溶藻弧菌耐药基因qnr的克隆及生物信息学分析

[目的]克隆溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)喹诺酮类耐药基因qnr并分析其蛋白结构,为研究该蛋白的生物学功能奠定基础。[方法]根据NCBI上公布的相关序列设计qnr基因特异性引物,利用PCR方法扩增基因序列,进行DNA测序及生物信息学分析。[结果]从溶藻弧菌染色体上获得qnr基因大小为651 bp,编码216个氨基酸,进化分析可知其与副溶血弧菌有很近的亲缘关系,二级结构分析含有五肽重复序列,三维结构与大肠杆菌质粒上的qnr蛋白空间结构极为相似。[结论]通过对蛋白质序列分析和结构预测,初步确定该基因为喹诺酮耐药基因,为水产细菌的耐药机制研究奠定基础。     

沙眼衣原体LpxA基因克隆及生物信息学分析

[目的]克隆沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)LpxA基因并分析其生物学特性。[方法]根据Ct LpxA基因序列设计特异性引物,利用PCR扩增LpxA基因,并把LpxA基因连接到p MD18-T载体,挑取阳性克隆进行PCR和DNA测序验证。最后使用生物信息学软件分析LpxA蛋白的生物学性质。[结果]从Ct基因组中PCR扩增得到840 bp的Ct LpxA基因,该基因共编码280个氨基酸。LpxA蛋白无信号肽,定位在细菌细胞质。二级结构预测得知α-螺旋占19.6%,延伸链占32.8%,β-转角为11.4%,无规卷曲为36%。三级结构预测得知3个相同的LpxA分子组成同源三聚体。预测得知LpxA蛋白有11个B细胞表位。[结论]克隆得到Ct LpxA基因,并预测了其结构和功能。     

鸡importin β1基因的克隆及生物信息学分析

[目的]对鸡importin β1基因进行克隆和生物信息学分析。[方法]根据Gen Bank公布的鸡importin β1基因序列(XM_015299473)设计合成特异性引物,通过RT-PCR从DF-1细胞中扩增importin β1基因CDS区并进行克隆和测序,利用生物信息学工具对其理化性质、二级结构和系统进化树进行分析。[结果]鸡importin β1基因CDS全长2 268bp,共编码755个氨基酸,该蛋白等电点为4.61,相对分子质量84.15 k Da,分子式为C3712H5901N979O1152S46。蛋白质二级结构预测显示,鸡importin β1蛋白含有丰富的二级结构,以α-螺旋为主(占64.90%)。importin β1基因同源性及系统进化树分析结果表明鸡与鹌鹑的亲缘关系最近。[结论]鸡importin β1基因的克隆和生物信息学分析为进一步研究其功能奠定了基础。     

日本沼虾IAG基因的克隆及生物信息学分析

[目的]对日本沼虾胰岛素样雄性腺激素基因(Mn-IAG)进行克隆及生物信息学分析。[方法]用RACE-PCR法获取Mn-IAG基因序列,用生物信息学软件分析该基因及蛋白的结构特征及理化性质。[结果]Mn-IAG基因编码175个氨基酸,该蛋白的分子式为C_(871)H_(1373)N_(255)O_(271)S_(13),理论等电点为6.94;没有跨膜结构域,为亲水性蛋白;存在20个磷酸化位点和2个劈切位点。[结论]Mn-IAG可能与细胞膜上的受体结合,参与日本沼虾的性别调控过程。     

梅毒螺旋体蛋氨酸亚枫还原酶基因克隆及生物信息学分析

[目的]克隆梅毒螺旋体(Treponema pallidum)蛋氨酸亚枫还原酶(methionine sulfoxide reductase,Msr)基因并对其进行生物分信息学分析。[方法]根据梅毒螺旋体Msr基因序列,设计特异性引物,PCR法扩增目的基因,将其连接到p MD19-T载体,进行DNA测序及生物信息学分析。[结果]从梅毒螺旋体中扩增得到的大小为873 bp的Msr基因,编码291个氨基酸。Msr蛋白含有Msr A和Msr B的保守区,为亲水性蛋白,无信号肽,定位在细菌细胞质。三维结构与牛Msr蛋白(PDB:1fvg.1)类似。Msr蛋白含有几个B表位。[结论]克隆获得了Tp Msr基因,并分析了其生物学特性。     

