甲胎蛋白基因的DNase Ⅰ敏感性和超敏感区与基因表达的关系

我们用大鼠AFP基因cDNA pRAF 87和5'端基因克隆片段为探针,分别探测了AFP基因活跃表达的胚肝组织、具表达潜能的成年肝组织以及不表达的肾组织AFP基因转录区和调控区的DNase Ⅰ敏感性和超敏感区。结果表明;胚肝组织和成年肝组织AFP基因在转录区和5'端调控区都显示出较高的DNase Ⅰ敏感性,而肾组织则不敏感。胚肝组织AFP基因存在三个DNase Ⅰ超敏感区:基因转录起始区,离转录起始区上游约-3 kb左右区域,另一超敏感区位于基因内部4.1 kb EcoR Ⅰ片段内。成年肝组织在转录起始区也存在一超敏感区,在基因内部4.1 kb EcoR Ⅰ片段显示较高的DNase Ⅰ敏感性。推测AFP基因上游-3 kb区域(1.5 kb HindⅢ片段区)DNase Ⅰ超敏感区可能与增强基因转录活性相关,而转录起始区超敏感区可能是维持细胞组织专一性表达所必需,基因转录区域内部DNase Ⅰ超敏感区可能与AFP基因维持具活跃表达或潜能表达的染色质空间结构相关。     

花粉肌动蛋白和兔肌肌动蛋白与DNaseⅠ相互作用的比较研究

纯化了的花粉肌动蛋白同其他肌动蛋白一样,能显著抑制ＤＮａｓｅⅠ活性,其抑制率与肌动蛋白浓度呈直线相关。在同样条件下,花粉肌动蛋白对ＤＮａｓｅⅠ活性抑制没有兔肌肌动蛋白显著。花粉肌动蛋白和兔肌肌动蛋白抑制ＤＮａｓｅⅠ的Ｋａｐｐ 分别为１．２５ μｇ／ｍ Ｌ和０．７５μｇ／ｍ Ｌ。ＤＮａｓｅⅠ使聚合状态的花粉和兔肌肌动蛋白解聚,但在同一条件下聚合状的肌细胞肌动蛋白比花粉肌动蛋白稳定     

体内足迹法研究乙肝病毒DNA与蛋白质的相互作用

以基因组中整合了乙型肝炎病毒基因的ＨｅｐＧ２．２．１５细胞为材料,应用连接介导的ＰＣＲ体内足迹分析法,研究了乙肝病毒增强子Ⅱ和核心启动子区在体内条件下与核蛋白因子的相互作用。结果发现,已在体外条件确定的增强子Ⅱ区的一些转录因子的结合位点,例如,ＳＰ１位点（ｎｔ１６１６－１６２８,ｎｔ１７３３－１７４２,ｎｔ１７４５－１７５４）,Ｃ／ＥＢＰ位点（ｎｔ１６３９－１６４７,ｎｔ１６５１－１６５９,ｎｔ１     

外源RNA对小鼠白蛋白基因表达及DNaseⅠ敏感性的影响

兔肝RNA诱导培养的小鼠成纤维细胞 ,大鼠肝RNA注射入小鼠前列腺 ,用免疫组织化学染色检测外源RNA对小鼠白蛋白基因表达的影响 ;不同RNA诱导培养的小鼠成纤维细胞 ,提取细胞核 ,DNaseⅠ消化 ,PCR法扩增小鼠白蛋白基因 ,检测白蛋白基因消化情况。发现外源RNA可促进小鼠白蛋白基因表达并增加该基因DNaseⅠ敏感性     

凡纳滨对虾DNaseⅠ基因的克隆及原核表达

利用RT-PCR和RACE技术,从凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)肝胰腺中克隆了DNaseⅠ基因的全长cDNA序列。该序列全长1614bp,包含1209bp的开放阅读框,编码一个含403个氨基酸的蛋白;5′非翻译区为116bp,3′非翻译区为289bp。实时定量PCR分析结果表明,DNaseⅠ基因在肝胰腺的表达量是其他器官表达量的16～162倍,表明凡纳滨对虾DNaseⅠ基因属于胰腺型表达。本研究还利用酶切重组构建原核表达载体,并在大肠杆菌(Escherichia coli)中成功表达出了有活性的重组DNaseⅠ蛋白。     

cDNA文库固相构建法

本文介绍一种cDNA文库的固相构建法。文库构建过程cDNA的合成和修饰全部在固相介质—磁珠上完成,简便、迅速、文库质量高,能满足不同目的的cDNA文库构建,是一种值得借鉴和应用的好方法。     

DNA-蛋白质相互作用研究的方法及其新进展

DNA与蛋白质的相互作用参与生命体内的许多生物学过程,关于二者相互作用的研究是人们了解基因表达机制、揭开生命奥秘的关键所在.该文简要阐述了传统研究DNA-蛋白质相互作用的常用方法及其优缺点,并综述了近年来该领域所采用的新技术及其新进展.     

