一种新型(S)-羰基还原酶的克隆及其功能表达

【目的】从近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCC M203011)基因组中钓取新型(S)-羰基还原酶基因(scrⅡ),对其生物转化手性醇的功能进行了验证。【方法】采用PCR的方法,从C.parapsilosis基因组中扩增出一段可能的羰基还原酶基因scrⅡ。以构建的重组菌Escherichia coli BL21/pET28a-scrⅡ为生物催化剂,2-羟基苯乙酮为底物进行催化反应,经HPLC分析,计算终产物的光学纯度和产率,确定了转化反应的最适温度和pH值。【结果】scrⅡ基因全长为840bp,编码279个氨基酸,与已报道的(S)-羰基还原酶基因scr的一致性为85%。氨基酸序列分析表明SCRⅡ具有典型短链醇脱氢酶的功能域:辅酶结合区域Thr40-Gly41-(X)3-Gly45-X-Gly47和催化三联体结构Ser172-(X)n-Tyr187-(X)3-Lys191。在30℃,0.1mmol/LIPTG的诱导下,(S)-羰基还原酶(SCRⅡ)在E.coli中过量表达。以10%(w/v)的重组菌为催化剂,高浓度(6g/L)2-羟基苯乙酮为底物,在最适反应温度35℃和pH5.5的条件下,转化产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度高达99.1%e.e.,产率为89.6%。与(S)-羰基还原酶SCR相比较,底物浓度提高了一倍,产物的光学纯度和产率分别提高了10%和28%。【结论】采用分子克隆技术分离出新型羰基还原酶SCRⅡ的编码基因,该酶的发现为手性醇的高效制备奠定了坚实的研究基础。     

发状念珠藻醛酮还原酶基因NfAKR的克隆与表达

以发状念珠藻细胞为试材,采用PCR技术克隆了醛酮还原酶基因的开放阅读框(ORF)序列,命名为NfAKR。对基因序列特征进行了生物信息学分析,根据其编码氨基酸序列预测了NfAKR蛋白的三维结构,同时探讨了PEG-6000胁迫下NfAKR的表达特性。结果表明:NfAKR基因的编码序列长912bp,编码304个氨基酸,预测其编码蛋白的相对分子量为33.51kD,理论等电点为4.94,具有醛酮还原酶超家族保守结构域。NfAKR蛋白主要由10个α-螺旋和11β-折叠组成,中间形成一个疏水穴,作为酶的催化活性中心。NfAKR与点形念珠藻处在同一进化枝上,具有较近的亲缘关系。qRT-PCR分析显示,PEG-6000胁迫下NfAKR基因上调表达,当PEG-6000浓度为8%时,其相对表达量为5.66并达到峰值。依据NfAKR基因响应干旱胁迫上调表达的特性,推测醛酮还原酶可能参与发状念珠藻抵御干旱胁迫过程。     

葡萄醛酮还原酶(AKR)基因家族的鉴定与表达分析

为明确AKR基因在葡萄非生物胁迫中的作用,利用生物信息学方法对葡萄AKR基因家族(VvAKRs)进行了全基因组鉴定,并验证其在非生物胁迫下的表达规律。结果表明：(1)该基因家族在葡萄基因组中有9个成员,主要分布在5条染色体上;氨基酸残基在275~2 686 aa之间,理论等电点在5.1~9.1之间。(2)系统进化分析表明,该基因家族分为6个亚族,第6亚族VvAKR家族成员最多。(3)密码子偏好性分析结果表明,葡萄AKR基因家族密码子偏好性较弱。(4)共线性分析表明,葡萄9个AKR基因中只有VvAKR8和VvAKR9之间存在共线性关系。(5)qRT PCR分析结果显示,葡萄AKR家族基因在根、茎、叶不同组织中对激素和非生物胁迫的响应程度有差异。非生物胁迫下,VvAKR1、VvAKR3、VvAKR8和VvAKR9基因在葡萄根、茎、叶组织中表达量较高;激素处理下,根组织中VvAKR3、VvAKR6和VvAKR8基因在ABA、MeJA、SA处理下表达量较高;茎组织中VvAKR3基因在NAA、GA₃处理下表达量较高;叶组织中VvAKR1基因在各激素处理下表达量都较高。研究认为,葡萄AKR基因家族在响应葡萄非生物胁迫时发挥着不同的作用,为葡萄抗逆性研究提供了一定的理论依据。     

一种新型醛糖还原酶抑制剂的合成(Ⅱ)

以对硝基苯甲酸为原料,先制成酰氯,然后经酰化,还原反应制得中间产物对氨基苯甲酰甘氨酸,再与乙酰水杨酰氯进行酰化反应,合成一种新型醛糖还原酶抑制剂—对乙酰水杨酰胺基苯甲酰甘氨酸。     

