L型细菌、普通细菌对紫外线照射的实验比较

目前,紫外线消毒已得到广泛应用,其对细菌的杀灭作用早已是众所周知,但对Ｌ型细菌杀灭作用的报导甚少。我们以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、绿脓杆菌、宋内氏痢疾杆菌、枯草杆菌、表皮葡萄球菌等,在实验室内进行了初步观察,现将结果报告如下：１材料与方法１...     

L型细菌普通细菌对热抵抗力的比较

目前,热力常用于消毒与灭菌,其对普通细菌具有明显的致死作用,早已是众所周知,但其对Ｌ型细菌的杀灭作用,国内外研究较少。我们以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、绿脓杆菌、宋内氏痢疾杆菌、枯草杆菌、表皮葡萄球菌等及其Ｌ型菌在实验室内进行了初步观察,现将...     

微酸性电解水对人员手部和即食蔬菜消毒效果的研究

本实验研究了微酸性电解水对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌菌悬液的杀灭作用,以及微酸性电解水对人员手部冲洗及黄瓜和生菜浸泡法的消毒效果.结果表明,采用有效氯浓度为80 mg/L的微酸性电解水对含有0.3％有机干扰物的大肠杆菌菌悬液,作用1 min,杀灭对数值大于6;对含有0.3％有机干扰物BSA的金黄色葡萄球菌菌悬液,作用2 ...     

金黄色葡萄球菌的检测方法优化及其在舟山市水产品加工厂中的污染状况调查

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是引起食物中毒的重要致病菌。为简化金黄色葡萄球菌复杂的检测方法,并了解舟山市水产品中该致病菌的污染状况,通过比较已公开的3套针对耐热核酸酶编码基因的PCR鉴定体系,根据特异性和灵敏性实验筛选了1套最优的针对金黄色葡萄球菌的PCR鉴定体系。基于这一体系和国家规定的标准方法,对舟山市水产品加工厂各个环节采集的120份样品中金黄色葡萄球菌的污染状况进行了调查。结果显示,120份样品中金黄色葡萄球菌的检出率为8.3%,PCR检测方法与国标法检出阳性率比较无显著差异,而且集中在原料和环境这两个环节检出金黄色葡萄球菌,在半成品和成品中却未检测到。由此,可以认为舟山市水产品加工厂的原料和环境中存在着一定的安全隐患,而成品相对较为安全。     

金黄色葡萄球菌AgrA/C双组分信号转导模型的构建与功能评价

【背景】抗生素的无序使用加剧了耐药性金黄色葡萄球菌超级菌株的出现,由其引发的感染已成为最难解决的感染性疾患。在生物体系外构建AgrA/C双组分系统的跨膜信号转导过程,对解决金黄色葡萄球菌的耐药性问题和发现新型抗菌药物具有重要的研究意义。【目的】人工模拟构建金黄色葡萄球菌AgrA/C双组分信号转导模型,为生物体外研究金黄色葡萄球菌双组分信号转导的机制及以其为靶点的药物筛选提供新途径。【方法】在大肠杆菌宿主细胞中大量表达AgrA和Agr C蛋白,利用亲和层析和分子筛凝胶层析对其进行分离纯化,利用非放射性凝胶阻滞实验(EMSA)检测AgrA蛋白活性,并检测Agr C激酶活性;进而利用脂质体介导法在体外组装AgrA/C双组分信号转导模型,应用EMSA方法进行评价。【结果】分离纯化得到AgrA和Agr C蛋白,二者纯度均达到90%以上,均具有活性。在生物体系外构建了金黄色葡萄球菌AgrA/C双组分信号转导模型,该系统可增强AgrA对DNA的延滞作用,具有信号传递功能。【结论】初步构建AgrA/C双组分信号转导模型,该模型具有信号传递能力,有望作为针对金黄色葡萄球菌开发新型抗菌药物的筛选平台。     

