狂犬病疫苗蔗糖密度梯度离心纯化工艺开发

目的:开发冻干人用狂犬病疫苗(鸡胚成纤维细胞)的连续流蔗糖密度梯度离心纯化工艺。方法:分别比较两种不同初始蔗糖浓度和不同上样速度对纯化效果的影响,初步确定纯化工艺;通过多批次实验确定样品收集范围;比较不同浓缩倍数条件下杂质去除和抗原回收情况,确定合适的收获液浓缩比例;比较不同批次样品纯化后的杂质去除率和重复性,判定本纯化工艺的稳定性。结果:选取60%作为初始蔗糖浓度,在上样速度为150～200ml/min时,可以有效地对10倍浓缩的病毒收获液进行纯化;卵清蛋白、牛血清白蛋白和庆大霉素去除率分别达到99%,95%和95%,且工艺具有极好的稳定性。结论:开发的连续流蔗糖密度梯度离心技术可以作为冻干人用狂犬病疫苗(鸡胚成纤维细胞)的产业化纯化工艺。     

柞蚕微孢子虫孢子分离纯化方法

柞蚕微粒子病是柞蚕Antheraea pernyi(Guérin-Méneville)的主要胚胎传染性病害,病原为柞蚕微孢子虫Nosema pernyi(Wenet Ding),其病原分离提纯技术研究对于柞蚕微粒子病的防治具有重要意义。本文利用差速离心和Percoll密度梯度离心法研究了柞蚕微孢子虫孢子的分离纯化方法,结果表明,采用不连续密度梯度分离纯化柞蚕微孢子虫孢子的效果比单一浓度的效果好,以浓度为25%、50%、75%、100%不连续梯度,15000r/min离心30min分离纯化得到的柞蚕微孢子虫孢子纯净度高。     

易发生聚集的重组HBcAg病毒样颗粒的纯化*

目的:探索针对易发生聚集的重组HBcAg病毒样颗粒(VLP)的有效纯化方案。方法:培养的大肠杆菌经IPTG诱导重组HBcAg蛋白的表达,菌体超声破碎后的离心沉淀用含有不同浓度尿素的PBS缓冲液重悬溶解,经密度梯度离心并结合电镜观察对VLPs行为进行分析鉴定。以Sepharose 4 FF凝胶过滤层析在选定的尿素条件下纯化沉淀溶解液,纯化获得的目的蛋白进一步在含30%山梨醇的PBS中脱盐去除尿素。整个过程以SDS-PAGE及电镜进行各步骤样品中目的蛋白的分析。结果:含有1mol/L尿素的PBS缓冲溶液重悬超声沉淀,可有效溶解聚集的VLPs,在蔗糖密度梯度离心中显示典型HBcAg VLPs的行为,且电镜观察颗粒形态结构完整。经1mol/L尿素下凝胶过滤,VLPs进一步获得纯化。在脱尿素过程中流动相采用含30%山梨醇的PBS,有效避免了VLPs在尿素去除后重新聚集。结论:尿素与山梨醇的联合应用,为具有聚集现象的VLPs纯化制备提供了一种有效解决方案。     

粗茎鳞毛蕨孢子萌发研究

以经过3年低温储藏的粗茎鳞毛蕨孢子为实验材料,从孢子离心、孢子消毒、培养基种类、光质等4方面对孢子萌发进行研究,结果表明:在离心转数≤14 000 r.min-1、离心时间≤30 min条件下,离心处理对孢子萌发基本无影响;对孢子进行1%NaClO水溶液浸泡处理20～30 min为最佳消毒条件;改良Knop’s培养基为最佳孢子萌发培养基;黑暗条件下孢子不能萌发,但是黑暗处理能够明显提高孢子萌发整齐性;红光比白光能促进孢子提早萌发1 d左右,但对提高萌发率效果不显著。     

