环介导等温扩增联合横向流动试纸条快速检测创伤弧菌检测方法的建立

环介导等温扩增技术(LAMP)与横向流动试纸条(LFD)检测联合应用,建立了一种新的快速、便捷的创伤弧菌检测方法。针对创伤弧菌的外膜蛋白TolC基因设计6条特异性引物和1条异硫氰酸荧光素(FITC)标记的探针。生物素标记的LAMP扩增产物能够特异性地与FITC标记的探针杂交,杂交产物经LFD检测。优化后的扩增温度和时间为63℃反应35 min,加上细菌基因组DNA提取步骤,完成检测仅需要80 min。LAMP-LFD方法可特异性地检出创伤弧菌,对哈维氏弧菌等9种水产品常见病原菌的检测均呈阴性;对纯细菌培养物的检测灵敏度为3.7×102 CFU/mL或7.4 CFU/反应,是利用外引物建立的常规PCR检测的100倍。结果表明,该方法能够准确、快速、灵敏地检出创伤弧菌,可应用于创伤弧菌污染的水产品的检测。     

环介导等温扩增联合横向流动试纸条可视化检测志贺氏菌

【目的】将环介导等温扩增技术(LAMP)与横向流动试纸条(LFD)联合应用,建立一种可应用于志贺氏菌快速检测的LAMP-LFD技术。【方法】以福氏志贺氏菌的侵袭性质粒抗原H(ipa H)基因为检测靶标设计3对特异性引物(其中上游内引物Sfl-ipa H-FIP由生物素标记),进行LAMP反应;同时设计1条异硫氰酸荧光素(FITC)标记的探针Sfl-ipa H-HP,与获得的LAMP产物进行特异性杂交,杂交产物经LFD完成检测。【结果】优化后的LAMP反应条件为63°C 40 min,加上LFD结果判读共需50 min。LAMP-LFD方法能够特异性检测出福氏志贺氏菌,而对肠炎沙门氏菌等其它4种导致腹泻的致病菌和创伤弧菌等5种常见食物源性致病菌,以及4株不同大肠杆菌的检测结果呈阴性。该方法针对福氏志贺氏菌的检测灵敏度为1.0×10~2 CFU/m L或4 CFU/反应,针对人工污染鲤鱼肠组织的检测灵敏度是5.0×10~2 CFU/m L,是以LAMP外引物Sfl-ipa H-F3/Sfl-ipa H-B3的常规PCR方法的100倍。【结论】建立的LAMP-LFD技术具有操作简单、检测快速准确、检测成本低等优点,有望在志贺氏菌的常规监测和即时检测中被普及使用。     

一种检测储存喷气燃料中特征真菌的新方法——LAMP-LFD

利用环介导等温扩增(LAMP)与横向流动试纸快速检测技术(LFD)相结合,以Amorphotheca resinae的18S rRNA基因为靶序列,设计1套LAMP引物,建立了反应温度63℃、时间35 min。用喷气燃料中曾发现的4株真菌和A.resinae作为特异性试验菌株,LAMP-LFD法检测只有A.resinae呈阳性反应。A.resinae基因组DNA检测灵敏度为26 fg/μL;用已建立的LAMP-LFD方法对9个喷气燃料样品进行检测,其中有6个样品被检出存在A.resinae。结果表明该方法用于快速检测喷气燃料中的A.resinae耗时短、操作简便、特异性强、灵敏度高,有望用于为检测喷气燃料中特征真菌A.resinae的新方法。     