常压低温等离子体对微生物的杀灭研究

初步探讨APPJ等离子体对微生物的影响机制 ,用APPJ与DBD两种不同类型等离子体对不同代表微生物金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌黑色变种进行处理 ,分析比较不同微生物对不同等离子体的存活曲线 ;进而利用扫描电镜观察微生物细胞壁、膜等外部结构的变化。结果显示两种等离子体对不同微生物的杀灭作用均为先快后慢 ,APPJ的作用效果远好于DBD(DBD对金黄色葡萄球菌及枯草杆菌黑色变种芽孢的D值为 70s ,而APPJ的D值为 4s)。同时 ,在APPJ的作用下 ,大肠杆菌细胞壁、膜有明显破裂发生。这证明 ,APPJ可快速有效地杀灭微生物体 ,其灭菌机制可能与微生物细胞壁、膜的破裂有关。     

PCR技术在检测鼠金黄色葡萄球菌中的应用研究

目的　建立实验大小鼠金黄色葡萄球菌的快速检测方法———PCR法。方法　根据已公布的金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因的序列 ,设计并合成一对特异性的引物 ,利用PCR技术扩增nuc基因片段。对金黄色葡萄球菌和其他非金黄色葡萄球菌菌株抽提的DNA进行扩增。结果　金黄色葡萄球菌PCR产物出现 6 6 8bp的特异性DNA扩增片段 ,而其他非金黄色葡萄球菌未出现扩增片段 ,证实了合成的引物对金黄色葡萄球菌具有特异性。将抽提的金黄色葡萄球菌DNA进行系列稀释 ,测定此PCR体系的敏感性 ,结果显示 ,该PCR体系能检出 3pg金黄色葡萄球菌DNA ,且从抽提DNA到PCR扩增及电泳结束仅需 4h。结论　本研究所建立的扩增耐热核酸酶nuc基因检测鼠金黄色葡萄球菌的PCR方法 ,具有快速、可靠、敏感和特异的特点 ,可用于临床样品和金黄色葡萄球菌感染时的检测 ,适合应用于实验大小鼠的监测。     

几种天然产物的抑菌性能研究

将羧甲基壳聚糖等四种天然产物作为供试样,分别测定其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、枯草杆菌的最低抑菌浓度,结果表明,四种供试样对其均有一定的抑制作用,其中壳寡糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌的抑制作用最强,羧甲基壳聚糖、壳寡糖、白芨多糖对绿脓杆菌的抑制能力差不多。再根据单体实验结果,选择羧甲基壳聚糖、壳寡糖、白芨多糖进行两两复配实验,结果表明,壳寡糖与白芨多糖的复配液对于金黄色葡萄球菌、枯草杆菌有较明显的协同增效抑菌作用。     

基于功能宏基因组学技术的金黄色葡萄球菌生物被膜抑制物的发现与活性分析

宏基因组学方法直接提取环境中的全部微生物基因组DNA,并使其得到功能性表达,为微生物天然产物的开发利用提供了新的方法。利用功能宏基因组学技术,使用大肠杆菌-链霉菌穿梭载体构建四川峨眉山土壤宏基因组文库,并将文库菌中所携带的环境DNA接合转移到链霉菌宿主中。通过活性筛选获得两个具有抗菌活性的阳性链霉菌克隆,其发酵粗提物对金黄色葡萄球菌生物被膜的形成均有很好的抑制作用,当浓度达到2 MIC(Minimum inhibitory concentration)时,抑制作用超过90%;同时,两种粗提物样品对金黄色葡萄球菌生物被膜也存在显著的清除作用,其中EM110样品对金黄色葡萄球菌生物被膜的清除率高于EM123样品。本文通过功能宏基因组学技术,直接从土壤中筛选获得了对金黄色葡萄球菌生物被膜有较强抑制及清除作用的活性物质。     

中药金银花药用成分的提取及抑菌实验的研究

为了研究金银花中抗菌消炎成分总黄酮、绿原酸的提取方法及其抑菌效果,本实验中用金银花的提取物对11种菌种进行筛选,并对其中有抑制作用的菌种进行了最小抑菌浓度的实验。结果表明金银花的提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有较强的抑制作用,对金黄色葡萄球菌的MIC为6．25mg／ml,对大肠杆菌的MIC为12．5mg／ml。     

