沉默MDR1基因表达逆转肺癌A549/DDP细胞对顺铂的耐药性

本研究以A549/DDP细胞为实验对象,利用shRNA(short hairpin RNA)沉默MDR1基因,逆转人肺癌A549/DDP细胞对顺铂的耐药性。构建3种靶向MDR1基因重组干扰载体,稳定转染A549/DDP细胞,qRT-PCR检测MDR1 mRNA表达水平,Western blotting检测MDR1蛋白表达水平,MTT法检测细胞对顺铂的敏感性。结果显示成功构建了3种靶向MDR1的重组表达载体p2.1-1、p2.1-2和p2.1-3。3种干扰表达载体均能有效沉默A549/DDP细胞MDR1基因表达,其中p2.1-3对MDR1沉默效果最好,对mRNA和蛋白的沉默效率分别为51.47%和53.24%。转染p2.1-3的细胞对顺铂的IC50由(72.08±7.00)μmol/L降至(31.89±3.39)μmol/L,逆转率达到(67.60±5.70)%。这些结果表明靶向MDR1的重组干扰载体均能够有效抑制MDR1表达,其中p2.1-3干扰效果最佳并且能逆转A549/DDP细胞对顺铂的耐药性。     

miR-17-92对急性白血病L1210/DDP细胞多药耐药性影响研究

目的:研究miR-17-92在白血病L1210/DDP细胞多药耐药形成中的作用.方法:首先构建L1210/DDP耐药细胞系,运用real-time PCR方法检测miR-17-92在L1210/DDP细胞与L1210细胞中的表达差异.利用脂质体Lipofectamine 2000将miR-17-92抑制物(miR-17-92sponge)及阴性对照(sponge vector)转染L1210/DDP细胞,构建miR-17-92表达下调的L1210/DDP细胞系.用MTS法检测转染后耐药细胞对顺铂和阿霉素体外药物敏感性.结果:miRNA-17-92在L1210/DDP耐药细胞系中高表达,上调倍数为(1.61±0.01)倍.体外药物敏感性实验表明,转染miR-17-92抑制物的实验组对顺铂和阿霉素的IC50分别为(3.29±0.51)、(1.35±0.13)g/ml,而转染阴性对照组对上述药物的IC50分别为(6.73± 0.82)、(2.66±0.42)g/ml,在耐药株中抑制miR-17-92在L1210/DDP细胞中的表达,显著增加细胞对顺铂和阿霉素的敏感性.结论:miR-17-92在白血病耐顺铂L1210/DDP细胞中高表达.抑制miR-17-92的表达可增加白血病L1210/DDP细胞对顺铂和阿霉素化疗药物的敏感性,部分逆转耐药.     

shRNA抑制c-fos表达对P-gp介导的乳腺癌多药耐药的影响

多药耐药(multidrug resistance,MDR)是导致化疗失败的重要原因,多药耐药基因(multidrug resistance gene,mdr1)产物P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)过表达是最主要的耐药机制。原癌基因c-fos在肿瘤MDR中的作用渐受重视。主要选用人乳腺癌敏感株MCF-7和阿霉素(adriamycin,ADR)筛选的、mdr1/P-gp高表达的耐药株MCF-7/ADR,探讨c-fos在P-gp介导的乳腺癌MDR中的作用。相对于MCF-7,c-fos在MCF-7/ADR高表达。采用shRNA法下调c-fos表达后,MCF-7/ADR对ADR的敏感性大大增强,且mdr1/P-gp表达减少、P-gp外排功能降低。c-fos表达下调可逆转对P-gp介导的乳腺癌MDR的实验结果,为c-fos成为逆转肿瘤耐药诊断和治疗的新靶标,对实现耐药乳腺癌的分子靶向治疗提供了理论基础。     

