人p65真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建带Myc标签的人p65真核表达载体,对其在人宫颈癌He La细胞中的定位进行检测,并研究p65对核因子κB(NF-κB)转录活性的影响。方法:构建带Myc标签的p65真核表达载体pc DNA3.1-Myc-p65,质粒测序验证正确后脂质体法瞬时转染人胚肾HEK293T细胞,Western印迹鉴定p65的表达;细胞免疫荧光实验检测p65的亚细胞定位;重组质粒与NF-κB-Luc报告基因质粒共转染HEK293T细胞,加TNFα刺激后检测萤光素酶报告基因的活性。结果:测序结果证实pc DNA3.1-Myc-p65真核表达载体构建成功;脂质体法转染HEK293T细胞后检测到Myc-p65蛋白的表达;细胞免疫荧光实验显示Myc-p65蛋白定位于He La细胞的细胞质中,当加入TNFα刺激后大部分Myc-p65蛋白进入细胞核;萤光素酶活性检测结果显示,提高细胞内p65水平或加入TNFα刺激均可明显激活NF-κB信号通路的活性。结论:构建了带Myc标签的p65真核表达载体,并使其在HEK293T细胞中表达;正常情况下,Myc-p65蛋白定位于宫颈癌He La细胞的细胞质中,TNFα促进Myc-p65入核;Myc-p65能够以TNFα不依赖的方式激活NF-κB信号通路。pc DNA3.1-Myc-p65真核表达载体的构建,为进一步筛选NF-κB的相互作用蛋白及功能研究奠定了基础。     

带myc标签的人造血相关PBX相互作用蛋白真核表达载体的构建及其功能研究

目的:构建带myc标签的造血相关PBX相互作用蛋白(HPIP)的真核表达载体,获得myc-HPIP融合蛋白,并对其生物学功能进行初步检测。方法:以本实验室保存的pcDNA3.0-HPIP质粒为模板,采用PCR技术扩增HPIP编码序列,将其插入pXJ-40-myc载体,通过Western印迹检测表达情况;将重组质粒与空载体分别转染人肝癌HepG2细胞,通过Western印迹检测其对AKT、ERK信号通路中AKT、ERK磷酸化水平的影响。结果:双酶切和测序结果表明myc-HPIP真核表达质粒构建成功,转染HepG2细胞后表达了myc-HPIP融合蛋白;Western印迹证明myc-HPIP可升高AKT、ERK的磷酸化水平。结论:构建了带myc标签的人HPIP真核表达载体,为进一步研究HPIP在肿瘤发生发展中的功能奠定了基础。     

核输入蛋白α/β真核表达载体的构建及细胞内定位

目的:构建带有myc标签的核输入蛋白(importin)α/β的真核表达载体,转染人胚肾293T细胞并分析其表达。方法:以乳腺癌文库为模板PCR扩增核输入蛋白α/β基因,扩增产物插入真核表达载体p XJ-40-myc,经双酶切和测序鉴定;将空载体与重组质粒分别转染人胚肾293T细胞,通过Western印迹和免疫荧光技术检测核输入蛋白α/β的表达。结果:酶切鉴定与测序结果表明构建的myc-Importinα/β真核表达载体正确;Western印迹检测到重组质粒在293T细胞中的表达;免疫荧光检测到核输入蛋白α定位于细胞质和细胞核,而核输入蛋白β定位于细胞核。结论:构建了核输入蛋白α/β的真核表达载体,并确定了其在细胞中的表达定位。     

微管结合蛋白Tau磷酸化位点突变体的构建及鉴定

目的:构建带有Myc标签的Thr-213、Thr-235、Ser-404磷酸化位点突变为Ala的Tau蛋白真核表达质粒,并在真核细胞中表达Myc-Tau3m蛋白。方法:利用重组PCR方法得到Thr-213、Thr-235、Ser-404磷酸化位点突变为Ala的编码序列,将其插入经Bam HⅠ和KpnⅠ酶切的p XJ40-Myc表达载体,在人293T细胞中转入空载体和重组质粒,利用Western印迹检测其表达及功能。结果:测序和酶切结果证实Myc-Tau3m真核表达质粒构建成功,转染293T细胞后获得表达,表达产物可促进微管的乙酰化。结论:构建了Thr-213、Thr-235、Ser-404磷酸化位点突变的Myc-Tau3m真核表达载体,为进一步研究Tau蛋白磷酸化的生理机能奠定了基础。     

