重组芋螺毒素K41表达条件优化

目的:优化重组芋螺毒素K41 (CTX-K41)的表达条件.方法:以不同接种比例、不同浓度IPTG、不同诱导时间、不同诱导温度、不同培养基pH值对含有pCTX-K41的E coli工程菌进行诱导表达,用Tricine-SDS-PAGE对表达产物进行分析.结果接种比例为1∶200,诱导时间为4h,IPTG.浓度为0.4mmol·L-1,诱导温度为30℃时,培养基pH值为5.0时CTX-K41的表达量最高.结论:已成功优化了重组蛋白CTX-K41的表达条件.     

A型产气荚膜梭菌α毒素基因表达及其免疫保护作用的初步研究

利用PCR技术,从A型产气荚膜梭菌标准株染色体DNA中扩增出α毒素基因,构建了含α毒素基因的重组菌株BL21(DE3)(pXETA02)。经酶切鉴定和序列测定证实,构建的表达质粒pXETA02含有α毒素基因序列。经SDS-PAGE、Western blot分析和ELISA检测,重组菌株表达的α毒素蛋白能够被α毒素单抗识别。表达优化结果表明,以IPTG为诱导剂诱导α毒素表达的优化条件是:培养基pH 7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.8mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间5h,此时α毒素蛋白表达量为34.83%。以乳糖为诱导剂诱导α毒素表达的优化条件是:培养基pH7.5、培养温度37℃,乳糖浓度0.1g/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入乳糖,诱导时间5h,α毒素蛋白表达量为23.82%。动物实验结果表明,用重组菌株α毒素蛋白免疫的小鼠可以抵抗1MLD的A型产气荚膜梭菌标准株C57-1毒素攻击。     

GABAA受体蛋白片段在大肠杆菌细胞表达条件研究

为了提高GABAA受体α1蛋白片段在大肠杆菌中表达量,研究了重组菌的发酵条件,包括培养基,接种量,温度,摇床转速,pH,诱导培养时间和诱导剂IPTG使用浓度等对GABAA受体蛋白片段表达的影响。结果表明重组菌以LB培养基为发酵基质,按3%接种量,37℃培养细胞3.5h后IPTG32℃诱导5h,菌体生物量为3.25g/L,目标蛋白表达量达95mg/L。用16L发酵罐进行放大培养,菌体生物量达4.95g/L,发酵周期5.5h。最高目标蛋白表达量达到136mg/L。     

GABAA受体蛋白片段在大肠杆菌细胞表达条件研究*

为了提高GABAA受体a1蛋白片段在大肠杆菌中表达量,研究了重组菌的发酵条件,包括培养基、接种量、温度、摇床转速、pH、诱导培养时间和诱导剂IPTG使用浓度等对GABAA受体蛋白片段表达的影响。结果表明重组菌以LB培养基为发酵基质,按3％接种量,37℃培养细胞3.5h后IPTG 32℃诱导5h,菌体生物量为3.25g/L,目标蛋白表达量达95mg/L。用16L发酵罐进行放大培养,菌体生物量达4.95g/L,发酵周期5.5h,最高目标蛋白表达量达到136mg/L.     

重组芋螺毒素His-Xa-MrVIB分泌表达研究

[目的]利用简单快速的基因工程法来生产富含二硫键的芋螺毒素Mr VIB,寻找有效合成具有天然活性芋螺毒素的新途径。[方法]人工设计合成芋螺毒素Mr VIB基因引物来构建表达载体p ET22b(+)/His-Xa-Mr VIB,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)plys S进行诱导表达。再利用Ni-NTA琼脂糖柱进行亲和层析纯化重组蛋白,Tricine-SDS-PAGE电泳分析重组蛋白表达形式。[结果]重组芋螺毒素His-Xa-Mr VIB(r His-Xa-Mr VIB)在大肠杆菌中获得有效分泌表达,经一步亲和层析获得纯度大于90%的重组芋螺毒素。[结论]基因工程方法能够有效分泌表达芋螺毒素Mr VIB,解决化学合成芋螺毒素产量低、成本高、难以纯化等问题。     