小鼠Neto2基因克隆及生物信息学分析

[目的]克隆并生物信息学分析小鼠Neto2基因。[方法]]通过RT-PCR方法从小鼠脑组织中克隆Neto2基因,利用生物信息学工具对其理化性质、蛋白结构和系统进化进行分析。[结果]成功构建载体pMD19T-m Neto2。小鼠Neto2基因CDS全长1 662 bp,编码553个氨基酸,该蛋白分子式为C2776H4312N762O826S32,相对分子质量62.6 k Da,等电点为7.18。结构分析显示,小鼠Neto2蛋白二级结构以无规卷曲为主(54.25%),该蛋白有两个跨膜区域及磷酸化修饰位点,无信号肽。小鼠Neto2与Grik2、Necab3、Kars、Grip1等蛋白存在相互作用。[结论]小鼠Neto2蛋白是含553个氨基酸残基的亲水蛋白,含62个磷酸化位点,参与调节神经生长发育、兴奋性神经递质传递、学习记忆等生物学功能。     

人精氨酸酶Ⅰ基因克隆及生物信息学分析

[目的]克隆人精氨酸酶Ⅰ(human-ARGⅠ)基因并分析其生物学特性。[方法]根据NCBI数据库提供的人精氨酸酶Ⅰ基因序列设计其特异性引物,利用PCR扩增目的基因,并将其连接到p CMV-MYC载体上并利用生物信息学工具分析人精氨酸酶Ⅰ蛋白的生物学特性。[结果]酶切鉴定与DNA测序结果显示人精氨酸酶Ⅰ基因全长969bp,编码322个氨基酸残基;人精氨酸酶Ⅰ蛋白属于精氨酸酶——组蛋白去乙酰化酶超家族,是位于细胞质中的稳定亲水性蛋白,无信号肽,不含跨膜结构域,其二级结构由无规则卷曲,α-螺旋和延伸链构成,并且三级结构与二级结构预测结果高度一致,建模结果准确可靠。[结论]人精氨酸酶Ⅰ基因全长969 bp,编码322个氨基酸残基,分子量为34 734. 94,p I 6. 72,其氨基酸序列中无信号肽,无跨膜结构域,是非分泌型及亲水性蛋白,是属于精氨酸酶-组蛋白去乙酰化酶超家族,无规则卷曲为二级结构中最主要的结构元件,并且三级结构与二级结构预测结果高度一致,建模结果准确可靠。     

黄芪bHLH类转录因子的克隆测序和生信分析

[目的]对黄芪bHLH转录因子进行克隆测序和生物信息学分析。[方法]根据黄芪转录组数据预测引物，以黄芪cDNA为模板，扩增获得黄芪bHLH转录因子片段，克隆测序后得到全长核苷酸序列，然后应用生信方法进行分析。[结果]结果表明来源于黄芪的bHLH转录因子全长855 bp,编码284个氨基酸，理论相对分子质量为71.76 kDa,理论等电点为5.18;亚细胞定位于细胞核，不存在跨膜区及信号肽，为非分泌蛋白；与其他物种同源基因的氨基酸序列分析表明黄芪bHLH与大豆的bHLH家族具有较高的同源性。[结论]黄芪bHLH转录因子基因的成功克隆和生物信息学分析为进一步阐明黄芪皂苷生物合成途径及其调控机制提供研究基础。     