人KAT7基因促进雌激素受体α表达

目的:构建带有Myc标签的赖氨酸乙酰基转移酶(KAT7)的真核表达载体,获得Myc-KAT7融合蛋白,并检测其对雌激素受体α(ERα)表达的影响。方法:以本实验室保存的乳腺文库为模板,采用PCR技术从中扩增出人KAT7基因的编码序列,插入p XJ-40-Myc载体;将重组质粒与空载体分别转染人胚肾293T细胞,通过Western印迹检测转染细胞的表达情况,并提取总RNA采用q RT-PCR检测ERα的表达。结果:双酶切和测序结果表明Myc-KAT7真核表达质粒构建成功,转染293T细胞后Western印迹鉴定表明融合蛋白得到表达,q RT-PCR表明KAT7在转录水平能够促进ERα表达。结论:构建了带Myc标签的人KAT7真核表达载体,并发现KAT7对ERα的表达具有促进作用。     

携带Flag标签的人自噬相关蛋白4B的真核表达及功能鉴定

目的:构建携带Flag标签的人自噬相关基因4B(ATG4B)的真核表达质粒,获得Flag-ATG4B融合蛋白,并检测其与LC3的相互作用。方法:以本实验室保存的乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增获得ATG4B序列,并将其插入pc DNA3.0-Flag载体构建成重组质粒,转染HEK293T细胞后用Western印迹检测融合蛋白的表达,用免疫共沉淀检测ATG4B与LC3的相互作用。结果:菌液PCR和重组质粒的双酶切结果及测序均表明重组质粒构建成功,Western印迹表明融合蛋白在HEK293T细胞中获得表达,免疫共沉淀结果表明表达的ATG4B能与LC3结合。结论:构建了pc DNA3.0-Flag-ATG4B真核表达质粒,表达的ATG4B蛋白对LC3的切割至关重要,这为进一步研究ATG4B在自噬过程中的作用奠定了基础     

人LC3B基因的真核表达及鉴定

目的:构建带HA标签的重组人LC3B基因的真核表达载体,获得HA-LC3B融合蛋白,并初步检测其生物学功能。方法:从人乳腺文库中通过PCR技术扩增LC3B基因编码序列,将其插入pc DNA3.0-HA载体,获得HA-LC3B真核表达载体;将重组质粒与空载体分别转染人胚肾293T细胞,通过Western印迹检测转染细胞的表达情况,免疫共沉淀实验证实其生物学活性。结果:双酶切和测序结果表明HA-LC3B真核表达质粒构建成功,Western印迹表明重组质粒转染293T细胞后获得表达;免疫共沉淀实验显示HA-LC3B融合蛋白可以和Atg4B蛋白相互作用,具有较好的生物学活性。结论:在真核表达系统中表达了带HA标签的人LC3B,为进一步研究细胞自噬奠定了基础。     

PI3K/AKT/NF-κB轴调控胃癌细胞HGC-27增殖

目的:构建磷酸化AKT1(Ser473)位点突变真核表达载体,并检测PI3K/AKT/NF-κB信号通路轴对胃癌细胞增殖的影响。方法:以带有pcDNA3.0-Flag标签的AKT1质粒为模板,扩增出AKT1(Ser473A)(丝氨酸突变成丙氨酸)位点突变编码序列,将其插入pcDNA3.0-Flag载体中,双酶切和测序验证后瞬时转染人胚肾293T细胞,Western印迹检测其表达情况;将突变质粒与空载体分别转染胃癌细胞HGC-27,通过Western印迹检测其下游基因核转录因子κB(NF-κB)在蛋白水平的变化;通过CCK-8法检测对细胞生长曲线的影响。结果:双酶切和测序结果表明,pcDNA3.0-Flag-AKT1(Ser473A)真核表达质粒构建成功;转染293T细胞后获得表达;转染胃癌细胞HGC-27后,Western印迹验证去磷酸化AKT1(Ser473A)可下调NF-κB的蛋白水平(P0.01);细胞生长曲线结果显示,转染pcDNA3.0-Flag-AKT1(Ser473A)较空载体细胞生长慢(P0.01)。结论:PI3K/AKT/NF-κB信号通路轴在胃癌发生发展过程中发挥重要作用。     