基孔肯雅病毒浓缩提纯及多肽抗原研究

采用聚乙二醇(PEG 6000)沉淀法(粗提)和蔗糖密度梯度速率区带离心(精提)浓缩纯化基孔肯雅病毒获得满意效果。以SDS-PAGE和免疫印迹法分析基孔肯雅病毒结构蛋白的组成及抗原性。结果证实:基孔肯雅病毒含有三种结构蛋白(E_1、E_2和C),另一种病毒特异性蛋白E_3与完整毒粒无结构上的联系;病毒粗提样品与精提样品的免疫印迹结果基本一致,尽管在SDS-PAGE图谱上二者相差甚大,因而就某些研究或应用目的而言,病毒的纯化程序可简化。文中初步探讨了以基孔肯雅病毒包膜糖蛋白为特异性抗原用于流行病学调查和临床     

兔的一种新病毒 II．一株兔出血症病毒的某些理化性质的研究

采用氯仿、聚乙二醇。硫酸葡聚糖钠盐二相系统和蔗糖密度梯度离心法,从患病兔肝组织中提取、纯化病毒。该病毒粒子无囊膜,呈20面体对称,直径一般为33—37 nm。其三角剖分数T=3,共有32个子粒,每一子粒为中空的、外径为9 nm左右的圆形轮廓。经蔗糖密度梯度离心后,可获得沉降系数为166s的病毒颗粒,这种颗拉具有很强的感染性。经SDS—PAGE测得病毒粒子有四种多肽,分子量分别为66．4k、65．Ok、63．5k、41．Ok。二苯胺试验,吖啶橙染色、甲醛试验及热变性曲线表明,该病毒是单链DNA病毒。电镜下经甲酰胺法展层的病毒核酸呈单链线状,分子量平均为2．1×106道尔顿。此病毒的上述性质类似于细小病毒。 53s中空的圆形子粒,有很强的血凝性,而对照组铁蛋白和同一条件下所制备正常兔肝 成份无凝血特性,说明53s的9nm粒子应为病毒外壳蛋白子粒。     

海洋野生鱼酶解提取鱼油的工艺分析

海洋野生鱼与养殖鱼比较, 其鱼油中含更多的二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）、脂溶性维生素等活性成分。为提高海洋野生鱼的利用价值, 以野生小带鱼为原料进行酶法提油工艺研究。分析了不同的温度, 时间, pH值等影响因素下的提取、萃取以及离心效果, 以响应面法确定了最佳的酶解工艺条件: 液固比为6、pH7.3、酶量1000 u/g原料、搅拌速度200 r/min、45oC酶解90 min; 最优萃取条件: 萃取剂100 mL(每20 g鱼糜原料)、pH4.0、40oC萃取25 min; 离心条件: 离心速度3000 r/min (1865 g)、离心时间10 min。上述工艺条件下提油率为79.90%。改进了传统的鱼油提取工艺, 在活性成分保护上有较大改善。     

海洋野生鱼酶解提取鱼油的工艺分析

海洋野生鱼与养殖鱼比较, 其鱼油中含更多的二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）、脂溶性维生素等活性成分。为提高海洋野生鱼的利用价值, 以野生小带鱼为原料进行酶法提油工艺研究。分析了不同的温度, 时间, pH值等影响因素下的提取、萃取以及离心效果, 以响应面法确定了最佳的酶解工艺条件: 液固比为6、pH7.3、酶量1000 u/g原料、搅拌速度200 r/min、45oC酶解90 min; 最优萃取条件: 萃取剂100 mL(每20 g鱼糜原料)、pH4.0、40oC萃取25 min; 离心条件: 离心速度3000 r/min (1865 g)、离心时间10 min。上述工艺条件下提油率为79.90%。改进了传统的鱼油提取工艺, 在活性成分保护上有较大改善。     

菠菜原生质体游离与纯化的研究

以菠菜为实验材料进行原生质体分离、纯化、活力鉴定。结果表明:1.5%纤维素酶OnozukaR-10+1%果胶酶Pectolase+0.5mol/L甘露醇+CPW盐的酶液,酶解时间5h,菠菜原生质体的获得率高。纯化时,适当降低离心时间有利于原生质体纯化过程中产量及活力的保持,500r/min离心5min,效果较好。     

用琼脂糖凝胶制备电泳— 冻融法纯化质粒DNA

随着基因工程研究的不断发展，DNA 做 为一种实验材料要求纯化方法更加简便，质量 更高。目前关于质粒DNA的纯化方法已有许 多报道fs-5I。国外多采用氯化艳密度梯度离心 法，国内则限于条件，很少应用此法。我们建 立了琼脂糖制备电泳— 冻融法，以纯化质粒 DNA及DNA的酶切片段。方法简便易行，而 且效果良好。     