光滑鳖甲肽聚糖识别蛋白的生物信息学分析

[目的]预测光滑鳖甲肽聚糖识别蛋白的结构与功能。[方法]采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、信号肽、二级结构和亚细胞定位等方面进行预测和分析,同时构建其编码产物的系统进化树。[结果]此蛋白的理论分子量为21.882 k D,包含一个由20个氨基酸组成的信号肽,属亲水蛋白,分泌到胞外发挥作用,可能具有信号转导和响应胁迫与免疫反应的功能,与赤拟谷盗的同源性最高,具有能够与肽聚糖结合的保守的PGRP结构域和一个Ⅱ型酰胺酶结构域。[结论]光滑鳖甲肽聚糖识别蛋白Ap PGRP-FD1基因克隆成功,生物信息学分析及结合蛋白质结构与功能预测可为深入研究ApPGRP-FD1提供理论指导。     

水稻OsUVR8基因电子克隆及生物信息学分析

[目的]获得水稻Os UVR8基因的编码区序列,并进行生物信息学分析。[方法]以拟南芥UVR8蛋白的氨基酸序列作为查询探针,用电子克隆的方法获得Os UVR8基因的编码区序列;用生物信息学软件对Os UVR8蛋白进行预测和分析。[结果]Os UVR8基因有13个外显子,编码区序列长1 764 bp,编码587个氨基酸。Os UVR8蛋白分子量为62132.7 Da,理论等电点为5.87,含有41个芳香族氨基酸,比较稳定,为亲水性蛋白。无规则卷曲是主要的二级结构,其次是延伸链。位于细胞内叶绿体、线粒体之外的区域。具有9个RCC1重复。有35个磷酸化位点,19个O-β-葡萄糖糖基化位点,6个Yin-Yang位点。三级结构与拟南芥UVR8蛋白三级结构相似。[结论]获得了水稻Os UVR8基因的编码区序列并进行了生物信息学分析。     

玉米大斑病菌钙调磷酸酶B亚基基因的克隆与生物信息学分析

[目的]克隆玉米大斑病菌CnB基因,并进行初步的生物信息学分析.[方法]采用cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)技术,扩增玉米大斑病菌CnB基因全长cDNA序列和DNA序列.运用相关生物信息学软件对该基因序列进行分析和预测其编码蛋白的结构功能.[结果]CnB基因含4个外显子和3个内含子,最大开放阅读框为525 bp(GenBank登录号EF 469732),编码174个氨基酸;预测蛋白含约59.77%的α螺旋,8.62%的β转角,6.32%的延伸串,25.29%的不规则卷曲;含有高度保守的4个"EF-hand"Ca2 结合区域,属于Ca2 结合蛋白家族成员,与小麦叶枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)、灰葡萄孢(B.cinerea)、粗糙麦孢霉(Neurospora crassa)等病原真菌中CnB基因有90%以上的氨基酸同源性.[结论]首次在玉米大斑病菌中克隆得到CnB基因,为进一步研究该基因功能奠定基础.     

人NR2F2基因的克隆及其生物信息学分析

[目的]克隆人NR2F2(Nuclear Receptor subfamily 2,group F,member 2)基因并分析其生物学特性。[方法]根据NCBI数据库提供的人NR2F2基因序列设计其特异性引物,通过PCR扩增目的基因,并将其连接到p ET-28a载体上,然后进行酶切鉴定与DNA测序来确定人NR2F2基因克隆的正确性,再利用生物信息学在线工具分析人NR2F2蛋白的生物学特性。[结果]酶切鉴定与DNA测序结果表明人NR2F2基因开放阅读框为786 bp,编码261个氨基酸残基,分子量为29 162.79 Da,p I为5.96。NR2F2蛋白是主要位于细胞质和细胞核中的亲水性蛋白,不含跨膜结构域,无信号肽,其二级结构由α螺旋、无规则卷曲和延伸链构成,并且三级结构与二级结构预测结果一致。[结论]克隆获得人NR2F2基因,其编码的蛋白质属于类固醇/甲状腺激素受体超家族,α螺旋和无规则卷曲为二级结构中最主要的结构元件。GO注释分析表明,人NR2F2属于转录因子,参与序列特异性DNA结合、基因转录、RNA的生物合成、RNA代谢等过程。     

