，最终筛选到突变体L39A，其比酶活为13.45 U/mg，相比野生型酶的比酶活（9.6 U/mg）提升了1.4倍。酶学性质表征数据表明，野生型酶和L39A突变体最适p H均为6.5，且在p H 6.0-7.0之间酶活性稳定；两者最适温度为55℃，但L39A热稳定性较野生型提高；突变体酶的催化效率比野生型提升了1.4倍。对突变体进行结构解析发现，39位取代为侧链基团更小的丙氨酸，亲水性增强，增加了关键催化氨基酸58位酪氨酸与其他氨基酸的相互作用，使活性中心周围的区域稳定性提高，从而提高了催化活性。全细胞催化数据表明，在OD600=4...     

长双歧杆菌N-乙酰氨基己糖1-位激酶的活性位点

【目的】研究长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)JCM1217的N-乙酰氨基己糖1-位激酶(Nacetylhexosamine 1-kinase,Nah K)中对催化活性有影响的位点。【方法】利用点突变试剂盒,获得Nah K的4个位点的共10种单点突变体表达菌株。诱导表达并纯化野生型和突变体酶,用DNS法和NADH偶联的微孔板分光光度法检测野生型及突变体酶的最适p H和最适Mg~(2+)浓度,并测定酶促反应动力学参数。【结果】D208A、D208N、D208E和I24A四种突变体的催化活性几乎丧失。突变体H31A、H31V、F247A和I24V的最适p H由野生型的7.5变为7.0,突变体H31A和F247A的最适Mg~(2+)浓度由野生型的5 mmol/L变为10 mmol/L。反应动力学参数测定结果表明,突变体F247Y对底物Glc NAc/Gal NAc及ATP的催化活性均高于野生型。【结论】通过定点突变,确定了对Nah K催化活性有影响的4个位点,并且获得了一个催化效率提高的突变体(F247Y),为进一步对Nah K进行分子改造奠定了一定基础。     

全细胞高通量筛选α-氨基酸酯水解酶突变体的方法

【目的】建立高效敏感的高通量筛选方法,用于筛选头孢克洛合成活性提高或热稳定性提高的α-氨基酸酯水解酶。【方法】根据头孢克洛在碱性条件下水解生成的衍生物在340 nm处有特征吸收峰的原理,制作出标准曲线。采用全细胞96孔板紫外分光光度法高通量测定α-氨基酸酯水解酶突变体的头孢克洛合成活性。【结果】头孢克洛含量与△A340?405在(0.1?0.6)×10?3 mol/L浓度范围内有良好的线性关系,服从朗伯-比尔定律,平均回收率为99.8%?101.3%。一轮定点饱和突变产生的2 300个克隆经该方法的筛选,获得3株kcat提高40%以上,4株半失活温度较野生型提高5°C以上的突变体酶。【结论】该方法准确可靠,每天筛选量可达到2 000个反应,达到高通量筛选的要求。     

基于体外分子进化技术提高弯曲芽孢杆菌CCTCC 2015368 β-淀粉酶的热稳定性

运用体外分子进化技术易错PCR方法,高通量筛选热稳定性提高的弯曲芽孢杆菌Bacillus flexus CCTCC2015368β-淀粉酶突变体。利用LB琼脂淀粉板显色、96-孔板DNS法测酶活和酶标仪检测等,最终筛选到了一株热稳定性显著提高的突变体D476N。野生型和突变体D476N分别纯化后,酶学性质测定表明:突变体D476N的最适pH为6.5,与野生型相比降低了0.5。突变体D476N和野生型的最适温度均为55℃,突变体D476N在55℃下的半衰期为35 min,比野生型提高了95%。突变体D476N的T_(50)值比野生型提高4℃。突变体D476N的K_m值为97.98μmol/L,是野生型(85.86μmol/L)1.14倍;突变体稳定性提高的同时,催化活力相对于野生型有略微下降。通过SWISS-MODEL同源模拟野生型和突变体D476N的三维结构,并通过PyMol软件分析,发现突变后的氨基酸残基Asn476位于蛋白质表面的loop环上,通过MOE软件计算,D476N的分子自由能(ΔG)为106.01kcal/mol,比野生酶降低10.3%,这一结果与蛋白质分子自由能和热稳定性呈负相关的理论相符。     

蓖麻蚕中肠γ-谷氨酰转肽酶和底物的相互作用及其生理功能

蓖麻蚕Philosamta cynthia ricini,高度提纯的中肠γ-谷氨酰转肽酶(γ-GTP)体外转肽作用表明:L-苯丙氨酸、L-甲硫氨酸,L-半胱氨酸、L-色氨酸,L-精氨酸和L-赖氨酸是最好的γ-谷氨酰的受体,而L-谷氨酸和L-谷氨酰胺(L-Gln)系该酶良好的γ-谷氨酰供体.酶对γ-谷氨酰对硝基苯胺(γ-GNA)的K_m为0.13mmol/L(含L-苯丙氨酸)和0.29mmol/L(无L-苯丙氨酸).谷胱甘肽(GSH)和L-Gln与γ-GNA竞争酶的γ-谷氨酰结合部位,其抑制常数K₁值分别为0.5mmol/L和1.1mmol/L.Γ-GTP催化L-Gln的酰胺键水解和转肽,其催化速率相当于对γ-GNA的38%.     