慢性蜜蜂麻痹病病毒核酸与蛋白质组分的研究

从自然感染的意大利麻痹病蜂(APis mellifera)头部,经二次差速离心与蔗糖梯度离心获得纯化的慢性蜜蜂麻痹病病毒(CBPV)。纯化的CBPV制备物感染正常蜜蜂,4天后出现典型的麻痹症状,接着死亡,平均死亡率分别为95％与100％。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,二次差速离心初步纯化的病毒制备物含有多条蛋白带,而蔗糖密度梯度纯化的病毒制备物仅含有单一的多肽带。5％、7.5％与10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,均检测出一种病毒蛋白质,分子量大约为24,200道尔顿,而且不同凝胶浓度检测的蛋白质分子量相近。慢性蜜蜂麻痹病病毒核酸也用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,结果表明,凝胶中有5条带,对核酸酶敏感,证明该病毒含有5个单股RNA组分。对慢性蜜蜂麻痹病病毒的基因组结构进行了讨论。     

基孔肯雅病毒浓缩提纯及多肽抗原研究

采用聚乙二醇(PEG 6000)沉淀法(粗提)和蔗糖密度梯度速率区带离心(精提)浓缩纯化基孔肯雅病毒获得满意效果。以SDS-PAGE和免疫印迹法分析基孔肯雅病毒结构蛋白的组成及抗原性。结果证实:基孔肯雅病毒含有三种结构蛋白(E₁、E₂和C),另一种病毒特异性蛋白E₃与完整毒粒无结构上的联系;病毒粗提样品与精提样品的免疫印迹结果基本一致,尽管在SDS-PAGE图谱上二者相差甚大,因而就某些研究或应用目的而言,病毒的纯化程序可简化。文中初步探讨     

离心力对制备沉积物间隙水中化合物浓度的影响

研究了离心力对间隙水化合物浓度的影响.将腐殖质掺入东湖沉积物样品,按泥:水=1:4(体积)比室温下静置30d,随后掺入铜,泥:水=1:4(体积)比静置10d,得到总有机碳含量在1.47%-.72%、铜含量在120-2700mg/kg(干重)的试验沉积物样品,用离心法制备沉积物中的间隙水.离心参数为3000r/min、200r/min、9000r/min、1000r/min和12000r/min,4 ℃下离心20min.间隙水中化合物浓度分析表明,随离心力升高,间隙水中铜、铁、总有机碳(TOC)含量逐渐降低,钙的含量略有增加,而锰的含量不受离心力变化的影响.根据上述分析结果,确定在腐殖质对沉积物中铜的毒性影响研究中,制备沉积物间隙水的适宜离心条件为:12000r/min、4℃下离心20min.       

我国水稻条纹叶枯病病原性质的研究

病样经提纯后,在电镜下获得3nm丝状和8nm分枝丝状结构,病毒样在蔗糖密度梯度离心后产生三条沉降带。经过电泳分析表明:病毒外壳蛋白为单一组分,分子量约为3.69×10~4dalton;病毒核酸有三种大小不同的组分,分子量为0.9,1.0,1.4×100dalton(混合样)。用提纯的抗原制备抗血清。提纯病毒抗原与所制备抗血清、与我国过去研究制备的抗血清及与日本制备的条纹叶枯病单克隆抗体都有血清学反应。     

虎仗原生质体分离纯化及电融合初步研究

以野生虎杖根状茎芽为外植体诱导虎杖愈伤组织,选取生长状况良好的愈伤组织作为原生质体分离材料,通过L16(44)正交试验对虎杖原生质体分离条件进行优化.结果表明:1.4%纤维素酶R-10,0.1%果胶酶,17%甘露醇的酶液,酶解时间7h,虎杖原生质体分离效果最好.在80r/min振荡分离后虎杖原生质体得率为46.2%.以800r/min的离心速度纯化,纯化的原生质体得率为43.8%,其中原生质体的成活率为75%.通过对虎杖原生质体进行融合,原生质体的融合率为20.2%.     

