小麦几丁质酶基因的异种表达及其功能鉴定

几丁质酶参与植物的发育及防卫反应,并与人类疾病发生有关.文章研究了小麦几丁质酶基因Wch2经根癌农杆菌介导的烟草瞬间表达和转基因拟南芥的稳定表达,Western杂交及酶活测定证实,瞬间表达的小麦几丁质酶分子量约30 kD,具有降解几丁质多聚物的功能;Wch2在转入拟南芥后表达量高,尖孢镰刀菌接种的鉴定表明,表达Wch2的转基因植株的抗病性显著高于表达绿色荧光蛋白的对照植株.这些结果说明Wch2的异种表达,可用于植物抗病基因工程,以增强植物的抗病性.     

棉花黄萎病病原菌诱导侵染对转基因抗病棉花生理性状的影响

通过研究棉花黄萎病病原菌诱导侵染对转基因抗病棉花生理性状的影响,旨在为提高转基因抗病棉花抗病性提供理论依据。Byd、28p两品种棉花为供试材料,应用花粉管通道法将几丁质酶与β-1,3-葡聚糖双价抗病基因导入棉花株系中,多年筛选获得不同抗性水平的棉花株系;棉种经棉花黄萎病病菌侵染后,苗期测定棉株内的生理生化变化。结果显示,转基因抗病棉株体内的酶活性已达对照水平,而感病及耐病棉株内的酶活性均有不同程度的变化。所测定的棉株内的酶活性及脯氨酸含量的变化与棉株的抗病性相关。     

单子叶植物RNA干扰和过表达Gateway载体的构建

基因枪和农杆菌介导的遗传转化是目前常用的两种单子叶植物遗传转化方法。载体的发展和改良是提高植物遗传转化效率的重要基础,RNA干扰载体和过表达载体是目前通过遗传转化研究植物基因功能的主要工具。Gateway克隆技术是一种基于lambda噬菌体特异位点重组特性的通用克隆技术,该技术可以将大批目的基因方便、快捷地连接到受体载体上。本文利用Gateway技术结合传统酶切、连接方法,构建了适用于单子叶植物基因枪和农杆菌转化的RNA干扰Gateway载体pAHC-PSK-RNAi、pClean-G185-RNAi和过表达Gateway载体pAHC-PSK-OE和pClean-G185-OE,为利用基因枪和农杆菌介导的遗传转化,在小麦和水稻等单子叶植物中进行规模化基因功能研究奠定了基础。     

CMV抑制PVYN CP基因沉默及其介导的抗病性

以前曾报道用RNA介导的抗病毒策略,获得了高度抗病的表达马铃薯Y病毒坏死株系外壳蛋白基因(PVY^N CP)的转基因烟草,并对T1、T2代转基因植株进行了遗传和抗病性分析。此次以T,代转基因植株为试验材料,在筛选高度抗病植株并证明其抗病性是基于转基因沉默的基础上,采用Northern杂交的方法,证明CMV侵染抑制了转基因植株中PVY^N CP基因的沉默,而且CMV对PVY^N CP基因沉默的抑制部位是发生在接种后的新生叶上,接种叶及其下部叶片中PVY^N CP基因沉默则未受到影响。采用ELISA方法对CMV PVY^N复合接种的转基因植株进行PVY^N检测,结果表明,接种叶及下部叶没有检测到PVY^N,植株叶片对PVY^N表现为抗病。而在CMV接种后植株新生叶中则检测出了高滴度的PVY^N,植株叶片对PVY^N表现为感病。该文报道了在表达PVY^N CP基因的RNA介导抗性转基因植株中,异源病毒侵染抑制了转基因的沉默,并导致转基因植株的抗病性丧失。     

OsbHLH1基因过表达载体构建及转化水稻研究

OsbHLH1基因编码bHLH类转录因子,与水稻耐寒性相关.以pCAMBIA3300为母体,利用玉米泛素(Ubiquitin)启动子构建了能使OsbHLH1基因过表达且含有Bar基因的植物表达载体p3300-Ubi-Ω- OsbHLH1.利用基因枪法将其转化到粳稻品种东稻3号中,获得再生苗47株.选取其中9株进行PCR、Southern检测,结果表明目的基因已经整合到水稻基因组中;草铵膦叶片涂布试验结果表明,Bar基因在水稻植株中正常表达;低温处理后,除45号植株外,其余8株光合速率的变化率显著低于非转基因对照,初步证明OsbHLH1基因在水稻中过表达显著提高了水稻的耐低温能力.     