从江香猪λ1干扰素基因的克隆及序列分析

[目的]对从江香猪λ1干扰素(interferon-λ1,IFN-λ1)基因进行扩增、克隆和生物信息学分析。[方法]根据Gen Bank登录的猪IFN-λ1基因序列(FJ455508)设计合成特异性引物,通过RT-PCR从淋巴细胞中扩增IFN-λ1基因CDS区并进行克隆和生物信息分析。[结果]从江香猪IFN-λ1基因CDS全长576 bp,共编码191个氨基酸,其分子式为C949H1543N277O270S7,相对分子质量21.38 k Da;该蛋白等电点为9.42,为亲水性蛋白。从江香猪IFN-λ1含有丰富的二级结构,以α-螺旋(64.40%)和无规卷曲(25.65%)为主,蛋白质三级结构中主要以α-螺旋为主,同源性及系统进化树分析结果表明从江香猪与野猪IFN-λ1核苷酸同源性最高(为100%),亲缘关系最近。[结论]从江香猪IFN-λ1基因的克隆和生物信息学分析为进一步研究其抗病毒功能奠定了基础。     

油橄榄HMGR基因家族的克隆表达及功能验证

3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR),催化3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-Co A)生成甲羟戊酸(MVA),是MVA途径中第一个关键酶。油橄榄是一种重要的经济油料作物,其含有的萜类物质具有重要营养价值,但关于调控萜类物质代谢途径的关键基因研究较少。为研究萜类合成途径关键酶基因HMGR,本研究采用RT-PCR法克隆油橄榄HMGR基因,进行生物信息学分析及构建原核表达载体,对表达蛋白生物活性进行功能验证,并采用荧光定量PCR分析HMGR在油橄榄不同生长阶段的表达量。结果表明:克隆出油橄榄HMGR基因家族的三个基因,分别命名为Oe HMGR1、Oe HMGR2、Oe HMGR3,m RNA ORF的长度分别为1 713 bp、1 773 bp、1 737 bp,编码570、590、578个氨基酸;基因编码蛋白均有2个跨膜区及HMGR催化活性的结构域,不含信号肽;构建了原核表达载体p ET30b(+)-Oe HMGR,转入到大肠杆菌BL21中成功表达,3个重组酶蛋白分子量大小均在66.2~68.0 k D之间,分离纯化重组蛋白进行功能验证,GC-MS检测表明该蛋白具有HMGR催化活性功能;荧光定量PCR分析表明该家族基因在果实和叶片中表达量较高,而在根、茎、花中表达量较低,在开花后45 d、90 d、120 d表达量较低,但在花后165 d表达量上升至较高水平。该研究为进一步鉴定Oe HMGR的功能及油橄榄萜类物质的合成生物学研究奠定基础。     

SGTA基因及其蛋白的生物信息学分析

[目的]对SGTA基因及其蛋白的结构和特征进行生物信息学分析,为研究SGTA与肿瘤形成和发展的相关性提供理论基础。[方法]运用生物信息学数据库和软件对SGTA基因的结构、单核苷酸多态性位点(SNP)、SGTA基因与其他基因的相互作用网络、SGTA蛋白的理化性质、二级结构、蛋白结构域、蛋白翻译后修饰、蛋白质之间相互作用网络进行分析。[结果]人SGTA基因有5种可变剪接产物,编码区存在78个SNP位点,其中错义突变31个,无义突变1个。人SGTA蛋白由313个氨基酸组成,是稳定性不高的亲水蛋白,α-螺旋是其主要二级结构元件,属于TRP超家族,预测有3个磷酸化激酶修饰位点和数个潜在泛素化修饰位点。与SGTA存在相互作用的基因和蛋白多数与维持体内蛋白质稳定的分子伴侣功能相关。[结论]SGTA基因及其蛋白的生物信息学分析为进一步实验研究其在肿瘤形成和发展中的地位及调控机制奠定了基础。     