(R)-、(S)-羰基还原酶在酿酒酵母中的表达和亚细胞定位

【目的】将增强型荧光蛋白标记的(R)-和(S)-羰基还原酶于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae W303-1A)细胞中表达,分析荧光蛋白表达谱,确定两种酶在细胞中的功能分布和亚细胞定位。【方法】采用SOE-PCR法克隆出增强型荧光蛋白与(R)-和(S)-羰基还原酶的融合基因,构建到真核表达载体pYX212中,电击转化酵母细胞,以荧光蛋白为筛选标志,观察两种酶在酵母细胞中的表达和分布。【结果】激光扫描共聚焦显微观察表明(R)-和(S)-羰基还原酶多定位于细胞内膜和细胞质中稳定表达,少数成点状分布于细胞中央。根据荧光强度可知(S)-羰基还原酶的表达水平明显高于(R)-羰基还原酶。生物转化结果显示融合型(R)-和(S)-羰基还原酶催化底物2-羟基苯乙酮,分别获得(R)-和(S)-苯基乙二醇,前者产物的光学纯度和产率为86.6%和70.4%,后者产物的光学纯度和产率分别为92.3%和81.8%。【讨论】荧光蛋白与酶的融合没有改变靶蛋白的分子构象与生物活性,酿酒酵母工程菌较重组大肠杆菌具有更明显的生物功能优势,该研究为羰基还原酶蛋白的功能表达调控与亚细胞定位的可视化研究奠定了坚实的基础。     

一种新型醛糖还原酶抑制剂的合成

以对硝基苯甲酸为原料,经氯化、酰化、还原制得对氨基苯甲酰甘氨酸,再与苯甲酰氯进行酰化反应,合成了一种新型醛糖还原酶抑制剂——对苯甲酰胺基苯甲酰甘氨酸。     

拆分获得(R)-酮基布洛芬酯酶基因的筛选、克隆与表达

以自筛选出的具有一定不对称拆分外消旋酮基布洛芬氯乙酯能力的野生菌Bacillus megaterium NK13为材料,通过构建其基因文库,筛选得到一个阳性克隆重组子pUC18-NK-HYD3。分析测序结果发现外源片段中包含一段完整的741 bp的开放阅读框,其编码的蛋白中含有酯酶的GXSXG保守序列。经在NCBI的BLAST系统中比对,证明该酯酶基因属于首次发现(GenBank Accession Number: GU143552)。将酯酶基因克隆到载体pET21b(+)中,转化E. coli BL21(DE3),经IPTG诱导后在宿主菌得到表达。SDS-PAGE电泳检测证明该酯酶蛋白分子量约为28 kDa。TLC和HPLC检测结果显示,该酯酶优先水解(R)-型底物,在重组菌菌液体系,转化率为15%时,酯酶拆分获得(R)-酮基布洛芬的过量值(e.e.%)最高,达62.74％;改用重组菌湿菌体的PBS体系后,在转化率为10%~50%时,酯酶拆分获得(R)-酮基布洛芬的过量值(e.e.%)一直保持在73%~76%之间。     

醛酮还原酶家族1的C1亚型在胃癌的表达及其作用探讨

目的:研究AKR1C1(Aldo-keto reductase family 1 member C1)在胃癌中的表达,并初步探讨其在胃癌发生和发展中的作用。方法:采用胃癌组织芯片和免疫组化分析方法,检测60例胃癌患者癌组织及癌旁正常组织AKR1C1的表达;实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹western blot检测胃癌细胞株SGC-7901 AKR1C1的表达;在胃癌细胞株SGC-7901中转染沉默AKR1C1的sh RNA质粒及空质粒,MTT比色法检测各实验组细胞增殖。结果:组织芯片和免疫组化结果显示,与正常组织相比,胃癌组织中AKR1C1呈高表达;实时荧光定量PCR和western blot观察可以发现胃癌细胞株SGC-7901高表达AKR1C1;MTT比色法检测发现,转染沉默AKR1C1的sh RNA质粒组与空质粒对照组相比,SGC-7901细胞的增殖受到明显抑制,差异有统计学意义(P0.05)。结论:AKR1C1与癌细胞的增殖有关,可能是其参与或间接参与了癌细胞的生长周期,为胃癌的发生及细胞增值提供了新的研究思路和方向。     

不对称还原大位阻二芳香基甲酮的羰基还原酶的基因克隆及性质分析

由于二芳香基甲酮的位阻大及羰基两侧的取代基差异性较小,对其进行不对称还原是生物催化中具有挑战性的难题之一.文中通过对毕赤酵母GSl15基因组序列的分析,发现了一个潜在羰基还原酶基因pascr.将该基因克隆、表达在大肠杆菌Rosetta2 (DE3)中,通过Ni-NTA对重组蛋白进行了分离纯化,并对酶的性质进行了研究.PasCR专一性利用NADPH作为辅酶,其最适反应pH为6.5;最适反应温度为35℃;凝胶层析实验结合SDS-PAGE分析表明PasCR在溶液中以二聚体形式存在.PasCR能够不对称还原位阻较大的二芳香基甲酮类化合物,如4-甲基二苯甲酮、4-氯二苯甲酮、2-氯二苯甲酮等,对4-甲基二苯甲酮的还原产物的ee值达到了85％.     

