含苏氨酸操纵子重组质粒的构建及其对大肠杆菌L-苏氨酸积累的影响

摘要：【目的】通过分子生物学手段构建重组质粒,将其转入野生型大肠杆菌W3110,分析含苏氨酸操纵子基因的质粒及质粒定点突变解除反馈抑制时,对L-苏氨酸积累的影响。【方法】以W3110染色体DNA为模板,PCR扩增苏氨酸操纵子基因,即启动子THrLp、编码前导肽基因thrL以及thrA、thrB、thrC基因,通过重叠延伸PCR的方法对thrA基因定点突变,解除苏氨酸对它的反馈抑制,构建出重组表达质粒WYE112和WYE134,5 L发酵实验测定L-苏氨酸的产量。【结果】经5 L发酵罐发酵产酸实验,W3110的L-苏氨酸产量为0.036 ± 0.004 g/L,携带含苏氨酸操纵子质粒的W3110菌株L-苏氨酸产量为2.590 ± 0.115 g/L,质粒上thrA解除反馈抑制后,L-苏氨酸的产量增加到9.223 ± 1.279 g/L。【结论】过表达苏氨酸操纵子基因可以使L-苏氨酸积累,进一步解除thrA基因的反馈抑制,可以增强L-苏氨酸积累的效果,为L-苏氨酸工程菌改造的进一步研究奠定了基础。     

以大肠杆菌为底盘细胞构建XylR-Pu线路检测2,4,6-三硝基甲苯

目的:恶臭假单胞菌中的TOL质粒上的XylR-Pu是经典的甲苯代谢通路,在甲苯类化合物存在时,调控蛋白XylR可以特异性的激活Pu启动子,进而启动相应甲苯代谢通路的表达。基于合成生物学的思想,优化设计此通路并导入遗传背景清楚、操作简单的大肠杆菌中构建全细胞生物传感器,用于检测环境污染物2,4,6-三硝基甲苯(TNT)。方法:以pETDuet-1为载体骨架,构建了XylR-Pu基因线路,并以绿色荧光蛋白GFP为报告分子,GFP的荧光值可以指征结合诱导剂后的XylR蛋白对Pu启动子的诱导强度,并在基因线路中加入四串联终止序列来降低背景值。最后对XylR蛋白的信号识别区进行连续易错PCR,构建随机突变体文库,从中筛选具有更高感应强度、更好灵敏度及特异性的调控蛋白。结果:四串联终止序列可有效降低XylR-Pu通路的背景值,随机突变体文库中筛选出的生物元件eX0-4,对TNT表现出良好的感应强度、灵敏度及特异性。结论:XylR蛋白在大肠杆菌中对硝基甲苯响应不明显,但筛选得到的突变蛋白eX0-4,为后续生物传感器的更深层次地开发提供了优良的元件储备。另外,利用易错PCR构建随机突变体文库从中筛选发挥预定功能的突变蛋白质也可成为挖掘生物元件的一种通用方法。     

温度对大肠埃希菌Mn-SOD基因启动子调控条件的优化

目的 构建大肠埃希菌BL21 Mn-SOD-RFP报告基因载体,并探讨温度对大肠埃希菌Mn-SOD基因启动子的调控.方法 利用重组PCR技术,构建以Mn-SOD启动子调控的红色荧光蛋白(RFP)报告基因载体,将融合基因与T载体连接导入大肠埃希菌中,在不同温度(20、37、40和45℃)培养不同时间(13、20、30、37、44和54 h)后,利用荧光显微镜和荧光光度计观察大肠埃希菌表达RFP的情况.结果 正确构建Mn-SOD-RFP融合基因,重组PCR结果与测序结果完全一致;不同温度不同时间诱导后,Mn-SOD启动子在37℃,培养30～ 37 h表达的红色荧光蛋白最多.结论 成功构建该报告基因载体,并完成温度、时间对其调控的优化,为更进一步研究其他因素对SOD基因启动子的调控机制奠定基础.     

基于冰核蛋白的乳酸菌表面展示系统的构建

[目的]验证来源于丁香假单胞菌的冰核蛋白在乳酸乳球菌表面展示外源蛋白的可能性.[方法]以绿色荧光蛋白(Green Fluorescence Protein,GFP)基因gfp为报告基因,以冰核蛋白基因的N末端和NC端作为展示单元,构建乳酸菌表面展示载体pHZ101和pHZ102,并转化大肠杆菌(Escherichia coli JM109和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)MG1363.[结果]荧光显微镜观察显示重组大肠杆菌和乳酸乳球菌均能检测到绿色荧光.Western blot结果表明GFP蛋白在重组大肠杆菌和乳酸乳球菌中均得到表达,并且INPN-GFP蛋白多数滞留于乳酸乳球菌细胞质内,而INPNC-GFP蛋白则大部分定位于乳酸乳球菌的细胞膜上.[结论]以上结果表明丁香假单胞菌的冰核蛋白能引导外源蛋白定位于乳酸乳球菌的细胞膜上,为乳酸菌表面展示系统的构建提供了新的方向.     