HCMV pp65截短蛋白原核表达条件优化

为了提高HCMVpp65蛋白片段在大肠杆菌中表达量,研究了不同发酵条件对其表达的影响,包括培养基、接种量、温度、摇床转速、pH、诱导时间以及诱导剂IPTG使用浓度等。结果表明,以LB培养基为发酵液,按5%接种量,37℃培养3h后IPTG诱导5h,重组菌菌体生物量为0.6g/L,目的蛋白表达量达18mg/L。用3.7L发酵罐进行放大培养,菌体生物量达0.85g/L,最高目的蛋白表达量达到25mg/L。     

野葛糖基转移酶PIUGT2蛋白原核表达及其适宜条件探讨

通过单因素试验分别研究温度和IPTG浓度对重组大肠杆菌BL21(DE3)/pProEXHTa-PIUGT2诱导表达野葛糖基转移酶PlUGT2蛋白量的影响。利用150 ml LB液体培养基培养重组大肠杆菌BL21(DE3),并优化发酵条件。结果表明,在温度20℃和IPTG浓度为0.75 mmol/L条件下,PIUGT2蛋白表达量最高。     

乳糖诱导的重组人血管内皮抑素(rhEndostatin)蛋白的表达

研究用乳糖替代IPTG作为诱导剂进行重组蛋白的表达,观察乳糖对乳糖操纵子调控的基因工程菌发酵及重组血管内皮抑素表达的影响,从而选取最佳诱导表达条件。以重组人血管内皮抑素表达工程菌pETrhEN/BL21(DE3)作为研究对象,分别用IPTG和乳糖作为诱导剂,在摇瓶中进行表达实验。并对重组蛋白质表达量进行分析。然后在5 L发酵罐中进行验证。在摇瓶培养条件下,乳糖浓度大于0.5 g/L即可以诱导目的蛋白的表达。乳糖浓度1 g/L时诱导目的蛋白表达量与1 mmol/L的IPTG相当,当乳糖浓度为10 g/L,目的蛋白表达量达到最大。在发酵罐培养条件下,补料4 h后葡萄糖浓度基本耗尽,此时开始加入乳糖。诱导后1 h,即有重组蛋白表达,在诱导后4 h达到高峰(占菌体可溶性蛋白的56%),与此同时,诱导后5 h菌体浓度也达到最高值。在以乳糖操纵子为调控手段的工程菌表达系统中,可以使用乳糖作为诱导剂,诱导应在葡萄糖消耗完后进行。     

多表位恶性疟疾疫苗M.RCAg-1在大肠杆菌表达的条件优化和大规模培养

通过以培养基配方、IPTG浓度、金属离子复合液浓度、镁离子浓度、表达时间、接种量、诱导时间点等发酵的重要条件对重组蛋白表达量影响的研究,确定多表位恶性疟疾疫苗M.RCAg-1蛋白最佳表达条件为以改良TB培养基培养、最优Mg2+,诱导剂IPTG和金属离子复合液浓度分别为10mmol/L,0.5mmol/L,6μl/ml,接种量为10%,表达时间为4.5h,将优化后的参数用于50L发酵罐进行连续3批中试规模的发酵,最终收获菌体湿重平均为31.8±1.78g/L,目的蛋白表达量可占菌体总蛋白的50%左右,试验确定了恶性疟疾多表位随机组合蛋白M.RCAg-1在大肠杆菌中的最优表达条件,该条件能够适合大规模培养需要。     