miR-34c逆转乳腺癌耐药细胞株MCF-7/DOX耐药性的研究

miR-34在肿瘤发生发展中起着至关重要的作用,然而,mi R-34在肿瘤耐药中的作用研究不多。该研究将合成的mi R-34c成熟序列转染乳腺癌阿霉素(doxorubicin,DOX)耐药细胞MCF-7/DOX,探讨mi R-34c体外逆转MCF-7/DOX细胞耐药性作用及其可能的机制。采用Real-time RT-PCR检测mi R-34c在乳腺癌耐药细胞株MCF-7/DOX中的表达,MTS法检测miR-34c对MCF-7/DOX细胞阿霉素耐药性的影响,流式细胞术检测miR-34c对MCF-7/DOX细胞周期和凋亡的影响,Real-time RT-PCR和Western blot法检测多药耐药相关蛋白MDR、MRP以及细胞周期与凋亡相关蛋白Bcl-2、E2F3的表达。结果显示,mi R-34c在乳腺癌MCF-7/DOX耐药细胞中低表达,转染mi R-34c可明显增加耐药细胞对阿霉素的敏感性;流式分析发现,miR-34c可以促进耐药细胞G2期细胞周期阻滞和凋亡;与对照组相比较,miR-34c转染组细胞MDR、MRP蛋白表达无明显变化,而Bcl-2、E2F3 mRNA和蛋白表达均明显下调。研究表明,miR-34c直接靶向抑制Bcl-2和E2F3的表达,诱导细胞周期G2期阻滞和凋亡,进而增强MCF-7/DOX耐药细胞对阿霉素的敏感性。     

脉冲磁场对白血病细胞HL60/ADR多药耐药的逆转效果及分子机制研究

目的:探讨脉冲磁场(pulsedmagnetic fields,PMF)对白血病细胞HL60/ADR多药耐药的逆转效果及其可能的分子机制.方法:生长曲线法检测PMF的细胞毒性;MTT法测定HL60、HL60/ADR的IC50及经不同参数PMF作用后HL60/ADR的IC50,计算耐药倍数和逆转倍数;流式细胞术检测PMF作用前后HL60/ADR细胞内药物蓄积变化及多药耐药相关蛋白(Multidrug Rcsistance Related Protcinl MRPI)阳性表达率的变化;RT-PCR法检测MRPI基因表达的变化.结果:单独PMF对HL60/ADR细胞的生长没有明显抑制作用,不同参数(频率为150Hz和250Hz,场强均为40mT,照射时间30min和1 h)的PMF均能有效逆转HL60/ADR的多药耐药,150 Hz/1 h作用最为明显,逆转倍数为5.891倍.PMF作用后Rh123在HL60/ADR细胞内的蓄积增加了近8.0%,而MRPl基因表达下调了68.3%,蛋白阳性表达率下调23.6%.结论:PMF能够通过下调MRPl基因和蛋白的表达.进而增加Rh123在细胞内的蓄积,功能性部分逆转白血病细胞的多药耐药.     

MiR-126增加非小细胞肺癌细胞A549对顺式铂氨的敏感性

miR-126在多种恶性肿瘤中存在表达下调并显示抑癌基因的功能,然而其在肿瘤敏感性中的作用仍不明确.为了探讨miR-126在非小细胞肺癌细胞A549对顺式铂氨(cis-diammine dichloroplatoum,cisplatin,CDDP)敏感性中的作用及可能机制,本研究用MTS法检测非小细胞肺癌细胞A549及其衍生的CDDP耐受细胞A549/DDP对CDDP的敏感性.结果表明,A549/DDP细胞对CDDP的耐受性是A549细胞的4.05倍(P=0.0078);用qRT-PCR检测发现,相比于A549细胞,A549/DDP细胞中miR-126的表达下调了8.45倍(P=0.0063),而survivin和Bcl-2的表达明显上调;通过MTS、qRT-PCR及Western印迹实验发现,miR-126 mimics使A549/DDP细胞中miR-126的表达上调了12.63倍(P=0.0013),并明显增加A549/DDP细胞对CDDP的敏感性及下调survivin和Bcl-2的表达;相反,miR-126 inhibitor能明显增加A549细胞对CDDP的耐受性及增加survivin和Bcl-2的表达.本研究结果提示,miR-126在非小细胞肺癌CDDP耐受细胞中的表达下调,上调miR-126的表达能增加耐药细胞对CDDP的敏感性.miR-126是逆转肺癌CDDP耐受的可能潜在靶标.     