VHH/TLH溶血素基因在海洋弧菌中分布的研究

哈维氏弧菌(V.harveyi)的VHH溶血素是对海水养殖鱼类的潜在致病因子。哈维氏弧菌的VHH溶血素基因与副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)的TLH热不稳定性溶血素基因具有高度相似性,其氨基酸序列的相似性达到85.6 %。根据哈维氏弧菌vhhA溶血素基因序列,合成一个地高辛标记的VHH基因探针,利用其进行Southern Blot ,检测VHH溶血素基因在57株弧菌(包括26株国际标准菌株,20株哈维氏弧菌,11株副溶血弧菌)中的分布情况。结果显示,VHH基因探针与13株弧菌标准菌株有强杂交信号,包括2株溶藻胶弧菌(V.alginolyticus) ,2株哈维氏弧菌以及1株霍氏格里蒙菌(Grimontia hollisae) ,坎贝氏弧菌(V.campbellii) ,辛辛那提弧菌(V.cincinatiensis) ,费氏弧菌(V.fischeri) ,拟态弧菌(V.mimicus) ,飘浮弧菌(V.natriegens) ,副溶血弧菌,解蛋白弧菌(V.proteolyticus)和火神弧菌(V.logei)。与6株弧菌标准菌株有弱杂交信号,包括鳗弧菌(V.anguillarum) ,河口弧菌(V.aestuarianus) ,美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae subsp.damselae) ,河弧菌(V.fluvialis) ,弗尼斯弧菌(V.furnissii)和创伤弧菌(V.vulnificus) ,而另外7株弧菌标准菌株中无杂交信号。所有的哈维氏弧菌菌株至少含有一条杂交带,其中菌株VIB645 , VIB 648和SF-1分别含有2条杂交带。11株副溶血弧菌中均含有一条杂交带。上述数据表明,vhh/tlh溶血素基因广泛分布于弧菌中,尤其是哈维氏弧菌相关菌株和费氏弧菌相关菌株中。另外对鳗弧菌VIB 72 ,坎贝氏弧菌VIB 285 ,飘浮弧菌VIB 299和哈维氏弧菌VIB 647的vhh/tlh溶血素基因进行克隆并测序,其氨基酸序列与VHH溶血素和TLH溶血素氨基酸序列的同源性分别为67 %~99 %和69 %~91 %。对vhh/tlh溶血素基因在弧菌中的分布研究,将有助于进一步确定这类溶血素基因在病原弧菌致病性中的作用。     

LAMP-LFD技术及其在生物快检方面应用

LAMP-LFD技术是环介导横温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification)与横向流动试纸条(Lateral flow dipstick)相结合的一种新颖的检测技术,该技术将核酸横温扩增和可视化试纸条检测有机地结合。环介导等温扩增技术(LAMP),只需要在恒温(60℃~65℃)条件下保温几十分钟,即可将所需目的基因扩增到109水平。横向流动试纸条(LFD),融合了免疫层析技术和分子生物学手段,能在纸条上形成有颜色的检测线从而可以特异性地检测出该目标产物。环介导横温扩增技术(LAMP)与横向流动试纸条(LFD)相互结合的技术,使LAMP扩增产物现场检测可视化,检测结果明显直观,通过肉眼即可辨认,并具有高特异性、高灵敏度、简便、安全及成本低的特点,一度引起科研工作者的广泛关注。综述了环介导横温扩增方法与横向流动试纸条相结合(LAMP-LFD)技术的原理、优势、及其在生物快速检测方面的应用等,并指出了LAMP-LFD技术目前存在的不足以及展望。     

环介导恒温扩增法检测肺炎链球菌的研究

目的 建立环介导恒温扩增(LAMP)检测肺炎链球菌的方法.方法 用LAMP技术扩增肺炎链球菌菌株,并应用50例临床标本采用传统培养法、PCR法、LAMP法进行检测,比较3种方法的检出率,同时检测方法特异性和灵敏度.结果 所测肺炎链球菌均获扩增产物,对其他非肺炎链球菌无交叉反应.LAMP检测灵敏度可达102 CFU/mL.50例临床标本使用LAMP法检出9例肺炎链球菌阳性(18.0％),使用传统培养法检出阳性4例(8.0％).结论 LAMP法较传统培养检测方法特异性强、灵敏度高、操作方便、快速,适合临床标本的肺炎链球菌检测.     