Arthrobacter ureafaciens CZ31丙氨酸脱氢酶可溶性表达及产酶条件优化

【目的】克隆Arthrobacter ureafaciens CZ31丙氨酸脱氢酶的编码基因(alanine dehydrogenase),转化至Escherichia coli Rosetta(DE3)中构建可溶性表达alanine dehydrogenase(ald)的工程菌CZR07并优化产酶条件。【方法】提取A.ureafaciens CZ31菌株的全基因组DNA,设计引物扩增出ald基因,与pET-28a连接后导入E.coli Rosetta中表达并纯化重组蛋白,以单因素实验结果为依据,响应面法优化发酵条件。【结果】ald全长为1119 bp,编码含372个氨基酸残基的蛋白质,分子量约为40 kDa,酶活为2.65 U/mg。响应面分析温度、诱导时间及诱导剂浓度的影响强度为IPTG浓度温度温度×IPTG浓度温度×诱导时间IPTG浓度×诱导时间诱导时间。CZR07摇瓶发酵最佳条件为温度22°C、IPTG 0.7 mmol/L、诱导时间7 h,此条件下重组酶酶活达到15.23 U/mg,与响应面优化的预测值相似,较优化前提高5.75倍。【结论】克隆并实现了CZ31中ald基因的可溶性表达,采用BBD法优化产酶的诱导条件,获得显著的优化效果,为其他工程菌株产酶条件优化提供借鉴。     

新型α-芋螺毒素基因克隆的引物筛选

目的:优化PCR条件,建立能特异扩增出α-芋螺毒素基因片段的最理想PCR条件.方法:根据α-芋螺毒素基因保守的信号肽或内含子序列和非翻译区保守核苷酸序列设计了多组特异引物,并对引物浓度和退火温度等影响因素进行优化.结果:根据α-芋螺毒素基因保守的内含子序列为引物、引物浓度为0.1 μmol/L、退火温度为50℃时,能特异的扩增出α-芋螺毒素基因片段,分子量大约分别为180bp和300bp.结论:采用优化的PCR条件,能筛选出克隆新型的α--芋螺毒素基因片段的最理想引物,为α-芋螺毒素的化学合成、活性研究和应用提供基础.     

乳糖诱导重组多价人精子表位肽在大肠杆菌中的表达

旨在研究用乳糖替代IPTG作为诱导剂进行重组多价人精子抗原表位肽的表达及诱导表达的优化条件.在摇瓶发酵条件下,通过改变培养基组成、诱导时机、诱导温度、诱导剂浓度、诱导时间和诱导方式等条件,利用SDS-PAGE电泳和AlphaEase凝胶电泳图像分析系统,研究以上条件改变对GST-重组多价人精子抗原表位肽融合蛋白表达量的影响,并与IPTG诱导结果相比较.结果显示,在摇瓶试验中,最优表达条件为选用TB培养基,在菌体对数生长的中期进行诱导,诱导温度37℃、乳糖诱导终浓度3 mmol/L、诱导时间6 h.GST-重组多价人精子抗原表位肽融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的30.5％,且主要以可溶形式表达,与IPTG的诱导结果相同.分批流加乳糖和一次性加入乳糖诱导,效果一样.乳糖可以替代IPTG作为诱导剂诱导GST-重组多价人精子抗原表位肽融合蛋白的表达,优化条件下可获得与IPTG相同的诱导表达效果.     

基因工程菌生产重组人组织因子的发酵研究

根据表达重组人组织因子基因工程菌的自身特点,在30L发酵罐上,通过控制发酵pH、葡萄糖浓度、诱导物磷酸浓度、搅拌速度及采用分批补料等方法,对重组人组织因子基因工程菌高密度发酵和高效表达的条件进行了研究。实验结果表明:诱导物终浓度低于0.1mmol/L,菌体密度OD60014,发酵周期10.5h,基因工程菌批发酵平均产量为37.41g/L,重组人组织因子表达量为6.56 mg/L。关键词:基因工程菌;高密度发酵;组织因子     