miR-126增加非小细胞肺癌细胞A549对顺铂的敏感性

miR-126在多种恶性肿瘤中存在表达下调并显示抑癌基因的功能,然而其在肿瘤敏感性中的作用仍不明确.为了探讨miR-126在非小细胞肺癌细胞A549对顺式铂氨(cis-diammine dichloroplatoum, cisplatin, CDDP)敏感性中的作用及可能机制,本研究用MTS法检测非小细胞肺癌细胞A549及其衍生的CDDP耐受细胞A549/DDP对CDDP的敏感性.结果表明,A549/DDP细胞对CDDP的耐受性是A549细胞的4.05倍(P=0.0078)|用qRT-PCR检测发现,相比于A549细胞,A549/DDP细胞中miR-126的表达下调了8.45倍(P=0.0063),而survivin和Bcl-2的表达明显上调|通过MTS、qRT-PCR及Western印迹实验发现,miR-126 mimics使A549/DDP细胞中miR-126的表达上调了12.63倍(P=0.0013),并明显增加A549/DDP细胞对CDDP的敏感性及下调survivin和Bcl-2的表达;相反,miR-126 inhibitor能明显增加A549细胞对CDDP的耐受性及增加survivin和Bcl-2的表达.本研究结果提示,miR-126在非小细胞肺癌CDDP耐受细胞中的表达下调,上调miR-126的表达能增加耐药细胞对CDDP的敏感性. miR-126是逆转肺癌CDDP耐受的可能潜在靶标.     

线粒体靶向TPP-DOX连接物的制备及其逆转肿瘤耐药活性研究

目的:阿霉素(DOX)是常用的抗肿瘤药物,但是它的毒副作用大,而且肿瘤细胞易对DOX产生耐药,限制了其临床应用。本研究利用肿瘤细胞线粒体跨膜电位较高的特性,将亲脂性阳离子(3-丙羧基)三苯基溴化膦(TPP)与DOX相连接制备具有线粒体靶向功能的TPP-DOX,以期达到逆转肿瘤细胞耐药的目的。方法:以DOX、TPP为原料,合成TPP-DOX,通过核磁、质谱等方法进行结构鉴定。采用MTT方法研究TPP-DOX对KB细胞、A549细胞及耐DOX肿瘤细胞MDA-MB-231/ADR的体外抗肿瘤活性。采用激光共聚焦显微镜观察TPP-DOX在肿瘤细胞内的分布。结果:TPP-DOX对KB细胞和A549细胞的毒性低于DOX,TPP-DOX对耐DOX肿瘤细胞MDA-MB-231/ADR的毒性明显大于DOX。激光共聚焦显示TPP-DOX分布于细胞核和线粒体中。结论:TPP-DOX具有线粒体靶向特性,可有效逆转肿瘤耐药,有进一步研究的价值。     

阿霉素-姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯复方纳米粒的研制及逆转MCF-7/ADR细胞多药耐药的研究

采用乳化聚合法制备阿霉素-姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯复方纳米粒(DOX-CUR-PBCA-NPs),该纳米粒平均粒径为133±5.34nm,Zeta电位为+32.23±4.56 mV,阿霉素(DOX)和姜黄素(CUR)的包封率分别为49.98±3.32％,94.52±3.14％.MTT实验结果和Western blott实验结果均表明,DOX-CUR-PBCA-NPs与CUR-PBCA-NPs+DOX-PBCA-NPs体外对MCF-7/ADR细胞的生长抑制活性相当,下调MCF-7/ADR细胞中P-糖蛋白(P-gp)的表达也相当,较没有用PBCA纳米粒包载的游离药物、单一药物的纳米制剂及其他形式的制剂联用的抗肿瘤活性及逆转多药耐药的性能都显著增强.说明利用PBCA纳米粒同时包裹抗癌药物阿霉素与中药逆转剂姜黄素协同用药可以增强克服多药耐药(MDR)的疗效.     

沉默MDR1基因逆转SGC7901/ADM细胞对紫杉醇的耐药性

本研究利用短发夹sh RNA(short hairpin RNA)沉默SGC7901/ADM细胞MDR1基因,从而逆转SGC7901/ADM细胞对紫杉醇的耐药性。根据MDR1基因序列设计并合成编码sh RNA的DNA模板,构建3种靶向MDR1基因重组干扰载体,稳定转染SGC7901/ADM细胞,q RT-PCR检测MDR1 m RNA表达水平,Western blotting检测MDR1蛋白表达水平,MTT法检测细胞对紫杉醇的敏感性。结果表明,成功构建了靶向MDR1基因的3种重组表达载体,分别转染SGC7901/ADM细胞后均能不同程度沉默MDR1基因的表达,其中p2.1-3对MDR1沉默效果最好,m RNA和蛋白的沉默效率分别为78.5%和45%。紫杉醇对细胞的IC50值由(3.147±0.494)μmol/L降至(0.714±0.059)μmol/L,逆转率达到(78.22±1.906)%。结果表明,靶向MDR1的干扰表达载体能够抑制MDR1基因的表达,从而逆转SGC7901/ADM细胞对紫杉醇的耐药性。     