人酪蛋白激酶1激酶区真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建带Flag标签的酪蛋白激酶1α(CK1α)激酶区截短突变体CK1α(1-285aa)的真核表达载体,获得其表达产物,并验证该激酶区与已知相互作用蛋白Myc-Cdc25A之间的相互作用。方法:用PCR技术从人全长CK1α真核表达载体中扩增CK1α(1-285aa),将其克隆到Flag载体中,将重组质粒转染人胚肾293T细胞,Western印迹检测其在人293T细胞中的表达情况,免疫共沉淀分别检测Flag-CK1α全长、Flag-CK1α(1-285aa)与Myc-Cdc25A的相互作用。结果:双酶切和基因测序鉴定显示Flag-CK1α(1-285aa)真核表达载体克隆构建成功;Western印迹结果表明Flag-CK1α(1-285aa)转染人胚肾细胞293T细胞后获得表达;免疫共沉淀结果显示Flag-CK1α全长、Flag-CK1α(1-285aa)与Myc-Cdc25A在蛋白质水平上具有相互作用,证实其具有生物学活性。结论:构建了Flag-CK1α(1-285aa)的真核表达载体,为进一步探讨Flag-CK1α激酶区对细胞信号通路的调节作用奠定了实验基础。     

人MDM2基因真核表达载体的构建及其与p53的相互作用

目的:构建带Flag标签的MDM2真核表达载体,并检测MDM2与p53的相互作用。方法:从人乳腺文库中PCR扩增MDM2编码序列,将其插入pcDNA3.0-Flag载体,转染293T细胞后用Western印迹检测其在293T细胞中的表达,并通过免疫共沉淀实验检测MDM2与p53的相互作用。结果:双酶切和测序结果表明,Flag-MDM2真核表达载体构建成功,转染293T细胞后成功表达;免疫共沉淀实验证明Flag-MDM2与p53存在相互作用。结论:构建了带Flag标签的人MDM2真核表达载体,并检测了MDM2与p53之间的相互作用,为研究MDM2的功能奠定了基础。     

人自噬相关基因5真核表达载体的构建及表达鉴定

目的:构建带Flag标签的自噬相关基因5(ATG5)的真核表达载体,获得Flag-ATG5融合蛋白。方法:以人乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增人ATG5编码序列,将其插入pc DNA3-Flag载体,转染人胚肾293T细胞后,Western印迹检测其表达情况;将该重组质粒与ATG12表达质粒共转染293T细胞,通过免疫共沉淀法检测2个蛋白的相互作用。结果:Flag-ATG5真核表达质粒构建成功,转染293T细胞后融合蛋白获得表达,其相对分子质量约33×103;Flag-ATG5可与Myc-ATG12结合。结论:构建了带Flag标签的人ATG5真核表达载体,为进一步研究ATG5在自噬中的功能奠定了基础。     

比格犬ERβ1293基因真核载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达和定位

目的 观察比格犬Myc 标签ERβ1293重组真核表达载体在HEK293T细胞中的表达及定位.方法 以pEGFP-N1-ERβ1293重组真核表达载体为模板,PCR保真酶扩增得到ERβ1293基因编码区全长.Myc标签ERβ1293重组真核载体瞬时转染HEK293T细胞,运用蛋白质印迹技术（Western blotting）和间接免疫荧光技术（indirect immunofluorescence,IF）鉴定pcDNA3.1-Myc-ERβ1293在HEK293T细胞中的表达和定位情况.结果 成功构建pcDNA3.1-Myc-ERβ1293重组真核表达载体,转染至HEK293T细胞中.Western blotting检测有蛋白条带表达,共聚焦显微镜下观察IF处理后的转染细胞,荧光定位于细胞质.结论 前期实验得到比格犬ERβ剪切异构体ERβ1293编码区序列,缺失第四外显子,导致其与配体结合能力减弱或消失,因此目的 基因编码蛋白定位在细胞中发生变化.     