α-芋螺毒素GIC与Ac-AChBP共结晶条件的筛选与优化

旨在筛选及优化α-芋螺毒素与乙酰胆碱结合蛋白(ACh BPs)共结晶的条件,得到高分辨率的共结晶晶体。在昆虫表达系统中分泌表达海兔乙酰胆碱结合蛋白(Ac-ACh BP),并用凝胶色谱进行纯化,把纯化的乙酰胆碱结合蛋白与α-芋螺毒素GIC共结晶,利用结晶机器人及HAMPTON RESEARCH结晶试剂盒进行结晶及结晶条件的筛选与优化。结果显示,在0.6 mol/L Ammonium citrate dibasic,0.1 mol/L Sodium acetate trihydrate p H4.8的条件下生长的晶体较好,其分辨率可以达到2.1?。筛选与优化结晶条件(Ammonium citrate dibasic的摩尔浓度及0.1 mol/L Sodium acetate trihydrate的p H值)可以得到高分辨率的α-芋螺毒素GIC与Ac-ACh BP共结晶晶体。     

嘧啶核苷磷酸化酶基因工程菌发酵条件的优化

目的:优化嘧啶核苷磷酸化酶(PyNPase)基因工程菌的发酵条件。方法:通过工程菌摇瓶培养、测定吸光度D值、凝胶灰度扫描分析表达量。结果:当起始pH值为7.0～7.2,以60/500mL的装液量、5%的接种量,于32℃培养3h,加入终浓度为0.2g/L的L-阿拉伯糖诱导6h后收获菌体,可得到较高的生物量和重组蛋白表达量。L-阿拉伯糖诱导开始时间和菌体收获时间对蛋白表达有显著影响。结论:为PyNPase结构研究和工业化生产奠定了基础。     

木薯MeNINV4基因在原核细胞中的表达及优化

转化酶是植物中蔗糖降解过程的关键酶之一,可催化蔗糖不可逆地分解为葡萄糖和果糖,在植物生长发育、平衡碳水化合物及对逆境胁迫的响应等方面具有重要的作用。本研究利用从木薯中克隆到碱性/中性转化酶MeNINV4基因,将其重组构建到原核表达载体pGEX-6p-1上,构建重组载体MeNINV4-pGEX-6p-1,并对其融合蛋白表达的IPTG诱导浓度、起始菌液浓度、诱导温度和诱导时间条件进行优化。研究结果发现:GST-MeNINV4融合蛋白的表达量在一定范围内随着IPTG诱导浓度、起始菌液浓度和IPTG添加时间的增加而增加。重组菌在OD_(600)为1.0左右,IPTG浓度为0.6 mmol/L,在37℃条件下诱导5 h后,重组蛋白的表达量达到最大值。本研究通过诱导目的蛋白在原核细胞中的表达并且优化表达条件,使目的蛋白在原核细胞中的表达量显著增加,为进一步研究目的蛋白的结构、功能及酶学特性等生物学功能提供理论依据。     

大肠杆菌肠毒素ST1-LTB融合基因表达条件的优化

目的:对已构建的含有大肠杆菌肠毒素ST1-LTB融合基因的重组菌株进行鉴定和表达条件优化。方法:采用限制性核酸内切酶酶切鉴定含ST1-LTB融合基因的重组质粒,同时用SDS-PAGE检测不同条件下ST1-LTB融合基因的表达情况。结果:酶切鉴定证实重组质粒pXSL1含有ST1-LTB融合基因且阅读框架正确,以IPTG为诱导剂诱导ST1-LTB融合基因表达的优化条件是:培养基pH7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.8mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间5h,此时ST1-LTB融合蛋白表达量达35.2%。结论:实现ST1-LTB融合基因的高效表达,为大肠杆菌肠毒素双价基因工程菌苗的生产工艺研究提供了可靠的实验数据。     