Morganella morganii J-8羰基不对称还原酶的分离纯化及性质研究

由本实验室筛选得到的摩尔摩根氏菌J-8菌株可将底物1-苯基-2-甲氨基丙酮专一性地转化为d-伪麻黄碱。以M.morganiiJ-8为出发菌株,菌体超声破碎后,经硫酸铵沉淀、Phenyl Superose疏水柱层析、DEAD阴离子柱层析和非变性凝胶电泳四步纯化获得电泳纯羰基不对称还原酶。亚基分子质量为42.5kD,高效液相色谱分析酶的分子质量约为84.1kD,初步认为该酶为二聚体蛋白。对所得到的部分纯化酶的酶学性质做了初步研究,纯酶进行基质辅助激光解析电离-飞行质谱分析,比对结果显示为与亮氨酸脱氢酶蛋白有很高相似性。     

一种新型锌指蛋白基因——人ZNF313的克隆、定位及表达(英文 )

运用正常可育男性和无精症病人睾丸组织的mRNA差异显示和cDNA末端快速扩增 (RACE)等方法 ,从人睾丸组织中分离了一个同时含有指环结构和C2 H2 结构域的新型锌指蛋白基因———人ZNF3 13。运用荧光原位杂交 (FISH)方法 ,将该基因定位到人染色体 2 0q13。该基因含 6个外显子 ,编码 2 2 8个氨基酸。基因组结构分析显示 ,外显子 6含有的 2个加尾信号 ,产生 2种不同的 3′端非翻译区。Northern杂交及多组织RT PCR的结果显示该基因含有 0 .75kb和 2 .4kb两种转录本 ,其中0 .75kb转录本在正常睾丸中高表达 ,而其他组织、无精症患者及胎儿睾丸组织中该基因低表达。结果提示 :人ZNF3 13基因对精子发生和男性可育性可能起重要作用     

甘蔗类异黄酮还原酶(IRL)基因的克隆与表达分析

采用RT-PCR技术从甘蔗中克隆So IRL基因,用生物信息学方法对获得的氨基酸序列进行分析,利用荧光定量PCR技术研究So IRL基因在甘蔗不同组织和不同胁迫条件下的表达特性。结果表明,克隆获得甘蔗So IRL,Gen Bank登录号为KF808324。该c DNA全长1 169 bp,含有1个927 bp的完整开放阅读框(ORF),编码309个氨基酸。系统进化树分析显示,甘蔗So IRL与玉米的IRL蛋白亲缘关系较近。q RT-PCR分析表明So IRL在甘蔗根、茎、叶中均有表达;在RSD病菌及低温(4℃)、聚乙二醇(PEG)、Na Cl和脱落酸(ABA)4种非生物胁迫下均被诱导表达,但表达模式不同。说明该基因可能参与甘蔗应答RSD过程,并可能在非生物胁迫中也发挥了作用。     

兽疫链球菌透明质酸合成相关基因hasB的克隆以及性质研究

透明质酸是链球菌荚膜的主要组成部分,有着重要的生理功能。UDP-葡萄糖脱氢酶(HasB)是透明质酸合成中的一个关键酶,而C类链球菌的UDP-葡萄糖脱氢酶编码基因(hasB)尚未被克隆。通过hasB基因的上下游序列设计引物从兽疫链球茵的基因组中克隆出一段序列,测序结果显示其包含一个由1206个碱基组成的开放阅读框,所编码的蛋白序列同化脓链球菌和乳链球菌的UDP-葡萄糖脱氢酶蛋白序列分别有63．1％和70．6％的相似性。将这段基因置于T7启动子下,并在大肠杆菌中进行表达,能够得到一个约47kDa的蛋白,酶活测定显示其具有UDP-葡萄糖脱氢酶活性。这些结果表明所克隆的基因是兽疫链球菌的UDP-葡萄糖脱氢酶编码基因。     

一种不对称水解（R,S）-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯的新酯酶基因的克隆表达和酶学性质研究