环介导等温扩增技术在食品中痢疾志贺氏菌快速检测

【目的】探讨、优化基于环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测常规食品中感染性痢疾志贺氏菌的方法。【方法】在NCBI数据库中搜索获取志贺氏菌的特异性基因高度保守区,设计3对LAMP反应引物,建立、优化该LAMP可视化检测方法,并评价其特异性、灵敏度,同时与PCR检测方法和传统检测方法对比,进行结果统计分析。【结果】5株志贺氏菌标准菌株样品均检测为阳性,11株非志贺氏菌标准菌株样品均检测为阴性,无交叉反应。最低检验限为1.6×101 CFU/反应(或1.6×101 CFU/m L),且经比较,LAMP检测灵敏度比PCR检测高出1个数量级。通过对161份实际样品和人工污染样品进行检测,LAMP检测与传统方法检测结果具有较高的一致性。【结论】LAMP具有检测过程快速简便、检测结果稳定、可靠的特点,适用于对常规食品中感染性痢疾志贺氏菌的高效、快速检测需求。     

DNA环介导恒温扩增技术快速检测霍乱弧菌

霍乱弧菌是一种重要的食源性致病菌,主要引起急性肠道传染病,其快速检测具有重要意义。根据霍乱弧菌的mdh管家基因序列,设计2对特异性检测引物,利用DNA环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),经反应体系优化,成功建立了霍乱弧菌的LAMP快速检测方法。该方法最佳反应温度为65℃,60min完成检测,对培养菌的检测限为25CFU/mL,污染食品中霍乱弧菌的检测限为32CFU/g。对33株同种或近源细菌进行LAMP检测,仅霍乱弧菌得到阳性扩增。LAMP方法实践应用结果表明,对1057份虾、蟹、牡蛎、肉类、人腹泻物等样本进行检测,共检出85份阳性,与国际标准(ISO TS21872-1-2007)检测结果的符合率为100%。结果表明,本研究建立的霍乱弧菌LAMP检测方法特异性强、灵敏度高、操作简便,有利于霍乱弧菌疫情的监测。     

副溶血弧菌LAMP检测方法的建立

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种能引起食源性疾病的重要病原菌。首次将一种新颖的核酸扩增技术-环介导等温扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP）应用于副溶血弧菌的快速检测。针对副溶血弧菌不耐热溶血毒素基因（tlh）设计四条特异性引物（两条内引物和两条外引物）进行LAMP扩增,对扩增反应进行优化,最佳反应时间为60 min,反应温度为60 ℃。对12种细菌共28株菌进行LAMP扩增,仅14株副溶血弧菌得到阳性扩增结果,证明引物具有很高的特异性。副溶血弧菌基因组DNA和纯培养物的检测灵敏度分别约为90 fg和24 cfu/mL。对模拟食品样品进行直接检测,检测限为89 cfu/g。结果表明,该方法检测副溶血弧菌特异性强、灵敏度高,并且操作简便、检测成本低,1 h即可完成,有望发展成为快速检测副溶血弧菌的有效手段。     

水产品中创伤弧菌DNA环介导恒温扩增快速检测方法的建立及初步应用

创伤弧菌是一种重要的食源性致病菌,主要存在于河口和海洋环境中,严重危害水产养殖业的发展和人类健康。建立快速、准确、易操作的检测方法对防控创伤弧菌的传染,保障水产养殖业发展和增强食品安全意义重大。基于创伤弧菌vvHA基因,利用一种新型的核酸扩增技术-环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),建立了创伤弧菌LAMP快速检测方法。对11种共46株细菌进行扩增,仅创伤弧菌为LAMP阳性结果,说明LAMP方法具有高度特异性。灵敏度试验结果表明,对创伤弧菌纯培养菌的检测灵敏度为15CFU/ml,对污染食品中创伤弧菌的检测灵敏度为24CFU/g。此法40~60min内即可完成检测,检验检疫实践证明:LAMP方法操作简便、特异性强、灵敏度高且成本低廉,具有良好的应用前景。     

LAMP实时浊度法检测转基因植物NPTⅡ基因

根据转基因植物常用的选择标记基因NPTⅡ(HE582394.1)的序列,设计6条特异性LAMP引物,利用实时浊度仪对反应体系中扩增产物的实时监控筛选出最佳引物,最终建立转基因植物NPTⅡ基因的LAMP检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度、稳定性进行了评价。结果表明,该方法能够特异性检出含有NPTⅡ基因的植物及其加工产品,特异性高,灵敏度达0.5%。对转基因玉米MON863(含NPTⅡ基因)含量为10%、1%、0.5%、0%(W/W)的样品DNA分别进行扩增,其稳定性好,无假阳性和假阴性。所建立的LAMP方法适用于特异性筛选检测含NPTⅡ基因的植物及其加工样品。     