含有融合标记基因和LoxP/FRT位点的植物表达载体构建及应用

本研究利用化学合成法合成了包含pCAMBIA0390左右边界T-DNA和LoxP/FRT (LF)位点的DNA片段Ⅰ,利用SacⅡ和SphⅠ酶切位点,去除了pCAMBIA0390左右边界T-DNA和多克隆位点之间的序列,然后连接DNA片段Ⅰ和载体片段,构建了植物表达载体pGM323-LF-enTP.随后,再合成含有适合在单子叶植物中表达的由玉米Ubi-1启动子驱动的融合标记基因(Bar::gus)和水稻actin-1启动子驱动的Bt抗虫蛋白基因(Cry1Ab)表达元件的DNA片段Ⅳ,在pGM323-LF-enTP的基础上,利用SalⅠ和PstⅠ位点构建了同时含有LF位点、Bar::gus以及Cry1Ab基因表达元件的表达载体pGM626-LF-ABt.利用含有pGM626-LF-ABt的农杆菌遗传转化烟草和玉米,以草丁膦作为抗性筛选剂,非转化细胞得到了有效抑制,快速获得了转基因植株,利用GUS组织化学检测和RT-PCR分析了转基因植株中标记基因的表达,结果表明pGM626-LF-ABt可以用于农杆菌介导的单、双子叶植物遗传转化.本研究为培育安全抗虫转基因植物奠定了基础.     

植物几丁质酶的研究进展

自 1 92 1年Ｆｏｌｐｍｅｒｓ首次从细菌和放线菌中证实水溶性几丁质酶存在以来 ,研究者又相继在多种微生物、植物、动物中分离到几丁质酶。在高等植物中 ,几丁质酶分布于草本植物和木本植物或单子叶植物和双子叶植物 ,主要存在于植物的根、茎、叶、花、果实、种子及胚等部位 ,种子、花器、根中的几丁质酶含量一般高于其它器官[1] 。现以在玉米、水稻、小麦、大麦、棉花、油菜、甜橙等 70多种栽培植物和野生植物中检测到几丁质酶活性[2 ] 。1　几丁质酶的特性及分类定位1 1　几丁质酶的一般特性几丁质酶是一种糖苷酶 ,以几丁质 [(1 ,4) - 2…     

转几丁质酶基因防植物病害研究:进展、问题与展望

综合评述了近几年转几丁质酶基因防植物病害研究中的发现与进展：（１）至少３１种病原真菌（含变种和专化型）可诱导植物几丁质酶,（２）据称已提纯的植物几丁质酶对立枯丝核菌等真菌呈现了体外抑菌活性;（３）一些生防细菌的防病作用依赖于其几丁质酶基因的存在;（４）数种植物几丁质酶基因和一种细菌几丁质酶基因已被转入水稻、烟草、番茄等植物,一些转基因株系抗病性显著增强;（５）粘质沙雷氏菌的一种几丁质酶基因已被转入荧光假单胞菌和根瘤菌中,转基因细菌对立枯丝核菌有显著抑制作用。就几丁质酶抑菌谱、转基因的策略和研究中存在的疑点进行了分析讨论。建议今后的研究方向应集中在以下几方面：（１）加速转几丁质酶基因或几丁质酶基因与其它基因组合的植物实用化;（２）进一步研究不同基因组合的增效作用及增效机理;（３）查明个别几丁质酶基因的抑菌谱及选择性抑菌机制;（４）转几丁质酶基因或与其它基因的组合于植物内生细菌。     

黄连对羟基苯基丙酮酸双加氧酶基因的植物表达载体构建

目的:构建除草剂抗性基因黄连对羟基苯基丙酮酸双加氧酶的植物表达载体.方法:通过PCR从重组质粒pGWB2/Cjhppd中扩增出大小为1 300bp的目的片段,亚克隆到pGEM-T easy上.BamHⅠ和SpeⅠ双酶切pGEM-T Easy/Cjhppd和质粒pCambia1301,回收得到1 300bp的Cjhppd基因片段和开环质粒pCambia-1301-UbiN,用T4连接酶连接,得到重组质粒,利用三亲法将其导入农杆菌EHA105 中.结果:成功得到农杆菌EHA105的阳性菌落,菌落PCR扩增得到和预期大小一致的1 300bpDNA片段.结论:成功将具有除草剂抗性的Cjhppd构建到了含有玉米泛素启动子Ubi和选择性标记基因Hpt的植物表达载体pCambia-1301-UbiN/Cjhppd,并导入根癌农杆菌EHA105中,可以用于水稻等单子叶植物的遗传转化.     

