庚型肝炎病毒转基因小鼠的建立

利用受精卵原核显微注射的方法,产生了含有ＨＧＶ结构蛋白Ｃ、Ｅ１、Ｅ２及部分非结构蛋白ＮＳ２、ＮＳ３的转基因小鼠。得到１０只ｆｏｕｍｄｅｒ小鼠,其中有３只ｆｏｕｎｄｅｒ小鼠与正常小鼠交配后得到了整合有外源基因的Ｆ１代阳性小鼠。ＲＴ－ＰＣＲ的结果显示,外源基因可在ｆｏｕｎｄｅｒ小鼠及Ｆ１代小鼠的血液有核细胞及肝细胞内转录;组织病理学检查显示,某些转基因小鼠的肝细胞出现了水样变、脂肪变性及轻微炎性反应等     

TIMP-1转基因小鼠纯合子的建立及建系

采用遗传学育种方法 ,使外源基因整合位点随机的基质金属蛋白酶抑制剂 1(TIMP 1)转基因小鼠成为单一整合位点的纯合子转基因小鼠而建立TIMP 1转基因小鼠品系 .通过受精卵原核显微注射方法 ,获得带有人TIMP 1基因的Founder小鼠 .将转基因小鼠与正常小鼠交配 ,得到子代小鼠 .通过PCR及Southern印迹等方法 ,检测TIMP 1DNA在转基因小鼠体内的整合情况 ,阳性率达5 0 %后 ,进行近亲交配 .提取小鼠组织总RNA ,Northern印迹分析阳性小鼠各组织外源性TIMP 1mRNA表达情况 ,以正常NIH小鼠做对照 .获得了 6代小鼠共 4 2 4只 ,其中PCR阳性鼠 2 72只 ,Southern阳性鼠 2 2 6只 ,纯合子转基因小鼠 12 8只 ;F4代后阳性率达到 95 %以上 .转基因小鼠TIMP 1基因表达情况在肾脏的丰度明显高于肝脏和脾脏 (P <0 0 1) ,而肝和脾之间并没有显著差异 (P>0 0 5 ) .外源基因在转基因小鼠体内可以稳定遗传 ,并得到了整合有TIMP 1基因的纯合子转基因小鼠 ,且在阳性的转基因小鼠体内在肾脏中特异性表达 ,为以后开展TIMP 1的肾脏病理生理研究提供了有用的手段     

三种丙型肝炎病毒转基因小鼠系的同时制备

为研究丙型肝炎病毒的致病致瘤机理及结构基因与非结构基因3区(NS3)的功能及其在HCV感染致病中的作用,建立一个HCV分子治疗的动物模型,构建了含金属硫蛋白启动子和HCV结构基因或NS3基因的质粒,将两者等量混合后用显微注射法接种于昆明白小鼠受精卵内制备转基因小鼠.通过PCR筛选获得三种整合HCV结构基因或/和NS3基因的首建鼠.结果表明:a.注射后卵存活率与仔鼠出生率分别为81%、30%;b.检测60只G0代小鼠,结构基因整合鼠6只(10%),NS3基因整合鼠4只(6.7%),双基因整合鼠9只(15%),总整合率为31.7%;c.RT-PCR法检测阳性鼠肝中有靶基因mRNA的转录;d.4只首建鼠与正常鼠回交获得38只G1小鼠,其中20只为整合鼠,整合率为52.6%;e.转基因鼠表型迄今无明显异常.表明一次显微注射同时获得了三种整合HCV结构基因或/和NS3基因的转基因小鼠.     

绿色荧光蛋白转基因小鼠模型的建立及胚胎冷冻保种

目的建立绿色荧光蛋白转基因小鼠模型,并采取胚胎冷冻的方法进行保种。方法通过原核显微注射法,把线性化、纯化后的外源基因pEGFP注射入BDF1小鼠受精卵中,胚胎移植给同期发情的假孕受体母鼠,获得子代小鼠。经鉴定对有表达的转基因鼠进行胚胎冷冻保种。结果移植注射胚胎385枚给30只假孕小鼠共出生了306只后代鼠,经PCR和southern blot检测得到5只阳性小鼠。F2代转基因鼠胚胎冷冻240枚胚胎。结论通过显微注射法使外源基因pEGFP在小鼠基因组中得到整合,建立了转pEGFP的转基因小鼠模型。     

外源性人TIMP-1基因在转基因小鼠染色体上的整合及定位

为探讨外源基因人基质金属蛋白酶组织抑制物-1（human tissue inhibitor of metalloproteinase-1, hTIMP-1）基因在转基因小鼠家系染色体上的整合和精确定位,应用Southrn印迹检测外源基因在染色体上整合的位点及拷贝数.结果表明,外源基因是以单拷贝、单位点形式整合;应用荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）技术检测F4～F20代转基因小鼠中外源基因的整合.结果证明,该家系转基因小鼠自F4代起是纯合子,外源基因整合在17号染色体E区;反向PCR法（Inverse PCR, IPCR）克隆出约3.8 kb外源基因整合位点处的侧翼序列.分析表明,外源基因整合在17号染色体E1.3区,ALK（anaplastic lymphoma kinase, ALK）基因第23个内含子区域.结果提示,获得的转基因小鼠为纯系,外源基因hTIMP-1已稳定整合在转基因小鼠染色体上,并能遗传给后代.     