含RGD修饰的病毒样颗粒递送ICG靶向肿瘤的研究

目的:获取含RGD靶向肽的乙肝核心病毒样颗粒,为药物靶向纳米递送系统提供一种新型载体。方法:将实验室前期构建测序正确的含RGD修饰的乙肝核心病毒重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,单因素分析及正交试验探究重组蛋白最适表达条件。在最适表达条件下扩培,收集菌体超声破碎后离心,采用凝胶过滤层析、离子交换和蔗糖密度梯度离心进行纯化,利用透射电镜对形成的RGD-HBc VLPs的形态及稳定性进行鉴定。纯化的RGD-HBc VLPs利用其体外自组装的特性,将光敏剂ICG装载到颗粒的内部,通过静脉注射到4T1乳腺癌荷瘤小鼠,探究重组RGD-HBc VLPs作为纳米递送系统的靶向性。结果:RGD-HBc VLPs在温度32℃、IPTG0.5mmol/L、诱导4h时以可溶性蛋白的形式得到高效表达。经蔗糖密度梯度离心纯化后纯度到达95%以上。透射电镜下观察纯化的RGD-HBc VLPs形态、大小均一,直径约为32nm,通过近红外荧光活体成像证实了RGD-HBc作为纳米载体的靶向性。结论:经表达和纯化后,RGD-HBc VLPs具有较高的表达量和大小均一的形态外貌,近红外荧光活体成像证实具有较好的靶向性,这不仅为肿瘤的可视化诊断提供一种快速、精准、方便的方法,而且为今后靶向免疫治疗提供一种新型载体。     

菜白蝶的一种新病毒II．病毒的生物物理、血清学性质

用氯仿-丁醇处理和差速超速离心,再经两次蔗糖密度梯度离心,纯化了这株菜白蝶病毒。病毒沉降系数约132S。在氯化铯中的浮力密度为1．39g／cm3。在相同条件下测定,健康菜白蝶幼虫蛋白沉降系数分别为16S、38S、76S,而被病毒感染的死幼虫则为17S、62S、127S。     

流行性感冒病毒灭活疫苗规模化生产工艺的建立

本文报告了流行性感冒病毒疫苗规模化生产工艺的建立及结果,用鸡胚分别接种A1,A3,和B型病毒株,培养后进行了纯化,配苗及检定,对培养时间,收获量、离心分离及纯化、灭活、脱糖等重要步骤进行了优化比较。结果表明,培养66小时病毒滴度及收获量达到最高;采用蔗糖密度梯度离心可收到理想的分离效果;超滤脱糖优于透析法;β-丙内酯在生产中是一种理想的灭活剂,并依此筛选出最优化工艺配置,建立了切实可行的疫苗规模生产工艺,成功制备了质量稳定,安全可靠的疫苗制剂。     

胡杨液泡膜微囊的纯化及其质子转运活性

 为进一步研究液泡膜及 H+ - ATP酶在胡杨抵御盐胁迫中所起的作用 ,比较了研磨、捣碎和超声破碎三种细胞破碎方法 ,从悬浮培养的胡杨细胞中制备液泡膜微囊的效果 ;并用差速离心和不连续蔗糖密度梯度离心纯化了胡杨液泡膜微囊 .通过测定 H+ - ATP酶对 NO-3 、VO3-4和 Na N3的敏感性 ,以及焦磷酸酶质子转运活性表明 ,液泡膜微囊主要分布在 0 %～ 2 5%的蔗糖界面上 .捣碎法破碎细胞结合差速离心和蔗糖密度梯度离心可获得正向微囊比例高、封闭性好和酶活性高的液泡膜微囊     

离子交换法纯化α-淀粉酶抑制剂

采用离子交换法,利用弱碱性阴离子交换树脂D315吸附小麦粉初提液中的α-淀粉酶抑制剂,对其静态吸附以及洗杂洗脱条件进行研究。通过对静态吸附条件的摸索,得出静态下的最佳工艺条件:上样料液的蛋白质量浓度ρ0=2.5~3.5 mg/mL、pH=8.5~9.5、温度t=30℃、转速150 r/min。最佳洗脱条件:0.1 mol/L NaCl洗杂,0.5mol/L NaCl洗脱。在该条件下,α-淀粉酶抑制剂纯化倍数为4.25倍,收率为64.58%。