金黄色葡萄球菌肠毒素C的原核表达、纯化及活性鉴定

目的：在大肠杆菌中表达金黄色葡萄球菌肠毒素C（SEC）,并对其活性进行检测。方法：以金黄色葡萄球菌基因组为模板扩增SEC基因,经测序正确后插入原核表达载体pBV220中,转化大肠杆菌DH5α后温度热诱导重组SEC表达;表达产物经阳离子柱纯化后,用ELISA鉴定其抗原性;通过观测表达产物对鼠脾淋巴细胞的刺激增殖情况,检测其超抗原活性。结果：构建了SEC-pBV220原核表达载体,在大肠杆菌中可快速、高效表达SEC蛋白,表达产物具有超抗原活性。结论：实现了SEC的原核表达。     

AgNO3对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌作用及机制

以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为模式菌,对AgNO3的抗菌效果进行研究,并对其抗菌机制作初步探讨。AgNO3对大肠杆菌的抑制生长曲线表明:2.891 mg/L的AgNO3能够完全抑制106个/mL的大肠杆菌细胞生长,AgNO3使大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的延滞期加长,并且浓度越高,延滞期越长。另外,AgNO3对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌脱氢酶的活性有明显影响,随着AgNO3浓度的提高,脱氢酶的活性逐渐降低。AgNO3溶液作用于细菌后,细菌表面疏水性均有不同程度地下降,且浓度越大对其影响也越明显,大肠杆菌的下降程度要大于金黄色葡萄球菌。     

环介导等温扩增技术快速检测肉中金黄色葡萄球菌

应用环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术建立了对肉中金黄色葡萄球菌检测的方法。实验中,使用了最新的Bst 20 WarmStart DNA聚合酶完成LAMP扩增反应,并针对金黄色葡萄球菌所特有的保守性耐热核酸酶基因（nuc）设计得到了一套LAMP扩增引物。对LAMP法和PCR法的检测灵敏度进行了比较,同时对人工污染肉中的金黄色葡萄球菌进行检测。结果表明：所建立的LAMP法能够特异性的检测金黄色葡萄球菌,并且检测金黄色葡萄球菌纯菌的灵敏度为201×100CFU/mL,是普通PCR检测灵敏度的100倍。在检测肉中金黄色葡萄球菌时,检测限为201×101CFU/mL。因此,本实验所建立的LAMP法检测肉中金黄色葡萄球菌的方法,具有灵敏、快速以及简便等的优点,是一种具有很好的发展前景的检测手段。     

胞质型肽聚糖识别蛋白RfPGRP-L2在维持红棕象甲肠道菌群稳态中的作用

【目的】明确入侵害虫红棕象甲Rhynchophorus ferrugineus胞质型肽聚糖识别蛋白RfPGRP-L2在肠道菌群稳态的维持和调控过程中的作用,将为靶向破坏肠道菌群稳态的害虫控制新策略研发提供新的科学依据和作用靶标。【方法】利用生物信息学方法分析RfPGRP-L2的序列特征。利用RT-qPCR分析RfPGRP-L2在健康红棕象甲4龄幼虫不同组织(头、脂肪体、表皮、前肠、中-/后肠、血淋巴)以及大肠杆菌Escherichia coli DH5α和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus经注射（注射1 μL OD₆₀₀=1.6的菌液）和喂食（取食涂抹1 mL OD₆₀₀=1.6的菌液的甘蔗薄片）两种不同方式分别感染后红棕象甲4龄幼虫肠道和脂肪体中的表达量;进行RfPGRP-L2原核表达,利用体外孵育方法检测重组蛋白RfPGRP-L2对大肠杆菌DH5α和金黄色葡萄球菌的凝集和抑菌活性;RNAi干扰RfPGRP-L2后,检测红棕象甲4龄幼虫血淋巴和肠道中大肠杆菌菌落数的变化;利用RT-qPCR分析RNAi干扰RfPGRP-L2后红棕象甲4龄幼虫脂肪体和肠道中抗菌肽基因表达量的变化;利用基于细菌16S rRNA的高通量测序分析RNAi干扰RfPGRP-L2对健康红棕象甲4龄幼虫肠道菌群结构组成的影响。【结果】SMART预测发现红棕象甲RfPGRP-L2基因编码的蛋白中无跨膜结构域也无信号肽,这表明RfPGRP-L2是一种胞质型肽聚糖识别蛋白。RT-qPCR检测发现,RfPGRP-L2主要在健康红棕象甲4龄幼虫血淋巴、肠道和脂肪体等免疫组织中表达;被注射感染大肠杆菌和金黄色葡萄球菌6 h和12 h后,红棕象甲4龄幼虫脂肪体中RfPGRP-L2的表达量分别显著上调;被喂食感染大肠杆菌6 h后,红棕象甲4龄幼虫肠道中RfPGRP-L2的表达量显著增加。重组表达蛋白RfPGRP-L2能引起大肠杆菌和金黄色葡萄球菌发生凝集反应,这说明RfPGRP-L2能够识别这两种细菌。当RfPGRP-L2被干扰后,红棕象甲4龄幼虫对肠道和血淋巴中感染EGFP标记的大肠杆菌的清除能力显著弱于对照组;肠道中抗菌肽基因RfCecropin的表达量显著降低;健康红棕象甲4龄幼虫肠道中细菌的菌落数量显著高于对照组,而且肠道菌群结构组成也发生了明显的变化。【结论】红棕象甲体内胞质型肽聚糖识别蛋白RfPGRP-L2能够通过识别细菌并激活肠上皮细胞中相应的免疫信号通路促进抗菌肽基因的表达,从而介导对肠道菌群稳态的调控。     