转基因玉米中目的基因的遗传表达及其抗病性研究

采用花粉介导方法将几丁质酶基因和潮霉素基因导入玉米(Zea maysL.)自交系海92-1中,以筛选抗玉米丝黑穗病的转基因品种.对转化植株及其后代植株的PCR、Southern blot检测表明,目的基因已导入转化植株并整合到其基因组中,且能够稳定遗传.ELISA分析证明转基因植株中目的基因可高效表达,表达产物量在9.8~16.3 ng?g-1鲜叶左右.统计分析显示,目的基因产物表达水平与转基因植株的抗病性呈极显著正相关(r=0.925,P<0.01).接种病毒鉴定结果揭示转基因株系的抗病性比对照提高3~4级.结合农艺性状筛选,选育到401、403这2个抗丝黑穗病且其它农艺性状优良的转基因纯合株系.     

基因枪法导入Bar基因后转化春小麦的幼胚因素

东北农业大学农学院曹颖、胡尚连、李文雄等鉴于基因枪技术不受宿主限制、转化周期短的优点和在单子叶植物遗传转化中广泛应用,他们用Bar基因转化小麦植株,即利用基因枪法将抗除草剂Bar基因导入春小麦东农7742,IE47和辽10,以培养20～22天的幼胚为受体,在80毫微克金枪粉量和6厘米的轰击距离下,基因枪发挥最佳的转化效果。其中有180个幼胚再生出12个植株,有3个呈GUS(基因)阳性,经PCR分析,检测到Bar基因,还证明用高金粉量可以提GUS基因瞬时表达。但金粉密度大,易成块、不能分散,单位面积上靶组织上金粉颗粒数量多,组织易受伤,影响抗性愈…     

21科41种(变种)植物叶片几丁质酶系的研究

对广州地区常见的21科41种（变种）植物叶片几丁质酶系研究的结果表明,所有受试植物都具有几丁质酶活性。几丁质酶不仅存在于被子植物的双子叶植物和单子叶植物中,而且也存在于裸子植物及蕨类植物中。几丁质酶活性及比活性均较高的有蕹菜、葱、蕨类植物、蒜、茄科植物、玉米、菜豆、番木瓜等。植物一般都具有两种几丁质酶:外切酶和内切酶。几丁质外切酶活性及比活性均较高的有蕨类植物、葱、茄科植物等。几丁质内切酶活性及比活性均较高的有蕹菜、裸子植物等。不同植物几丁质外切酶与内切酶的比例相差较大。有些植物的几丁质酶系以外切酶为主,如茄科植物、大部分豆科植物、番木瓜等;有些植物以内切酶为主,如裸子植物、伞形科植物、蕹菜等;有些植物的外切酶与内切酶含量相差不大。     

三个方便实用的植物表达载体构建与验证

为满足植物功能基因组学研究及转基因安全性需要,本研究根据一些国内外引进或商业化的植物表达载体及其相关元件,构建了3个适合于植物,尤其是单子叶植物转化的表达载体,即p AH006、p WMB022和p WMB025。p AH006载体包含由玉米泛素ubi启动子调控的GUS基因和bar基因的完整T-DNA区域,此区段能够被酶切回收,可用于单子叶植物农杆菌介导转化效率评价及基因枪介导线状DNA转化效果研究;p WMB022载体携带由双35S启动子调控的玉米色素基因Lc和C1,可用作基因枪介导的共转化筛选标记,直观筛选含目标基因转基因材料;p WMB025载体携带由ubi启动子调控的、商业化转基因植物中广泛利用的EPSPS基因,可用于禾谷类作物农杆菌或基因枪介导的遗传转化,载体多克隆位点可通过酶切方式更换目标基因。酶切鉴定结合农杆菌或基因枪介导的小麦幼胚愈伤组织或叶片转化验证此3个载体表明,载体构建正确,其标记基因、可视化基因和报告基因均能正常表达。这3个载体的构建对于小麦等植物转化效率提升、安全型转基因作物获得和植物功能基因组学研究等具有重要意义。     

转基因植物中外源基因的遗传学行为

１９８４年,首次利用农杆菌Ｔｉ质粒将外源基因导人烟草获得成功［１」,随后,转基因禾本科作物在水稻上也获得了成功［２,３］。随着各种遗传转化技术的创立与改进,近十几年来,在许多作物上都获得了转基因植株。植物遗传转化技术在基础研究和应用研究中的价值得到了很大体现。尤其是在应用研究上,植物遗传转化技术与常规的育种技术相比,它以超越种间隔离的特点吸引了广大的分子育种家投入到这方面的研究。迄今为止,许多有应用前景的基因已导入到双子叶植物和单子叶植物,并有少量转基因植物已释放到大田应用［４,５］。我们实验室…     