Reverse ChIP:研究DNA-蛋白质相互作用的新方法

反向染色质免疫共沉淀技术(reverse chromatin immunoprecipitation assay,Reverse ChIP)是一种在体内状态下分析DNA-蛋白质相互作用的新方法.它用特异的核酸探针捕获靶DNA片段及与其相结合的蛋白质,蛋白质用质谱仪检测,以达到确定靶DNA位点全部相关蛋白质的目的.其可对靶DNA位点相关蛋白质进行全面、系统地鉴定,特别是寻找已知DNA元件相应的调节蛋白.在发现、鉴定靶DNA位点相关蛋白质和研究DNA-蛋白质相互作用中有重要应用价值.     

结瘤调控蛋白NodD以八聚体形式结合靶DNA

从根瘤菌Rhizobiumleguminosarum 840 1( pIJ15 18)中部分纯化了结瘤调控蛋白NodD ,利用DNaseⅠ足迹法确定了它在R .l.bv .viciae的nodF启动子上的保护区 ,并运用基于凝胶延滞的一系列方法研究了NodD与靶DNA的相互作用 ,发现它以同聚的八聚体形式与DNA结合 .     

人Ha-ras基因中蛋白质特异结合DNA位点的鉴定

利用迁移率改变法和DNaseⅠ足纹法观察了Ha-ras癌基因5’端上游序列与特异结合蛋白的相互作用。用限制性内切酶XmaⅠ消化6.6kb Ha-ras基因得到约10个片段,进行3’-末端标记,与T24细胞核提取液反应,经低离子强度聚丙烯酰胺凝胶电泳,发现与蛋白质特异结合的416bp片段,位于Ha-ras基因5’-端上游1230—1646区域内,靠近转录起始点1660bp处(CAP位置)。另一个与蛋白质特异结合的389bp片段,位于转录起始点上游162—551处。     

神经细胞核蛋白质与淀粉样前体蛋白基因启动子IL-Ⅰ反应元件相互作用研究

研究发现与ＩＬ－１诱导反应相关的ＡＰＰ启动子－４８８／－３０３片段,可与ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞核抽提物中的核蛋白发生结合作用,并且在ＩＬ－Ⅰ刺激前后有量的变化,ＩＬ－Ⅰ刺激后其结合作用明显加强．冷竞争实验表明,此结合作用具有特异性．同时发现ＡＰＰ启动子－４８８／－３０３片段中的ＡＰ－Ⅰ作用位点及ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞核抽提物中的ＡＰ－Ⅰ作用因子可能与此结合反应无关,而一个９０ｋＤ蛋白质与此结合反应有关．     

一种改进的cDNA文库固相构建法

本文介绍一种新的cDNA文库固相构建法。文库构建过程中,cDNA的合成和修饰全部在固相介质――磁珠上完成,简便、迅速、文库质量高,能满足不同目的的cDNA文库构建,是一种值得借鉴和应用的好方法。 Abstract：A method for cDNA library construction was introduced.All enzymatic steps of library synthesis were performed on a solid support-magnetic beads.Therefore it combines fast speed and convenient with high quality library,making it ideally suited for most purposes.It is a good method and worth learning and utilization.     

人鼻咽癌细胞基因组中瘤基因Ha－ras－1的Dnase Ⅰ超敏感位点的初步研究

ＤＮａｓｅⅠ超敏感位点的研究能够发现潜在的调控基因转录活化的位点,比较正常人外周血有核细胞,淋巴瘤细胞株Ｐ３ＨＲ１和人鼻咽癌低分化磷癌细胞株ＨＯｎＥ１和ＨＮＥ２中Ｈａ－ｒａｓ－１瘤基因的ＤＮａｓｅⅠ超敏感位点发现,只有ＨＯＮＥ１和ＨＮＥ２细胞基因组中存在一个ＤＮａｓｅⅠ超敏感位点,位于第一个外显子上游０．３７ｋｂ处,上述结果提示正常白细胞和Ｐ３ＨＲ１细胞中Ｈａ－ｒａｓ－１基因处于失活状态,而在鼻咽癌细胞基因组中则处于活化状态,它的活化可能与０．３７ｋｂ处的ＤＮＡ序列有密切的关系。     

HMG蛋白质与人β-类珠蛋白基因5′上游LCR内HS2core DNA相互作用

HMG蛋白质是真核细胞核内一组含量丰富的非组蛋白,它们在染色质的结构与功能及基因表达调控过程中均起着重要作用.应用体外核小体重组技术和凝胶电泳阻抑法,分析了HMG蛋白质与人β-类珠蛋白基因5′上游LCR内的DNaseⅠ超敏感点2核心DNA序列(HS2core sequence,-10681～-10970 bp)之间的作用模式.实验结果表明,HMG蛋白质(1/2)能与HS2core DNA序列相结合,但HMG蛋白质(14/17)不能与它结合.将HS2core DNA在体外组装成核小体之后,HMG蛋白质(1/2)则不能与组装成核小体形式的HS2core DNA序列结合,而HMG蛋白质(14/17)却能与它结合.结果提示当HS2core DNA序列处于不同状态时,它与HMG蛋白质的结合模式是不同的,HMG蛋白质可能通过这一途径积极参与了人体β-类珠蛋白基因的表达调控.     