可诱导型CRISPRi系统的构建及其初步应用

[目的]构建可诱导型CRISPRi系统以特异性地抑制靶基因的表达。[方法]采用PCR技术将人ZNF10基因的KRAB结构域编码序列分别克隆至d Cas9蛋白编码基因的5’端(KRAB-d Cas9)与3’端(d Cas9-KRAB)。设计并构建靶向荧光素酶报告基因起始密码子附近序列的4种gRNA表达载体,其表达受到含有Tet O调控元件的H1启动子调控。分析共表达d Cas9蛋白和gRNA对共转染的荧光素酶报告基因表达水平的影响。在此基础上,设计并构建靶向人KLHL21基因转录起始位点附近区域的3种gRNA表达载体,将其与KRAB-d Cas9融合表达载体分别共转染HEK293T细胞,24h后收集细胞并采用荧光实时定量PCR与蛋白质印迹技术分析KLHL21基因表达水平的变化。[结果]CRISPRi系统有效地抑制HEK293T细胞中荧光素酶报告基因与内源性的KLHL21基因的表达。共表达TetR抑制蛋白可阻断CRISPRi对荧光素酶报告基因表达的抑制作用,在细胞培养基中加入1μg/ml盐酸四环素可解除这种抑制作用。[结论]成功构建了可诱导型CRISPRi系统,可有效抑制真核细胞基因的表达。     

Tmem119基因敲入荧光示踪工具小鼠的构建及表型验证

[目的]通过将tdTomato基因片段插入到Tmem119基因终止密码子位置建立了Tmem119-tdTomato工具小鼠模型,并对该小鼠进行表型验证。[方法]制备Tmem119 sgRNA、Cas9 mRNA和donor vector,利用CRISPR/Cas9技术通过显微注射共同注射到C57BL/6小鼠受精卵中,通过交配及基因型鉴定获得F1代阳性小鼠;通过荧光检测验证小鼠Tmem119蛋白在大脑各区域的表达情况。[结果]基因型检测结果表明,tdTomato表达片段成功插入到Tmem119基因终止密码子前;免疫荧光检测结果表明,tdTomato蛋白荧光在小胶质细胞内与经典标记蛋白Iba1荧光重叠,与星形胶质细胞标记蛋白GFAP不重叠。[结论]成功构建特异性标记小胶质细胞的红色荧光示踪工具小鼠,为小胶质细胞的动态深入研究提供模式工具。     

红色毛癣菌pho88基因的克隆及生物信息学分析

[目的]克隆红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)无机磷酸盐转运蛋白(Inorganic phosphate transporter,PHO88)基因,构建原核表达质粒,并对PHO88蛋白进行生物信息学分析。[方法]根据Gen Bank公布的T. rubrum CBS 118892菌株pho88基因序列(XP-003235348),设计合成特异性引物,提取红色毛癣菌总RNA,反转录为c DNA,PCR扩增pho88基因,构建到原核表达载体p ET-28a上,测序鉴定其序列,并对其进行生物信息学分析。[结果]红色毛癣菌pho88基因全长582 bp,编码193个氨基酸。PHO88蛋白含有1个跨膜结构域,细胞亚定位为分泌信号途径蛋白,PHO88含有16个磷酸化修饰位点,其二级结构主要由α-螺旋构成,高级结构为全α型蛋白质。[结论]成功克隆红色毛癣菌pho88基因及构建原核表达质粒,为后续PHO88蛋白的诱导表达奠定基础,为后续开发靶向PHO88的抗真菌药物,提供实验基础。     

Streptomyces lincolnensis新遗传操作方法的建立以及lmbQ基因功能研究

以载体pSET152和pKC1139为出发质粒,通过供体菌大肠杆菌ET12567和S17-1转入林可链霉菌 (Streptomyces lincolnensis),建立和优化了接合转移体系.林可霉素生物合成基因簇中,lmbQ基因可能编码一个调控蛋白,构建了S.lincolnensis lmbQ基因中断载体,通过接合转移导入S.lincolnensis野生型菌株,筛选得到基因双交换突变株,通过PCR以及测序验证基因型正确,该突变株即为lmbQ同框敲除突变株.摇瓶发酵结果表明,lmbQ基因是一个正调控基因.     