OsPHGPx基因的过量表达增强水稻抗氧化能力

植物在生物或非生物胁迫下会通过表达磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)来抵御胁迫引起的氧化损伤,但是PHGPx在植物体内抗氧化途径中所扮演的生理角色目前尚不完全清楚。利用农杆菌遗传转化技术,构建了过表达Os PHGPx基因的转基因水稻,并对转基因水稻进行了PCR、实时定量PCR以及Western blot等检测分析,结果表明Os PHGPx基因已成功转入水稻并正常表达。与野生型水稻相比,这些过量表达Os PHGPx的转基因水稻抵御百草枯氧化伤害的能力提高。     

导入双价基因的转基因杂交油菜亲本及其对菌核病抗性的研究

比较了乙酰丁香酮、pH、共培养温度及不同激素配比对根癌农杆菌转化油菜(Brassica napus)的影响,建立了油菜高效转化体系.按该体系,将组成型表达几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因转化甘蓝型双低杂交油菜亲本恢复系和保持系,获得了转基因恢复系和保持系植株.对再生植株进行PCR和SouthemBlot检测,结果表明外源基因已整合到油菜基因组中.连续3代的PCR检测及转基因植株抗病性在自交后代中得到保持,证实外源基因已遗传到T3代.对转基因植株T1代离体叶进行菌核病菌丝体接种和T1及T2代大田自然侵染鉴定,结果表明,转基因恢复系棚40-12、棚40-32和保持系96B-2对菌核病的抗性比受体对照大幅度提高,大田鉴定其发病率连续2年均比受体对照减少78%以上,比抗病品种‘中油821'减少75%以上,病情指数比受体对照和‘中油821'减少均达显著水平,其抗病性能在后代稳定遗传,获得了高抗菌核病的转基因育种材料.     

抗除草剂转基因大豆后代遗传分析

分析了来源于农杆菌介导的4个独立的大豆转化系的后代遗传特性。分别采用种子切片GUS染色方法和除草剂涂抹以及喷洒方法检测gus报告基因和抗除草剂bar基因在后代的表达。其中3个转化系T1代gus基因和bar基因能够以孟德尔方式3：1连锁遗传,说明这2个基因整合在大豆基因组的同一位点。这3个转化系在T2代获得了纯合的转化系,并能够稳定遗传至T5代。有一个转化系在T1代GUS和抗除草剂检测都为阴性,但通过Southern杂交证明转基因存在于后代基因组,显示发生了转基因沉默。为了证明转基因沉默是转录水平还是转录后水平,T1代植物叶片接种大豆花叶病毒（SMV）并不能抑制转基因沉默,说明该转化系基因沉默可能不是发生在转录后水平。     

转水稻NibT基因玉米植株的获得及抗病性研究

以玉米(Zea mays L.)自交系'金黄96B'为受体材料,供体为质粒pWM101并携带有水稻矮缩病病毒复制酶基因Nib的提前终止突变体基因NibT,采用超声波处理花粉介导植物基因转化方法将NibT基因导入受体,经PCR检测和Southern杂交分析证实获得转基因植株,进而对T1～T3代转基因植株(株系)进行分子分析、田间抗病鉴定和农艺性状调查.逐代分子检测分析结果证明,目的基因可稳定遗传.抗病鉴定结果证明转基因植株(株系)各代抗病水平基本一致,抗病性比对照提高3级.农艺性状调查分析表明,与对照比较,转基因植株株高增加7～18 cm、穗位高增高0～13 cm、穗长增加0.7～2.1 cm、穗粒数多8～35粒、百粒重增加1.1～2.6 g,转基因株系与阴性对照间、各代转基因株系相互间都差异显著(P＜0.05);调查还发现转基因植株的株高和穗位高随着世代的增加,与对照间的差异逐代减少.研究也说明,超声波处理花粉介导植物基因转化方法是一种简捷、快速和有效的植物转化工具.     

高赖氨酸蛋白基因导入水稻及可育转基因植株的获得

构建了一个植物高效表达质粒,使来源于四棱豆（Psophocarpus tetragonolobus(L.)DC)的高赖氨酸蛋白基因（lys）受控于单子叶植物ubiqutin强启动子下表达。用基因枪法将其导入水稻(Oryza sativa L.)幼胚诱导的愈伤组织,经潮霉素抗性筛选,得到可育的再生植株。经PCR和Southem blotting检测,表明该基因已整合到水稻的基因组织。GUS组织化学染色表明转基因水稻植株的叶、茎和根中均有gus基因的表达。测定112株转基因水稻叶片中赖氨酸叶量,大部分植株有不同程度的提高,最高幅度为16．04％。     

农杆菌介导的植物基因转化研究进展

农杆菌介导的植物基因转佛当今植物基因转化的主要方法之一,因而深受关注,本文从农力介导的基因转化机理,植物对农杆菌侵染的反应,转基因植物的遗传表达,以及农杆菌对单子叶植物的转化等方面论述了该领域的最新研究进展,并提出了进一步研究的方向。