MiR-186-5p通过靶向调控PTTG1抑制肺腺癌细胞的上皮-间质转化

先前研究表明,miR-186-5p在人类许多恶性肿瘤中扮演抑癌基因的作用,但其在肺腺癌上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）中的作用并不明确。本研究旨在证明,miR-186-5p可通过靶向调控PTTG1抑制肺腺癌细胞的上皮-间质转化。我们首先分析了miR-186-5p在人肺癌细胞中的表达。荧光定量PCR（QRT-PCR）结果显示,与人正常肺上皮细胞BEAS-2B相比,肺腺癌细胞SPC-A1、A549中的miR-186-5p表达量明显降低。为研究miR-186-5p在肺腺癌细胞中的功能,利用GV369-miR-186-5p表达载体,实现了在A549细胞中的过表达。基因转染结合Transwell侵袭结果显示,与对照质粒转染的A549细胞相比,过表达miR-186-5p的A549细胞的体外侵袭能力明显下降。Western印迹检测细胞中EMT相关标志物揭示,GV369-miR-186-5p转染的A549细胞中的上皮-钙黏着蛋白（E-cadherin）表达明显上调,而神经-钙黏着蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（vimentin）表达明显下调。同时,GV369-miR-186-5p转染引起其靶基因--垂体肿瘤转化基因1（pituitary tumor-transforming gene 1,PTTG1）编码蛋白在A549细胞中明显降低。重要的是,过表达miR-186-5p与敲减PTTG1均可导致上皮-钙黏着蛋白表达上调,而神经-钙黏着蛋白和波形蛋白下调|而miR-186-5p和PTTG1表达载体共转染后,3种EMT相关标志物在A549的表达与对照细胞的表达无明显差异,提示过表达PTTG1可抵消miR-186-5p对EMT相关标志物表达的影响。综上所述,miR-186-5p可通过靶向调控PTTG1抑制EMT的发生,进而抑制肺腺癌细胞的侵袭转移。     

长链非编码RNA UCA1在胃癌多药耐药中的作用研究

目的:研究胃癌耐药细胞及其亲本细胞中长链非编码RNA UCA1的表达差异,探讨UCA1在胃癌多药耐药中的作用。方法:通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测胃癌耐药细胞SGC7901/ADR、SGC7901/VCR及其亲本细胞SGC7901中UCA1的表达差异;通过si RNA转染降低SGC7901/ADR中UCA1表达,MTT法检测细胞半数抑制浓度(IC50)的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡变化。结果:QRT-PCR结果显示,UCA1在SGC7901/ADR和SGC7901/VCR胃癌耐药细胞表达显著高于SGC7901胃癌亲本细胞;MTT实验表明,干扰UCA1的SGC7901/ADR相对于阴性对照(NC)组的IC50显著降低;凋亡检测结果显示,在相同剂量化疗药物作用下,干扰UCA1后SGC7901/ADR凋亡率显著高于NC组;Western blot证实,干扰UCA1表达可显著降低BCL-2蛋白表达。结论:长链非编码RNA UCA1在胃癌耐药细胞表达显著升高,干扰UCA1表达可明显逆转胃癌耐药,UCA1可作为治疗胃癌耐药的重要分子靶标。     