应用正交实验法优化大肠杆菌表达CTB-PSMA624-632蛋白的条件

通过基因工程方法,将含霍乱毒素B亚单位(CTB)和前列腺特异性膜抗原(PSMA)表位肽的重组质粒pET28a-CTB-PSMA624-632,转化表达宿主菌BL21 (DE3)。CTB蛋白的表达有利于开发粘膜佐剂和霍乱弧菌基因工程疫苗,同时抗原肽疫苗也是肿瘤免疫治疗的理想候选。本研究采用正交实验法,优化条件以增加大肠杆菌中CTB-PSMA624-632蛋白的表达量。选取了5个单因素作为考察因子,分别为:预诱导时间、诱导时间、诱导温度、IPTG浓度、诱导转速。先做了4水平的实验L16(45)。根据极差分析的数据对影响较大的3个因素又做了细调型的3水平实验L9(33)。结果表明,在早期指数生长期的诱导能得到相对高水平的包涵体形式的CTB-PSMA624-632蛋白,并且此蛋白的表达随着诱导温度升高到37℃而逐渐增加;相比于使用正常浓度的IPTG诱导得到的蛋白表达量,用100%μmol/L诱导足以诱导蛋白的表达,这比通常使用的IPTG浓度小10倍;此外,诱导时间5 h与7 h对蛋白的表达量差距甚微,因此选定较短时间的5 h,240 r/min的诱导转速也被认为是能诱导目的蛋白CTB-PSMA624-632具有高表达量的最优条件。     

重组芋螺毒素GeXIVAWT的表达、纯化和鉴定

芋螺毒素GeXIVAWT是来自食虫将军芋螺(Conus generalis Lonnaeus)毒管中,具有两对二硫键的28肽.通过化学合成这种芋螺毒素产量低、成本高、难以纯化.利用简单快速的重组表达来生产富含二硫键的芋螺毒素有可能成为有效的新途径.通过对芋螺毒素GeXIVAWT的基因进行密码子优化,人工合成引物来构建表达载体pET22b(+)/pelB-GeXIVAWT.融合了信号肽的重组芋螺毒素以包涵体的形式在大肠杆菌中获得了高效表达.利用低浓度尿素洗涤和超滤管进行纯化无组氨酸标签的重组芋螺毒素pelB-GeXIVAWT,再利用稀释复性的方法将无活性的包涵体转变成具有活性的重组芋螺毒素.复性后的重组蛋白采用反相高效液相色谱进一步纯化后进行了质谱鉴定.活性实验表明重组芋螺毒素pelB-GeXIVAWT具有抑制昆虫细胞Sf-9的生长,为研究芋螺毒素作为生物杀虫剂奠定基础.     

家蝇抗菌肽AMPs17蛋白原核表达条件的优化及其抗真菌活性检测

目的:优化AMPs17重组蛋白的原核表达条件,分析重组蛋白的抗真菌活性。方法:比较不同的诱导温度(25℃、28℃、30℃、32℃、34℃)、异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导浓度(0. 025mmol/L、0. 05mmol/L、0. 1mmol/L、0. 3mmol/L、0. 5mmol/L、0. 8mmol/L、1. 0mmol/L)和诱导时间(12h、15h、18h、21h、24h)对AMPs17重组蛋白表达量的影响,筛选AMPs17重组蛋白的最佳表达条件;采用镍离子金属螯合剂亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,SDS-PAGE和ImageJ图像分析系统对表达结果进行分析,Western blot对AMPs17重组蛋白进行鉴定,高效液相色谱分析重组蛋白的纯度,微量液体稀释法及菌落计数法检测其抗真菌活性。结果:在诱导温度为32℃、IPTG浓度为0. 05mmol/L的条件下诱导培养15h,AMPs17重组蛋白的表达量最高且最为稳定;HPLC色谱仪分析显示AMPs17重组蛋白纯度可达到90%以上;优化后的AMPs17重组蛋白能有效抑制白色念珠菌的生长。结论:优化了家蝇抗菌肽AMPs17的诱导表达条件,获得了高表达、稳定且具有抗真菌活性的蛋白质,为后续抗菌机制及应用研究提供一定的实验基础。