基于进化足迹法结合位置打分函数的转录因子结合位点预测

目的:预测转录因子结合位点。方法:本文从ABS数据库上下载了人类和啮齿类动物的直系同源的启动子序列,首先使用位置打分函数对这些启动子序列进行打分,找到候选的转录因子结合位点,并进一步利用进化足迹法对这些候选的转录因子结合位点进行筛选,只有结合位点同时出现在人类和啮齿类动物的启动子序列才认为是真正的结合位点。结果:在对人类和啮齿类动物进行转录因子结合位点预测时,与单独使用打分函数的结果相比,进化足迹法与打分函数结合的方法有效的提高了预测结果的性能,大幅度提供所得预测结果的特异性。结论:进化足迹法结合位置打分矩阵的方法能较为准确有效的预测转录因子结合位点。     

用碱洗脱法检测DNA-蛋白质交联和DNA链间交联

本方法以DNA单链断裂的检测为基础,在背景γ射线照射下进行DNA交联检测。所建方法与Kohn氏原法相比,洗脱时间大为缩短,实验所用主要材料都能立足国内。本文引入“交联度”这个参数,能同时相对定量地表示DNA总交联、DNA-蛋白质交联和DNA链间交联。此外还从DNA、蛋白质两方面确证了DNA-蛋白质交联的存在。     

连接介导PCR及其在体内足迹研究中的应用

连接介导聚合酶链反应是以连接反应为基础的单侧PCR技术,首先在DNA片段的一端连接上一个公共连接子,而后在这个连接子与另一个DNA序列特异的引物间扩增.Vent聚合酶的使用,延伸产物捕获及连接子标记选择策略的采用,大大提高了连接介导聚合酶链反应的敏感性.这一技术的发明大大促进了体内足迹等研究的进行.     

核苷氢磷酸法固相合成DNA片段研究

继亚磷酰胺法之后,国外近年来又推出了用氢磷酸法合成DNA和RNA片段的方法。提出氢酸磷法比亚磷酰胺法具有更简便、高效和实用性好的特点。 我们用自己制备的氢磷酸核苷活性单体,以长链烷氨基多孔玻珠(CPG)为载体,用自     

磁珠法快速提取基因组DNA的实验研究

针对临床标本基因组DNA的提取方法缺乏广泛适用性,提取步骤繁琐,需要进行离心操作,并且提取过程中会用到苯酚、氯仿等有机试剂,会对操作人员有一定的危害性等不足,本研究拟建立一种适用于临床标本的基因组DNA快速提取方法。在传统的基因组DNA提取试剂和方法的基础上,本研究采用二氧化硅修饰的超顺磁珠设计了一种基因组DNA快速提取方法;探讨磁珠用量、裂解液p H、盐酸胍浓度等因素对基因组DNA提取效率的影响并采用凝胶电泳实验进行验证。当磁珠用量在50~100μg/100 mg样品,裂解液p H约为6,盐酸胍的浓度为6 mol/L时基因组DNA提取效果好、效率高,且磁珠的用量与吸附表面积成正比,但达到一定用量后不会增加提取量,对于100 mg肺组织,适宜的磁珠用量为80μg。此基因组DNA提取方法高效省时,简便快捷,性价比高,适用临床大量样本基因组DNA提取。     

虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ突变体A1Y-HWTX-Ⅰ的固相合成和生物学活性测定

用芴甲氧羰基 (Fmoc)固相多肽合成的方法在自制自动蛋白质化学工作站上合成了用酪氨酸 (Y)替代虎纹捕鸟蛛毒素 - (HWTX- )第一位丙氨酸 (A1 )的突变体 A1 Y- HWTX- .合成的突变体用 Edman降解和电喷雾质谱法进行鉴定 .活性分析结果证明 ,合成的 A1 Y- HWTX- 在含有谷胱甘肽的缓冲体系中氧化折叠后显示出与天然 HWTX- 完全相同的生物学活性 ,提示 Y替代 HWTX- 的 A1后并不明显影响 HWTX- 的活性部位和空间构象 ;A1与 HWTX- 生物学活性无关 .此外 ,将 Y引入 HWTX- 分子有助于利用碘标记方法研究 HWTX- 的作用机制