本文将来自反硝化无色杆菌Achromobacterdenitrificans1104的酯酶基因EHest,转化大肠杆菌中,成功表达了具有不对称水解农药甲霜灵的中间体(R,S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯( MAP )活性的酯酶EHesterase。用重组酯酶EHesterase催化MAP 的水解,底物浓度50 g/L,反应1h的转化率29.5%,产物( R-酸)的eep 是85.1%。该酶的最适反应pH和温度分别为9.0和50℃,在50℃以下和pH5~9之间具有较好的稳定性。该酶水解MAP 的米氏动力学参数Vm、Km 分别是0.733 g/(L·min)和7.49 g/L。加入10%DMSO对酶EHesterase的立体选择性和催化速度有一定的促进作用。 Cu2+、Fe3+对酶活有明显抑制作用。该酶水解MAP 的活性与水解p-对硝基苯乙酸酯的活性数量级相当,是水解橄榄油活性的333倍。     

重组大肠杆菌表达氧化还原酶不对称还原2-羟基苯乙酮的研究

将来源于7种微生物的13个氧化还原酶基因分别与表达载体pET21c连接后,转化入Escherichia coli BL21(DE3)中,得到13株重组菌.重组菌在IPTG诱导下进行表达,并对2-羟基苯乙酮进行不对称催化还原.研究发现,在17℃下诱导表达的重组酶比活明显高于30℃和37℃下诱导表达的比活.另外,来源于Ca...     

2,5-DKG还原酶Ⅱ基因的克隆和在大肠杆菌中的表达

参照文献上的2,5-二酮基-D-葡萄糖酸（简称2,5-DKG）还原酶II基因序列,合成两个引物序列并在两端加上EcoRI和BamHI两个酶切位点,抽提棒状杆菌SCB3058菌株的染色体为模板进行PCR反应,克隆得到2,5-DKG还原酶II基因,酶切验证与预期的结果相符合。将此片段克隆到pGEM-T载体上保存．将2,5-DKG还原酶II基因用EcoRI和BamHI内切酶切下,连接到pBV220载体上,构建成表达载体。42℃诱导不能得到稳定的蛋白表达条带和酶活力,测序发现基因的3’末端的原PCR引物外少合了一个碱基,终止密码子发生移码突变而消失。此外在5’端的启始密码子ATG前有三个碱基与pBV220载体上的SD序列发生配对。据此,重新设计和合成了PCR引物,并用pBV220和pBL4载体构建了两个表达载体。42℃诱导表达均得到了稳定的表达条带和较高的酶活力．     

微水相中杏仁醇腈酶催化不对称合成(R)-氰醇的研究

利用气相色谱手性分析,研究了微水相中来源于杏仁的(R)-醇腈酶催化醛与HCN不对称合成(R)-氰醇.结果表明,反应时间、添加乙酸、反应介质、反应体系水活度、反应温度和底物的结构对醇腈酶反应均有显著影响.杏仁醇腈酶对芳香族、脂肪族和杂环族醛均有良好的催化作用.其中,苯甲醛为杏仁醇腈酶的最适作用底物,在低温（0～5℃）下,转化率和产物对映体过剩值均在99%以上.     

微水相中杏仁醇腈酶催化不对称合成(R)-氰醇的研究

利用气相色谱手性分析,研究了微水相中来源于杏仁的（R）－醇腈酶催化醛与HCN不对称合成（R）－氰醇,结果表明,反应时间,添加乙酸,反应介质,反应体系水活度,反应温度和底物的结构对醇腈醇反应均有显著影响,杏仁醇腈酶对芳香族,脂肪族和杂环族醛均有良好的催化作用,其中,苯甲醛为杏仁醇腈的最和达作用底物,在低温（0－5℃）下,转化率和产物对映体过剩值均为99％以上。     

近平滑假丝酵母(R)-羰基还原酶在大肠杆菌中的外泌表达及高效转化(R)-苯基乙二醇

克隆了近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)(R)-羰基还原酶基因rcr,构建胞外表达工程茵Escherichia coli BL21(DE3)/pET20b-rcr,实现了(R)-羰基还原酶在大肠杆菌中高效外泌表达,周质空间和发酵液酶的比活力分别达0.68 U/mg和0.26 U/mg,与大肠杆菌的胞内体系重组酶相比,酶的比活力提高了近两倍。为了更好地促进该重组酶的外分泌于大肠杆菌细胞外,通过添加温和型化学渗透剂甘氨酸,改善细胞壁的透性,(R)-羰基还原酶的活力提高至1.99 U,与添加甘氨酸前相比,酶活力提高了12.4倍,比活提高了4.3倍。浓缩后的发酵液催化2-羟基苯乙酮,产生(R)-苯基乙二醇,产率为88.1%,e.e.值为93.9%。与胞内重组酶相比,产率和光学纯度分别提高了44.4%和15.9%。本研究通过构建(R)-羰基还原酶的大肠杆菌分泌表达体系,大幅度提高了(R)-羰基还原酶的比活和生物转化手性醇的效率。