含VHb基因和GFMcryIA基因的双价基因植物高效表达载体的构建

将人工合成的、密码子优化后的透明颤菌血红蛋白基因与人工合成的GFMcryIA基因构建成双价基因植物高效表达载体PGBI4ASVHBBt,vgbM基因表达盒中含2个增强子的35S启动子、Ω前导序列、Kozak序列、多联终止密码子及Nos终止子;Bt基因表达盒中,除含有以上提高转录和翻译的调控元件外,还包含有正确切割、加工序列、Poly(A)信号序列。利用根癌农杆菌介导转化烟草,获得了转基因植株;PCR及Southern blot检测,证实了双价基因在烟草基因组中的整合;Western blot检测证实了vgbM基因在转基因烟草中的表达;杀虫实验表明GFMcryIA基因也表达出活性毒蛋白。     

利用荧光指示分子IeGFP比较vip3A和cry1Ia基因启动子活性

苏云金芽孢杆菌（Bt）的Vip3A和Cry1Ia蛋白质序列无同源性,但具有其他相似的特征,例如在孢子形成早期合成,然后跨膜转运至胞外。本研究以新型融合荧光蛋白IeGFP为报告分子,比较vip3A（Pv）和cry1Ia基因（Pi）启动子的调控模式和活性。结果表明,在大肠杆菌中,两者均为组成型启动子。通过荧光信号强度的比较发现,在大肠杆菌中,Pi活性显著强于乳糖操纵子调节基因启动子（PlacI, P<0.01）,但比PlacI增强型突变体（PlacIq, P<0.01）和cry1Ac基因启动子（Pac, P<0.01）弱。在3个Bt启动子中,Pv活性最弱,接菌12 h后,与PlacI接近（P>0.05）。在Bt菌株中,Pv对IeGFP的表达调控与之前报道的Pi相似。启动子的Shine-Dalgarno（SD）序列与目的基因起始密码子（AUG）之间的间隔区域在调节细菌的蛋白质翻译效率方面发挥重要作用。本研究中构建的大部分Pv与Iegfp基因的间隔区域突变,均导致相应大肠杆菌和Bt细胞的荧光强度显著降低（P<0.05）,说明融合荧光蛋白IeGFP具有较好的灵敏度。该研究不仅确定了2种启动子在Bt和大肠杆菌中的活性,而且验证了IeGFP指示弱启动子活性的可行性。     

共表达ETEC K99、GFP重组大肠杆菌的构建及表达

[目的]构建K99、GFP基因重组质粒并在大肠杆菌BL21(DE3)感受细胞中表达。[方法]利用PCR扩增技术扩增K99基因和GFP基因,经连接和转化将目的片段克隆到pLA载体上,利用双酶切技术及PCR技术对重组质粒进行鉴定并测序分析,利用Western Blot技术分析蛋白质表达情况。[结果]测序分析结果表明,基因具有正确的阅读框;双酶切和PCR鉴定得到498 bp和720 bp的特异性条带;荧光检测表明重组菌表达了蛋白;Western Blot结果表明重组菌表达为融合蛋白。[结论]成功构建了大肠重组菌,并表达外源融合蛋白。     

rpoS基因缺失突变对荧光假单胞菌胁迫耐受性、群体感应及腐败活性的影响

【目的】微生物活动是引起食品腐败的主要原因,研究食品腐败菌的腐败作用调控机制对于保证食品的质量和安全具有重要意义。荧光假单胞菌是一种代表性的食品腐败菌,本文旨在研究RNA聚合酶的选择性sigma因子Rpo S在荧光假单胞菌致腐败过程中的作用。【方法】运用同源重组的方法构建荧光假单胞菌冷藏鱼分离株的rpo S基因缺失突变株,比较野生型和突变株暴露于不同胁迫条件下的存活率;通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析野生型和突变株产生高丝氨酸内酯类(AHLs)群体感应信号分子的种类和含量;检测野生型和突变株接种于灭菌三文鱼汁后4°C贮存过程中的菌落总数和挥发性盐基氮的生成量。【结果】成功构建了荧光假单胞菌rpo S基因缺失突变株。rpo S基因的缺失导致荧光假单胞菌对10 mmol/L H2O2和15%乙醇的耐受性显著降低,对150μg/m L结晶紫和175 mmol/L醋酸的耐受性有一定程度增强,不影响其对47°C和20%Na Cl的耐受性。荧光假单胞菌在rpo S基因缺失突变后长链信号分子C_(10)-HSL、C_(12)-HSL和C_(14)-HSL的含量增加。在灭菌三文鱼汁中的腐败活性检测表明rpo S基因缺失可导致荧光假单胞菌挥发性盐基氮的生成量显著降低。【结论】荧光假单胞菌的Rpo S不仅调节细菌对多种胁迫条件的耐受性,还影响AHL群体感应和腐败活性。     