人白细胞介素2受体β(IL-2RB)基因真核表达及与JAK1的相互作用的检测北大核心

[目的]构建含人白介素2受体β(IL-2RB)基因的真核表达质粒p ENTER-IL-2RB-His,并在293T中进行真核表达,并用免疫共沉淀检测JAK1与IL-2RB在细胞内的相互作用。[方法]在Hela细胞中提取人总RNA,通过RT-PCR获得人IL-2RB的基因全长,并将其克隆至真核表达载体p ENTER-His中。经PCR克隆,双酶切、测序鉴定后,将重组质粒p ENTER-IL-2RB-His转染至293T细胞中。免疫印迹法检测不同时间点的IL2RΒ蛋白(24 h、36 h、48 h)在293T细胞中的表达,用免疫共沉淀检测JAK1和IL-2RB蛋白之间的相互作用。[结果]经PCR克隆、双酶切、测序鉴定质粒克隆正确。免疫印迹可见61 k Da的目的蛋白。共同转染JAK1和IL-2RB的质粒,免疫印迹可见分别为133 k Da和61 k Da的目的条带。[结论]成功获得IL-2RB基因全长,成功构建p ENTER-IL-2RB-His真核表达质粒,并在293T细胞中成功表达,随着时间的推移其表达量增高。免疫共沉淀可以检测到JAK1和IL-2RB两者的蛋白相互作用,这为下一步研究JAK1和IL-2RB这一对蛋白的相互作用的作用方式及作用机制奠定了基础。     

人白细胞介素10受体α基因真核表达及与JAK1蛋白的相互作用的检测

构建含人白介素10受体α(IL-10RA)基因的真核表达质粒p ENTER-IL-10RA-His,并在HEK293中进行真核表达,并用免疫共沉淀检测JAK1与IL10RA在细胞内的相互作用。在He La细胞中提取人总RNA,通过RT-PCR获得人IL10RA的基因全长,并将其克隆至真核表达载体p ENTER-His中。经PCR扩增、双酶切、测序鉴定后,将重组质粒p ENTER-IL-10RA-His转染至HEK293细胞中。免疫印迹法检测IL-10RA蛋白在HEK293细胞中的表达。结果显示,经PCR扩增和双酶切,测序鉴定质粒克隆正确。免疫印迹可见63 k D的目的蛋白。共同转染JAK1和IL-10RA的质粒,免疫印迹可见分别为133 k D和63 k D的目的条带,免疫共沉淀鉴定了JAK1和IL-10RA的相互作用。IL-10RA基因成功构建在p ENTER-His中,并在HEK293细胞中成功表达,并成功共转染JAK1和IL-10RA质粒,免疫共沉淀检测两者的相互作用。这为JAK1和IL-10RA相互作用的机制研究奠定基础。     

人自噬相关基因12真核表达载体的构建及表达

目的:构建带myc标签的自噬相关基因12(ATG12)的真核表达载体,获得myc-ATG12融合蛋白。方法:以人乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增人ATG12编码序列,将其插入p XJ-40-myc载体构建重组质粒,转染人胚肾293T细胞,Western印迹检测表达情况;将重组质粒与ATG3表达质粒共转染293T细胞,免疫共沉淀法检测二者的相互作用。结果:myc-ATG12真核表达质粒构建成功,转染293T细胞后融合蛋白获得表达,其相对分子质量约17×103,可与Flag-ATG3结合。结论:构建并表达了带myc标签的人ATG12真核表达载体,为进一步研究ATG12在自噬中的功能奠定了基础。     

人CCAAT增强子结合蛋白β抑制骨肉瘤细胞增殖

目的:构建带Myc标签的CCAAT增强子结合蛋白β(C/EBPβ)的真核表达载体,并检测其对骨肉瘤细胞增殖的影响。方法:应用PCR技术从人乳腺文库中扩增C/EBPβ全长编码区基因,并克隆到pXJ-40载体中;将重组质粒转染人胚胎肾293T细胞,采用SDS-PAGE和Western印迹鉴定蛋白表达;另将重组C/EBPβ质粒转染入骨肉瘤细胞系U20S,生长实验检测其对肿瘤细胞增殖的影响。结果:基因测序和双酶切鉴定表明,Myc-C/EBPβ真核表达质粒构建成功;SDS-PAGE和Western印迹结果显示,Myc-C/EBPβ转染人胚胎肾293T细胞后获得表达;生长实验证明C/EBPβ具有抑制骨肉瘤细胞增殖的功能。结论:构建了Myc-C/EBPβ的真核表达载体,为全面了解C/EBPβ的生物学功能及调控机理奠定了基础。     