环介导等温扩增技术在快速检测炭疽芽胞杆菌中的应用

本文旨在建立适合国境口岸现场应用的生物恐怖防控快速检测方法,从而保障口岸安全.针对生物恐怖炭疽芽胞杆菌,选择目标菌种特异性基因片段,设计引物,运用环介导等温扩增(LAMP)技术建立一套简便、高效的检测方法,并模拟生物恐怖炭疽芽胞杆菌可能存在的基质条件,评价LAMP技术在快速筛查中的适用性.结果显示,LAMP技术排查生物恐怖炭疽芽胞杆菌简便、快速、特异,检测灵敏度为102～103 CFU/ml;且能有效检出在偏酸、偏碱及黏稠基质中的炭疽芽胞杆菌.而高盐环境对该反应影响较大,有必要采用能有效去除盐分的核酸抽提方法.     

应用纳米金探针检测HSV-2的目视化基因芯片

本实验建立了一种应用金标链霉亲和素探针的目视化高灵敏度检测单纯疱疹病毒2型(HerpesSimplexVirus-2,HSV-2)的基因芯片。该芯片以HSV-2DNA聚合酶的高保守区为靶序列,设计HSV-2特异性引物和探针,通过PCR反应使扩增产物标记上生物素;氨基修饰的探针固定在活化的玻片上,与生物素标记的扩增产物杂交;利用生物素与链酶亲和素高亲合力的特性,加入纳米金标记的链酶亲和素后形成生物素-链酶亲和素-纳米金生物反应放大系统;银染反应后,达到目视化检测HSV-2效果。该HSV-2检测基因芯片能目视化检测出100fmol/L的HSV-2扩增产物,具有灵敏度高,低成本的特点,通过临床标本验证表明该芯片具有较高的准确性。     

应用纳米金探针检测HSV-2的目视化基因芯片

本实验建立了一种应用金标链霉亲和素探针的目视化高灵敏度检测单纯疱疹病毒2型(Herpes Simplex Virus-2, HSV-2)的基因芯片.该芯片以HSV-2 DNA 聚合酶的高保守区为靶序列,设计HSV-2特异性引物和探针,通过PCR反应使扩增产物标记上生物素;氨基修饰的探针固定在活化的玻片上,与生物素标记的扩增产物杂交;利用生物素与链酶亲和素高亲合力的特性,加入纳米金标记的链酶亲和素后形成生物素-链酶亲和素-纳米金生物反应放大系统;银染反应后,达到目视化检测HSV-2效果.该HSV-2检测基因芯片能目视化检测出100fmol/L的HSV-2扩增产物,具有灵敏度高,低成本的特点,通过临床标本验证表明该芯片具有较高的准确性.     

环介导恒温扩增技术快速检测溶藻弧菌

溶藻弧菌是中国南部水产养殖业中弧菌病的最主要病原菌,其快速检测具有重要意义.根据溶藻弧菌外膜蛋白OmpK基因序列,设计一套引物,通过条件优化.成功建立了针对致病性溶藻弧菌的环介导恒温扩增检测技术(loop-mediated isothennal amplification.LAMP).应用LAMP技术,在65℃温育1 h的条件下扩增溶藻弧菌基因组DNA.琼脂糖凝胶电泳得到特异性梯度条带.该研究建立的LAMP法特异性检出致病性溶藻弧菌,其检测下限比PCR法低一个数量级,相当于n(cell)=38/mL的菌液浓度,灵敏度更高.综合分析表明,LAMP技术是快速、简易、实地诊断溶藻弧菌的理想工具.     