不同培养条件下金黄色葡萄球菌表型可塑性研究

表型可塑性在生物界普遍存在,但在微生物领域的研究相对较少,利用分子标记技术研究微生物表型可塑性方法也鲜有报道。用1株大肠埃希菌与45株金黄色葡萄球菌混合培养营造竞争环境,测定其生长量并与相同起始浓度单独培养的金黄色葡萄球菌生长量做GWAS对比,得到显著SNP位点。分析SNP位点中与金黄色葡萄球菌生长变化相关的基因表达量变化情况,研究其与金黄色葡萄球菌表型可塑性的关联性。以45株金黄色葡萄球菌在两种模式下生长量及全基因组测序结果为基础,利用双变量全基因组关联分析(Genome-wide association study,GWAS)法筛选与金黄色葡萄球菌生长量显著相关的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)位点,定位这些SNP位点对应的金黄色葡萄球菌基因,从这些基因的功能中筛选与金黄色葡萄球菌生长变化相关的部分并汇总分析。之后选取其中关联性较强的scdA基因序列为模板设计引物,用实时荧光定量PCR (Real-time quantitative PCR,qPCR)的相对定量法,选用16S rDNA为内参基因,测定两种培养环境下基因的mRNA相对表达量,统计分析差异性。结果显示,与大肠埃希菌混合培养的金黄色葡萄球菌受其影响生长量显著降低。GWAS在12个取样点共检测出415个显著SNP位点,筛选后对scdA基因两种培养条件下的相对表达量进行测量并统计分析,结果显示无论251050位点碱基为A或G,scdA基因在混合培养中的相对表达量都显著高于单独培养中的表达量。测序结果表明整个培养过程中scdA基因型保持不变,而两种培养环境下金黄色葡萄球菌scdA基因相对表达量的变化反映了表型的差异。为了应对环境压力,金黄色葡萄球菌SNP251050对应的scdA基因在混合培养环境下显著提高了表达量,以维持自身在培养体系中的稳定性。这表明金黄色葡萄球菌能够依据环境变化在广义生理表型方面主动做出对环境信号的多样性响应,也可认为是金黄色葡萄球菌表型可塑性在环境变化下的反映。     

基于重组溶葡球菌酶和ATP生物发光技术特异定量检测金黄色葡萄球菌

基于重组溶葡球菌酶和ATP生物发光法建立特异定量检测金黄色葡萄球菌的方法。优化设计合成溶葡球菌酶序列,构建重组表达载体pQE30-Lys,转化至大肠杆菌M15并诱导表达,镍柱纯化得到目的蛋白。利用重组溶葡球菌酶和ATP生物发光法特异定量检测金黄色葡萄球菌并与平板计数对比。成功表达了重组溶葡球菌酶,并建立了特异定量检测金黄色葡萄球菌的方法,与平板计数具有显著线性关系。本研究建立的将重组溶葡球菌酶和ATP生物发光法相结合的检测方法操作快捷简单,具有良好的应用前景。     