Marc-145细胞源DDX6基因的克隆及生物信息学分析

[目的]克隆并生物信息学分析Marc-145细胞源DDX6基因。[方法]根据Gen Bank预测的猴源DDX6基因序列(XM_008021118)设计合成特异性引物,通过RT-PCR从Marc-145细胞中扩增DDX6基因CDS区并进行克隆和生物信息学分析。[结果]Marc-145细胞源DDX6基因CDS全长1 452 bp,编码483个氨基酸。DDX6蛋白有4个基序,含有DEAD-like解旋酶超家族结构域和C端结构域。二级结构主要以α-螺旋(37. 27%)和无规则卷曲(36. 44%)为主。同源性及系统进化树分析结果表明Marc-145细胞源与人DDX6核苷酸同源性最高,亲缘关系最近。[结论]DDX6分子在同种属之间具有高度保守性,提示Marc-145细胞源DDX6可能与人源DDX6分子具有相似的功能和作用。     

狗Toll样受体5基因的克隆与序列分析

[目的]克隆狗TLR5基因,应用生物信息学软件对其进行结构和功能的预测分析。[方法]依据Gen Bank中已公布的狗TLR5基因的CDS区设计出特异性引物。PCR扩增获得狗TLR5目的基因,并构建重组质粒p CR2.1-Dog TLR5,测序正确后应用生物信息软件分析其序列特征。[结果]克隆得到的基因序列与Gen Bank中登录的狗TLR5(NC 006620.3)的同源性高达99%。狗TLR5的ORF为2 577 bp,编码858个氨基酸,蛋白分子质量约94.675 7 k Da,理论等电点为8.57,不稳定系数为43.14,表明为不稳定蛋白。狗TLR5蛋白N端的前20个氨基酸构成了其信号肽序列。核苷酸序列同源性比对结果表明,狗的TLR5基因序列与大熊猫、雪豹、东北虎和猎豹TLR5基因同源性相对于其他比对物种较高,分别为78.7%、77.2%、76.8%和76.3%。[结论]成功克隆出狗TLR5基因,生物信息学分析表明狗TLR5基因与Toll样受体家族具有相似的结构特征。狗TLR5基因的成功克隆与序列分析为进一步研究其在分子免疫方面的作用机制奠定了基础。     

布鲁氏菌VirB5基因的原核表达及生物信息学分析

[目的]获得高效表达并且抗原性较好的VirB5蛋白,并分析其生物信息学功能。[方法]以羊种布鲁氏菌16M基因组为模板扩增VirB5基因,连接表达载体p ET-32a,并转化至大肠杆菌(DE3)中表达,用SDS-PAGE和Western Blot检测其免疫学特性,采用信息生物学方法对VirB5基因编码蛋白的理化性质、结构、保守结构域进行分析。[结果]成功克隆出VirB5基因,并在大肠杆菌中成功表达,SDS-PAGE和Western Blot证实表达重组蛋白对布鲁氏菌阳性血清具有反应原性,生物信息学方法推测VirB5基因可能在胞内运输功能方面发挥重要作用。[结论]成功克隆出717bp大小的VirB5基因,并在大肠杆菌中成功表达45 k Da大小的蛋白,具有良好的抗原性,且证明VirB5蛋白与布鲁氏菌的胞内运输相关。     

鳗弧菌flaE基因的克隆及蛋白结构分析

[目的]:克隆鳗弧菌flaE基因并分析其蛋白结构,为研究该蛋白的生物学功能及免疫原性奠定基础。[方法]通过PCR方法对鳗弧菌flaE基因进行扩增,利用生物学软件对其序列及蛋白质结构进行分析。[结果]所得flaE基因的大小为841bp,其开放阅读框长度为798 bp,编码262个氨基酸。蛋白分子质量为28 411.4,理论等电点p I为5.70,脂肪系数为81.60,不稳定系数为31.81;为疏水性蛋白;没有信号肽和跨膜螺旋结构;保守区结构域属于flagellin家族;二级结构中以α螺旋为主,其次是无规则卷曲和β片层,少量β转角;三级结构与3k8v.1.A的结构模型相似率为90%。[结论]成功克隆了鳗弧菌flaE基因,Gen Bank登录号为KM091934。