基于颜色判定的环介导恒温扩增法快速检测副溶血性弧菌

利用DNA环介导恒温核酸扩增法（LAMP）针对副溶血性弧菌特异基因tlh基因设计4条引物,通过引物特异性识别tlh基因上的6个独立区域来快速检测副溶血性弧菌.LAMP反应的过程中会产生白色沉淀焦磷酸镁,故可以通过监测浊度来判定反应结果.实时浊度仪监测反应结果表明,LAMP反应在60～65℃恒温条件下50min内完成;如果在反应前添加羟基萘酚兰（HNB）,蓝色的阳性结果很明显区别于紫色阴性结果;LAMP方法的最低检出限为9.74pg/μL,PCR方法最低检出限为97.4pg/μL,LAMP方法检测灵敏度是PCR方法检测灵敏度的10倍,且具有良好的特异性.LAMP方法用于快速检测副溶血性弧菌具有检测过程简单、实验装置简便、反应结果肉眼可辨别、灵敏度高和特异性强的特点,所以LAMP方法检测副溶血性弧菌特别适合用于现场和基层检疫及医疗单位的快速诊断.     

基于LAMP技术建立解脲支原体基因试纸条检测方法

目的建立一种灵敏度高、特异性强、检测速度快的方法检测解脲支原体。方法基于环介导恒温扩增技术（LAMP）,根据解脲支原体序列特征设计3对引物进行解脲支原体DNA切口酶核酸恒温扩增,扩增过程在一对引物中标记生物素,随着扩增的进行生物素直接引入扩增片段中,扩增结束后产物在密闭装置中进行免疫试纸条显色反应,根据显色卡的颜色判定结果的阴阳性。结果该技术检测解脲支原体较实时荧光PCR技术灵敏度要高10倍以上,其它病原体检测均阴性该方法特异性与实时荧光PCR技术相当。结论恒温扩增联合试纸条技术检测解脲支原体具有较高的敏感性和特异性,检测速度快,适合各医院开展。     

基因扩增产物的固相杂交-酶联显色方法的建立

建立基于基因扩增技术的简便、快速的病毒核酸定量检测方法．将标记有生物素的寡核苷酸引物所扩增的病毒基因产物,与通过共价键结合在微孔反应板上的特异性探针进行快速杂交,然后通过辣根过氧化物酶标记的抗生物素进行酶联显色,读取光密度值．应用本方法对血清中乙型、丙型肝炎病毒核酸定量检测,灵敏度分别可达１－５拷贝／反应．此方法简便、快速、特异性好、敏感性高、半定量指标客观,可广泛应用于肝炎病毒感染的临床诊断和疗效评价．     

LAMP技术在食源性病原微生物检测中的应用

针对常见引起食物中毒细菌的特异保守基因设计环介导恒等温扩增(LAMP)引物,并以此套引物建立食源性病原微生物的检测方法。特异性及灵敏性试验显示,LAMP法最低检出限为10-5,Real-time LAMP最低检出限为10-7,而普通PCR的检出下限仅为10-3;且LAMP全部反应在1 h内完成;LAMP反应结果可通过肉眼直接观测判定结果。LAMP快速检测常见食物中毒菌的方法初步建立,同时结合Real-time LAMP,可提供更准确的检测结果并可实现仪器在线式实时监测。     

添加有扩增内标的副溶血弧菌PCR检测方法

【目的】发掘副溶血弧菌特异性更强的检测靶点,并人工构建扩增内标,建立可以有效避免假阴性的新PCR检测体系。【方法】利用生物信息学方法,从副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)基因组DNA中发掘特异性很高的序列,并设计相应的特异性引物,人工构建扩增内标,建立PCR检测体系。【结果】本研究发掘得到的序列vp1332特异性很强,经检索,该序列是编码ABC转运子接合蛋白组分的基因片段,根据此序列设计一对特异检测引物(vp1332L/vp1332R),同时,构建了扩增内标,并建立了PCR检测体系。利用该体系对296株副溶血弧菌和33株非副溶血弧菌进行检测,结果显示,所有以副溶血弧菌为模板的PCR反应均可扩增到一条343bp的特异片段,而模板来源于非副溶血弧菌的则只能扩增到一条499bp的扩增内标片段。灵敏度实验表明,该PCR反应体系的检测灵敏度为1.6×102cfu/mL。人工污染实验表明,起始染菌量为1.24cfu/25g样品时经8h增菌,即可检测到副溶血弧菌。实际样品检测结果也证实该方法的有效性。【结论】本研究建立的PCR反应体系能特异地检测副溶血弧菌,并可有效地排除假阴性,提高检测准确率。