人白细胞介素-3基因在酿酒酵母中的分泌表达

利用PCR突变方法,改造了人白细胞介素-3(hIL-3)cDNA,在成熟蛋白编码顺序5＇端前突变入了XbaⅠ酶切位点和酵母类胰蛋白酶加工位点Lys-Arg的密码子。改造后的hIL-3cDNA插入大肠杆菌-酵母穿梭质粒pVT102u/α,使其准确融合于α-交配因子前导序列之后,并置于启动子ADH1调控之下。转化入酿酒酵母宿主菌S-78筛选后,30℃培养48h,上清能明显促进hIL-3依赖细胞TF-1生长。上清中分泌表达的hIL-3经ELISA鉴定并定量,其表达量大于1.0mg/L。~3H-TdR掺入法测定上清中hIL-3活性为1.8×10~3u/ml。     

共表达ETEC K99、GFP重组大肠杆菌的构建及表达北大核心

[目的]构建K99、GFP基因重组质粒并在大肠杆菌BL21(DE3)感受细胞中表达。[方法]利用PCR扩增技术扩增K99基因和GFP基因,经连接和转化将目的片段克隆到pLA载体上,利用双酶切技术及PCR技术对重组质粒进行鉴定并测序分析,利用Western Blot技术分析蛋白质表达情况。[结果]测序分析结果表明,基因具有正确的阅读框;双酶切和PCR鉴定得到498 bp和720 bp的特异性条带;荧光检测表明重组菌表达了蛋白;Western Blot结果表明重组菌表达为融合蛋白。[结论]成功构建了大肠重组菌,并表达外源融合蛋白。     

假单胞菌GP72 rpeB突变株的构建及其对吩嗪类抗生素合成的调控

[目的]绿针假单胞菌GP72是一株可生产吩嗪类抗生素吩嗪-1-羧酸(PCA)及2-羟基吩嗪(2-OH-PHZ)的生防假单胞菌.RpeA/RpeB双元调控系统是其双元调控系统中的一组,本文旨在研究这一系统中的应答调控子(RR)RpeB对于PCA及2-OH-PHZ的生物合成影响.[方法]通过生物信息学分析获得了rpeA/rpeB双元调控系统的序列,并从GP72中扩增出rpeB基因,通过同源重组技术构建卡那霉素抗性片段插入突变rpeB的突变菌株GP72BN.利用发酵实验、rpeB基因回补实验及荧光定量PCR实验,验证rpeB对于吩嗪类抗生素合成及相关基因表达的调控作用.[结果]在KMB培养基中,rpeB突变株的PCA产量下降为野生型的49.5％,2-OH-PHZ产量下降为野生型的67.3％.rpeB基因的回补可以在一定程度上回复PCA及2-OH-PHZ的产量.荧光定量PCR实验结果表明,rpeB突变株中群体感应系统基因phzI/phzR及吩嗪合成基因簇基因phzE转录水平均显著下调,而PCA转化为2-OH-PHZ的修饰基因phzO转录水平变化不显著.[结论]RpeB正调控PCA与2-OH-PHZ合成途径的表达.RpeB很可能是通过调控群体感应基因phzI/phzR和phz基因簇的表达,从而影响PCA的合成,并间接调控其衍生物2-OH-PHZ的合成.     

含自杀基因回路的大肠杆菌的生长和变异规律

具有鲁棒性的基因回路构建是合成生物学的基础工作.基于群体感应的自杀基因回路转化大肠杆菌后赋予宿主菌在一定菌群密度时启动自杀的特性.为了使基因回路更具鲁棒性,在转化后以不同浓度的IPTG为诱导剂,观察宿主菌的表型特征以及在自杀过程中突变菌产生的规律,并通过基因测序确定变异位点.结果表明:IPTG浓度与细菌自杀率呈正相关,自杀强度愈大,突变菌株出现得越早,蔓延的速度也越快.基因测序结果表明,在基因回路质粒上,luxR基因中间有转座子插入,从而破坏了群体感应系统.实验也表明:仅需该突变,就足以使宿主菌逃避自杀.结果为下一步优化基因回路设计,实现细菌密度的连续振荡提供了思路.     