金黄色葡萄球菌凝集因子B的原核表达及其抗血清调理吞噬活性

金黄色葡萄球菌是导致医院院内感染的主要病原。由于金黄色葡萄球菌极易产生抗药性,因此疫苗免疫是预防该细菌感染的主要手段。作为一个粘附分子,凝集因子B(ClfB)的作用是使金黄色葡萄球菌能够在宿主黏膜定植,是预防该菌感染的一个重要的靶分子。本研究成功地在大肠杆菌中表达了可溶的ClfB N1-N3结构域蛋白(Truncated-ClfB),并且利用亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤技术对其进行了纯化。用纯化后的Truncated-ClfB免疫新西兰大白兔,收集三免后的血清检测其抗体水平并且利用流式细胞术检测抗血清的调理吞噬活性。检测结果表明,三免后的兔源Truncated-ClfB抗血清抗体效价高达1:640 000;与免疫前兔源血清相比,兔源Truncated-ClfB抗血清能够显著增加多形核白细胞(Polymorphonuclear leukocytes,PMN)对金黄色葡萄球菌的吞噬效率(P0.01)。结果表明Truncated-Clf B有希望作为金黄色葡萄球菌疫苗的候选抗原。     

人α防御素5在酿酒酵母中的分泌表达及其活性分析

人α-防御素5(humanα-defensin 5,HD5)是人防御素α家族中发现的抑菌活性最高的多肽。为了探究HD5在酿酒酵母中分泌表达的可行性,首先利用PCR扩增获得酵母菌偏好的HD5核酸序列,构建酿酒酵母表达载体pVT102U/α-HD5,并将该重组质粒转入酿酒酵母S78中,通过营养缺陷筛选获得阳性转化菌株。然后,对重组菌进行发酵培养,取上清液纯化后通过tricine-SDS-PAGE和质谱检测表达产物。最后,利用琼脂扩散法检测表达的HD5的抑菌活性以及其对温度的耐受性,同时通过二倍稀释法检测表达的HD5对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及沙门氏杆菌的最小完全抑制浓度。结果显示:表达的HD5对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及沙门氏杆菌均具有明显的抑菌活性。发酵上清冻干粉对金黄色葡萄球菌完全抑制的最小浓度为10 mg/mL,对大肠杆菌和沙门氏杆菌完全抑制的最小浓度为40 mg/mL;且在不同温度处理下,表达的HD5对3种细菌仍具有一定的抑菌作用。上述结果表明具有高抑菌活性的HD5防御素在该重组系统中成功表达。     

硅纳米针阵列抗菌材料的制备及其抗菌性能研究

本文以简易经济的金属辅助化学刻蚀技术制备了具有高效杀菌性能的硅纳米抗菌材料并研究其形貌与结构,以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为代表菌株,研究了纳米针抗菌材料的抗菌活性。实验证明,该抗菌材料对在其表面培养3 h的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌效率分别为85.12%,76.40%,表明该材料对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌均有高的杀菌效果,所制备的抗菌材料有望为医疗卫生系统在抵抗细菌污染方面提供解决方案。     

伦敦白胶和茶：一种既快又安全的用于透射电子显微镜的细菌样品制备方法

【目的】检测乌龙茶提取物是否可作为电子染色剂取代醋酸双氧铀用于细菌细胞染色,使其能在透射电子显微镜下进行观察。【方法】利用伦敦白胶对细菌样品(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)进行胶块的制备,再在复染铅与不复染铅这两种情况下对超薄切片样品进行3种不同染色剂的电子染色,之后在透射电子显微镜下观察比较其不同之处。这3种不同的染色剂分别是醋酸双氧铀、0.05%乌龙茶提取物以及0.1%乌龙茶提取物。首先将带有超薄切片样品的铜网悬浮于不同的待比较染液中10?15 min,若需进一步用柠檬酸铅复染,则将经3次蒸馏水冲洗过后的铜网再次悬浮于柠檬酸铅染液中8?10 min。【结果】复染铅的情况下,在透射电子显微镜下无论是大肠杆菌还是金黄色葡萄球菌,利用3种电子染色剂进行染色的结果均非常相似。【结论】实验结果表明,在观察细菌结构中,乌龙茶提取物可以替代醋酸双氧铀进行透射电子显微镜样品的电子染色。