蓖麻蚕中肠γ-谷氨酰转肽酶和底物的相互作用及其生理功能

蓖麻蚕Philosamta cynthia ?n,高度提纯的中肠γ-谷氨酰转肽酶(γ-GTP)体外转肽作用表明:L-苯丙氨酸、L-甲硫氨酸,L-半胱氨酸、L-色氨酸,L-精氨酸和L-赖氨酸是最好的γ-谷氨酰的受体,而L-谷氨酸和L-谷氨酰胺(L-Gln)系该酶良好的γ-谷氨酰供体。酶对γ-谷氨酰对硝基苯胺(γ-GNA)的K_m为0.13mmol/L(含L-苯丙氨酸)和0.29mmol/L(无L-苯丙氨酸)。谷胱甘肽(GSH)和L-Gln与γ-GNA竞争酶的γ-谷氨酰结合部位,其抑制常数K_1值分别为0.5mmol/L和1.1mmol/L。γ-GTP催化L-Gln的酰胺键水解和转肽,其催化速率相当于对γ-GNA的38％。     

金属离子对天冬氨酸酶基因工程菌催化合成L-天冬氨酸影响的研究

为研究金属离子对天冬氨酸酶基因工程菌催化合成L-天冬氨酸的影响,以富马酸为底物,分别添加K~+、Mg~(2+)、Mn~(2+)、Ca~(2+)四种金属离子,利用天冬氨酸酶基因工程菌催化合成L-天冬氨酸。结果表明,K+浓度0~2.5 mmol/L时,对L-天冬氨酸的合成没有影响,K+浓度超过2.5 mmol/L时会抑制L-天冬氨酸的合成;Mg~(2+)、Mn~(2+)、Ca~(2+)对L-天冬氨酸合成量影响均呈现先促进后抑制,L-天冬氨酸合成量达到高峰时,Mg~(2+)、Mn~(2+)、Ca~(2+)浓度分别是10 mmol/L、8 mmol/L和11 mmol/L;与对照相比Mn~(2+)促进作用最强,L-天冬氨酸合成量增幅为192.0%。本研究结果可为L-天冬氨酸的工业化生产提供参考。     

基于抑菌活性的ε-聚赖氨酸的微孔板生物检测法

基于ε-聚赖氨酸的抑菌活性,以96微孔板为平台,建立适合大规模样品快速分析的微孔板生物检测法。结果表明,藤黄微球菌(Micrococcus luteus)为最适敏感指示菌,当敏感指示菌初始浓度为107-108 CFU/mL,培养时间为4 h时,ε-聚赖氨酸浓度在100.00-500.00 mg/L范围内与抑菌率呈较显著的线性关系(R2=0.997 5)。该方法不仅表现出良好的精密度和准确度,与HPLC和甲基橙法的实验结果对比,微孔板生物检测法的相对标准偏差(RSD)和相对偏差(RD)分别小于3.5%和3.0%,说明该方法是一种与HPLC法有类似分析精度,但能直接反映样品的抑菌活性,且更适合大规模样品快速检测的方法,可用于发酵过程中ε-聚赖氨酸产量的检测和突变株的高通量筛选。     

L-天冬氨酸-β-脱羧酶发酵条件的响应面优化

利用Plackett-Burman设计和响应面分析方法对L-天冬氨酸-β-脱羧酶产生菌德阿昆哈假单孢菌XG-2-81的发酵条件进行优化.得出影响产L-天冬氨酸-β-脱羧酶的3个重要的因素为:玉米浆,多肽朊和装液量.通过对实验结果的方差分析,得到其最适条件分别为:玉米浆浓度0.64%,多肽朊浓度1.21%,装液量14.7...     

α-氨基酸酯酰基转移酶表达纯化、酶学性质及其催化应用

α-氨基酸酯酰基转移酶(α-amino acid ester acyltransferase,AET)能够催化底物L-丙氨酸甲酯盐酸盐、L-谷氨酰胺合成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-alanyl-L-glutamine,丙谷二肽)。利用重组大肠杆菌saet-QC01表达α-氨基酸酯酰基转移酶,对其表达条件进行了优化,通过Ni-NTA亲和层析法分离纯化重组蛋白,并对其酶学性质、催化应用进行了研究。适合酶表达的诱导条件:温度20℃,诱导阶段(OD_(600)=2.0-2.5),IPTG浓度0.6 mmol/L,诱导时间12 h。α-氨基酸酯酰基转移酶的最适反应温度27℃,最适pH 8.5,在pH 7.0-8.0很稳定,在酸性条件下相对稳定,低浓度的Co~(2+)、低浓度的EDTA对酶活有促进作用。在底物浓度丙氨酸甲酯盐酸盐600 mmol/L、谷氨酰胺480 mmol/L,丙谷二肽的产量达到78.2 g/L,生产速率达到1.955 g/(L·min),转化率达到75.0%。α-氨基酸酯酰基转移酶具有良好的酸碱耐受性,催化效率高的优良特性,在工业生产中具有较好的应用潜力。