人白细胞介素2受体β(IL-2RB)基因真核表达及与JAK1的相互作用的检测

[目的]构建含人白介素2受体β(IL-2RB)基因的真核表达质粒p ENTER-IL-2RB-His,并在293T中进行真核表达,并用免疫共沉淀检测JAK1与IL-2RB在细胞内的相互作用。[方法]在Hela细胞中提取人总RNA,通过RT-PCR获得人IL-2RB的基因全长,并将其克隆至真核表达载体p ENTER-His中。经PCR克隆,双酶切、测序鉴定后,将重组质粒p ENTER-IL-2RB-His转染至293T细胞中。免疫印迹法检测不同时间点的IL2RΒ蛋白(24 h、36 h、48 h)在293T细胞中的表达,用免疫共沉淀检测JAK1和IL-2RB蛋白之间的相互作用。[结果]经PCR克隆、双酶切、测序鉴定质粒克隆正确。免疫印迹可见61 k Da的目的蛋白。共同转染JAK1和IL-2RB的质粒,免疫印迹可见分别为133 k Da和61 k Da的目的条带。[结论]成功获得IL-2RB基因全长,成功构建p ENTER-IL-2RB-His真核表达质粒,并在293T细胞中成功表达,随着时间的推移其表达量增高。免疫共沉淀可以检测到JAK1和IL-2RB两者的蛋白相互作用,这为下一步研究JAK1和IL-2RB这一对蛋白的相互作用的作用方式及作用机制奠定了基础。     

人乳腺癌耐药蛋白基因对人喉癌Hep-2细胞生长的影响

目的:构建携带Myc标签的乳腺癌耐药蛋白(BCRP)基因的真核表达载体,获得Myc-BCRP融合表达蛋白,检测其对喉癌细胞Hep-2生长的影响。方法:采用PCR技术从乳腺文库中扩增人BCRP基因,并将其正确插入Myc载体;将重组质粒与空载体分别转染喉癌细胞Hep-2后,Western印迹检测表达情况,并进行生长曲线实验。结果:双酶切和测序鉴定表明Myc-BCRP真核表达质粒构建成功;转染Hep-2细胞后获得表达,生长曲线实验结果表明,BCRP可促进喉癌细胞生长。结论:构建了携带Myc标签的人BCRP基因的真核表达载体,重组载体能在Hep-2细胞中表达,且能促进该细胞的生长。本实验为进一步研究BCRP在喉癌中的功能奠定了基础。     

人激活转录因子5基因真核表达载体的构建及其生物学功能研究

目的:构建带myc标签的人激活转录因子5(ATF5)的真核表达载体,获得myc-ATF5融合蛋白,并对其生物学功能进行初步检测。方法:以本实验室保存的带有XL5标签的ATF5质粒为模板,采用PCR技术扩增ATF5编码序列,将其插入pXJ-40-myc载体中,Western印迹检测其表达;将重组质粒与空载体分别转染人胚肾293T细胞,通过Western印迹和qRT-PCR检测其下游基因哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在蛋白和mRNA水平的变化。结果:双酶切和测序结果表明myc-ATF5真核表达质粒构建成功,转染293T细胞后获得表达;Western印迹和qRT-PCR证明myc-ATF5可升高mTOR的转录和蛋白水平。结论:构建了带myc标签的人ATF5真核表达载体,为进一步研究ATF5在自噬中的功能奠定了基础。     

带绿色荧光蛋白标签的人细胞分裂周期蛋白25同源蛋白的真核表达及其生物学功能研究

目的:构建带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标签的人细胞分裂周期蛋白25同源蛋白C(cdc25c)基因的真核表达载体pEGFP-cdc25c,并检测其在人胚肾293T细胞中的表达定位情况及生物学功能。方法:采用PCR技术从实验室已有质粒中扩增人cdc25c基因,并将其克隆到pEGFP-C1载体中;将重组质粒转染人胚肾293T细胞,Western印迹检测转染细胞的表达情况,荧光显微镜观察cdc25c蛋白在细胞中的定位,并利用cdc2 Tyr15位特异性抗体验证EGFP-cdc25c作为磷酸酯酶的生物学功能。结果:双酶切和测序鉴定表明,pEGFP-cdc25c真核表达质粒构建成功;转染293T细胞后获得表达,在荧光显微镜下,表达阳性的细胞呈绿色,并定位于细胞质;Western印迹结果表明,EGFP-cdc25c能增加cdc2 Tyr15位的磷酸化水平,起到拮抗内源性cdc25c的功能。结论:构建了带EGFP标签的人cdc25c基因真核表达载体,该载体能够在哺乳动物细胞293T中表达,表达产物定位于细胞质;EGFP-cdc25c能够发挥显性负性作用,为深入研究cdc25c的生物学功能奠定了重要基础。