血管内皮生长因子 (VEGF1 83)转基因小鼠的建立(英文)

采用显微注射法 ,将一个由 1.3kb人感光细胞间维生素A类结合蛋白 (hIRBP)启动子区和人血管内皮生长因子 (hVEGF183)cDNA所构成的融合基因片段HIRV183导入 2 89枚ICR小鼠受精卵的雄性原核 .制备当代 (G0 )转基因小鼠 ,共得G0 代小鼠 17只 .经PCR和PCR Southern方法筛选得到 1只为hVEGF183转基因阳性小鼠 ,整合率为 5 9%,转基因总效率为 0 3%.将其与正常ICR小鼠交配 ,经PCR和dot blot杂交鉴定后代 (F1)小鼠阳性整合率为 4 5 9%.F1代兄妹之间进行交配 ,后代 (F2 )小鼠阳性整合率为 6 7 6 %.结果表明 ,外源基因hVEGF183整合在小鼠染色体的单一位点 ,为以后利用转基因动物的方法对VEGF这个新型异构体VEGF183进行深入研究打下了基础     

睾丸注射法制备携带山羊H-FABP基因的转基因小鼠

为探究睾丸注射法制备转基因动物的可能性,文章将携带有山羊心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)和绿色荧光蛋白标签的重组载体经脂质体包裹后随机打点注射小鼠睾丸。对实验小鼠进行睾丸切片、精子荧光检测以及精子DNA检测,证实外源基因在亲代小鼠体内成功表达。睾丸注射后小鼠与正常母鼠交配产生的F1代,以及F1代自交产生的F2代在不同水平均可检测到外源基因的成功表达,阳性率分别为4%和30.23%。研究结果说明睾丸注射是一种制备转基因动物行之有效的方法,且外源基因可以稳定遗传。该方法的完善和成熟对于动物转基因以及动物性状改良和育种具有理论和实践意义。     

体内系统转基因新方法

建立了一种全新而高效的制备转基因动物新方法.无需外科手术,将含有绿色荧光蛋白的重组质粒直接多次多点反复注射到雄性ICR小鼠的睾丸内.几周后,上述雄性动物与自然发情的雌性交配,制备转基因动物.经PCR检测、DNA印迹,实验结果表明:F1代小鼠转基因阳性率为41%.经DNA印迹证明:外源基因已经整合到子代转基因动物的基因组内并能遗传给后代.将F1代阳性鼠与正常ICR鼠交配,产生F2代转基因鼠,F2代转基因阳性率37%.上述实验结果表明,建立的体内系统转基因方法简便、高效,适用于大规模制备转基因动物,特别适用于一些大型家畜.     

E1A基因转导抑制小鼠血管内皮细胞的激活

延缓性排斥反应 (delayedxenograftrejection ,DXR)是进行异种器官移植亟待解决的问题之一 .在DXR过程中 ,核心事件之一是核转录因子NF κB的激活 .人腺病毒 5 (Ad5 )的早期转录产物E1A蛋白可抑制以NF κB为核心的信号转导系统 .利用转基因技术向小鼠的受精卵导入了E1A基因 ,PCR和Southern印迹检测了 4 4只仔鼠 ,其中有 8只整合了E1A基因 .RT PCR检测发现 ,3只小鼠F1代的心、肝、肾等脏器都有E1AmRNA的表达 ,小鼠表型正常 .通过尾静脉向转基因阳性小鼠体内注射人灭活血清 ,模拟DXR发生的生理过程并用免疫荧光检测脏器细胞表面炎症分子E 选择素的表达水平 .结果表明 ,E1A基因的转导显著抑制了小鼠脏器细胞表面E 选择素的表达 ,为解决DXR的发生提供了可行的途径     

携带HLA-B2704基因转基因小鼠技术的建立

应用显微注射法制备携带HLA B2 70 4基因的转基因小鼠 .对 2 86只昆明小鼠激素注射进行超排卵 ,采集受精卵 ,将含HLA B2 70 4基因的基因组DNA片段 (简称HLA B2 70 4DNA)显微注射到受精卵原核内 ,把注射存活的两细胞期受精卵移入假孕鼠的输卵管内使其发育产生后代 .用PCR方法进行F0代仔鼠及F1代仔鼠的转基因整合的检测 .利用RT PCR检测阳性鼠中的HLA B2 70 4转基因的表达 .采集了 84 11个卵 ,可注射卵 6 6 0 9个 ,其中注射存活的两细胞期受精卵 4 2 77个 ,卵的注射存活率为 6 4 7%.将卵移入 15 3只假孕鼠 ,其中 2 6只怀孕产仔 ,存活 10 1只 .在 10只F0代仔鼠基因组中有HLA B2 70 4基因整合 ,整合率为 9 9%.转基因阳性鼠F0代之间以及与正常鼠之间进行交配 ,产生的F1代仔鼠 78只 ,其中 15只为阳性 .阳性鼠的皮肤、结肠、睾丸和脾脏组织中均有HLA B2 70 4转基因mRNA的表达 .在HLA B2 70 4转基因阳性小鼠中 ,6只小鼠皮肤出现脱毛 ,1只小鼠的足部及足趾明显红肿 ,2只在脱毛同时明显畏光 ,1只出现腹泻 .结果表明 ,成功地建立了HLA B2 70 4的转基因小鼠技术 ,该小鼠类似强直性脊柱炎的小鼠模型 .