黄脂菌素生物合成基因簇中调控基因xanR3的功能

【目的】研究黄脂菌素产生菌灰黄链霉菌中编码ArsR家族转录调控蛋白(Arsenical resistance regulator)的xanR3基因的功能。【方法】利用大肠杆菌和链霉菌双亲本接合转移的方法,构建xanR3基因缺失突变株及回补突变株。利用cDNA在相邻同方向的基因间隔区进行PCR确定黄脂菌素生物合成基因簇中的转录单元。利用荧光定量RT-PCR方法进行突变株中黄脂菌素生物合成基因簇转录水平的检测。【结果】对得到的xanR3基因缺失突变株及回补突变株进行发酵,发现xanR3基因缺失突变株产黄脂菌素能力下降,回补菌株中黄脂菌素产量相比缺失突变株有一定程度的恢复,但仍未达到野生型水平。经鉴定,黄脂菌素生物合成基因簇中共有18个共转录单元,其中4个共转录单元在?xanR3突变株中转录水平明显下降。【结论】ArsR家族转录调控基因xanR3是黄脂菌素生物合成的正调控基因。     

烟草质体分裂蛋白NtFtsZs在大肠杆菌中的定位分析

分别构建了两个烟草 (NicotianatabacumL .)质体分裂基因NtFtsZ1和NtFtsZ2与编码绿色荧光蛋白的gfpS65A、V68L、S72A基因相融合的原核表达载体 ,并导入大肠杆菌 (Escherichiacoli)JM10 9菌株中进行表达。全长NtFtsZs∶GFP融合蛋白在菌体中有规律地定位 ,暗示NtFtsZs能识别大肠杆菌潜在的分裂位点 ,并能与大肠杆菌的内源FtsZ发生聚合作用 ;融合蛋白的诱导表达抑制了宿主菌的分裂 ,形成了明显的丝状菌体 ,证明真核生物的ftsZ基因与大肠杆菌的ftsZ基因有相似的作用。同时构建了NtFtsZs不同缺失的原核表达载体 ,对这两个基因所编码蛋白不同结构域的功能做了初步分析。实验结果表明 ,烟草FtsZ蛋白的C端结构域与其在大肠杆菌细胞中的正确定位有关 ;而N端结构域与NtFtsZs∶GFP融合蛋白的聚合有关。     

山羊BMPR-IB基因密码子偏好性及聚类分析

[目的]利用生物信息学分析山羊BMPR-IB基因密码子使用特征,对不同物种BMPR-IB基因通过不同的聚类方法进行分析。[方法]利用Usage Codon在线程序和Codon W软件分析山羊和其他物种BMPR-IB基因对密码子偏好性的使用情况,通过欧式平方距离和最小进化法分别进行聚类分析。[结果]山羊BMPR-IB基因无G/C碱基的使用倾向,GCC、CTG、CAG、CCC、AGA、AGT、GTG和TGA为山羊BMPR-IB基因的偏好密码子,其余53种密码子的使用较为均衡。通过最小进化法建立起来的不同物种间的系统发育分析结果与动物学分类一致,且不同物种BMPR-IB基因编码蛋白表达水平存在种属差异。[结论]BMPR-IB基因偏爱使用以A或T结尾的密码子,基于欧式距离系数建立起来的聚类和最大似然法构建的聚类不一致,造成这种差异的原因可能是在进化过程中单基因突变所引起的。     

利迪链霉菌nsdA基因的克隆及其阻断载体的构建

[目的]构建nsdA基因的敲除载体和表达载体,获得阳性转化子。[方法]根据GenBank中报道的天蓝色链霉菌nsdA基因序列设计引物,在利迪链霉菌产纳他霉素菌株A01、A02和G117中扩增到预期目的片段,进一步克隆nsdA基因全长序列;经BLAST比对,其核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列与天蓝色链霉菌均有较高同源性,据此判断利迪链霉菌A01、A02、G117中含有nsdA基因;进一步构建nsdA基因的敲除载体pLM103和表达载体pIBN139,转入大肠杆菌ET12567(puz8002)。[结果]nsdA基因全长序列1 407 bp,编码468个氨基酸,构建了nsdA基因的敲除载体pLM103和表达载体pIBN139。[结论]成功构建nsdA基因的敲除载体pLM103和表达载体pIBN139,并获得阳性转化子,为后续构建利迪链霉菌nsdA基因阻断突变株,以进一步探究nsdA基因在利迪链霉菌纳他霉素生物合成中的调控作用奠定了基础。