氧化铁磁性纳米颗粒介导缺氧诱导因子1α shRNA质粒转染逆转A549/CDDP细胞对顺铂耐药的实验研究

评价了氧化铁磁性纳米颗粒作为缺氧诱导因子1α shRNA (HIF-1α shRNA) 重组质粒载体进行体内体外转染的可行性及其逆转人肺腺癌耐药细胞株(A549/CDDP)顺铂耐性的效果,并初步探讨相关机制．在成功构建HIF-1α shRNA重组质粒后,分别利用氧化铁磁性纳米颗粒及脂质体介导质粒转染A549/CDDP细胞及其移植瘤裸鼠动物模型,荧光显微镜检测转染效率,RT-PCR及细胞免疫化学检测转染后A549/CDDP 细胞HIF-1α、多药耐药相关蛋白1(multidrug resistance 1,MRP1)、肺耐药相关蛋白(lung resistance-related protein,LRP) mRNA及蛋白质表达,免疫组化检测转染后A549/CDDP移植瘤HIF-1α、MRP1及LRP蛋白表达,MTT法检测转染HIF-1α shRNA前后A549/CDDP细胞对顺铂的耐药性,并检测转染HIF-1α shRNA后A549/CDDP细胞移植瘤的肿瘤生长指数,HE染色检测纳米颗粒转染对裸鼠肝、肾及脑的组织学毒理作用．结果显示,氧化铁磁性纳米颗粒介导转染相对效率高于脂质体介导(P < 0.01),HIF-1α shRNA转染A549/CDDP细胞后HIF-1α、MRP1、LRP mRNA及蛋白质表达下降,逆转A549/CDDP细胞对顺铂耐性82%,纳米颗粒介导HIF-1α shRNA转染A549/CDDP细胞移植瘤裸鼠动物模型后,移植瘤组织中HIF-1α、MRP1及LRP蛋白表达下降,转染HIF-1α shRNA后抑制移植瘤的生长,且与顺铂有协同效应,纳米颗粒转染后裸鼠肝、肾及脑组织无坏死．这些结果说明,纳米颗粒介导HIF-1α shRNA的体内体外转染效率高于脂质体,RNA干扰技术封闭HIF-1α基因可较大程度逆转耐顺铂人肺腺癌细胞的耐药性及其抑制瘤的生长,其作用可能与HIF-1α shRNA降低HIF-1α、MRP1及LRP表达有关,HIF-1α基因可作为逆转肺癌耐药治疗的有效靶点,磁性纳米颗粒介导HIF-1α shRNA质粒转染具有一定的生物安全性．     

奥利司他逆转肺腺癌A549/DDP细胞株顺铂耐药及机制研究

本研究的目的是观察奥利司他(Orlistat)逆转肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP的耐药作用并考察其可能的分子机制。应用CCK-8法检测并计算肺腺癌耐药细胞株A549/DDP对顺铂(cisplatin, DDP)的耐药指数(resistance index, RI),筛选奥利司他的最佳实验浓度并观察其对A549/DDP细胞的耐药逆转效果;倒置荧光显微镜下观察各实验组细胞的形态学变化及Hoechst 33258荧光染色后细胞凋亡形态学改变;采用流式细胞术检测不同药物处理对细胞凋亡率的影响;Western blotting检测各实验组细胞P-gp、FASN、PI3K、Akt、p-Akt、NF-κB、Bcl-2和cleved-caspase-3的表达情况。结果显示,奥利司他抑制了A549/DDP耐药细胞株的增殖,且具有浓度依赖性。奥利司他与DDP联用增加了耐药株A549/DDP细胞对DDP的敏感性,耐药逆转倍数为5.02。倒置荧光显微镜观察到联合用药组细胞出现了明显的凋亡形态学改变。流式细胞术结果表明,与对照组和单药组比较,两种药物联用后细胞的凋亡率显著提高(p0.05)。Western blotting检测结果显示,相较于其它3组,联合用药组中耐药相关蛋白P-gp表达下调(p0.01),PI3K、p-Akt、NF-κB表达水平均显著降低(p0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降(p0.01),凋亡相关蛋白cleved-caspase-3表达上调(p0.01);虽然FASN的表达在单用奥利司他组及联合用药组中均降低,但这两组间的FASN表达水平并无统计学差异。以上结果表明,奥利司他能够提高A549/DDP耐药细胞株对化疗药物DDP的敏感性,具有逆转肺腺癌细胞耐药性的作用,其机制与降低耐药蛋白P-gp的表达、抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路以及其下游凋亡相关蛋白有关。     

β-榄香烯乳剂逆转多药耐药细胞株MCF-7/ADM对阿霉素耐药性研究

目的：测定中药β-榄香烯乳剂对MCF-7/ADM细胞的无毒剂量,并检测此无毒剂量是否有逆转MCF-7/ADM细胞对化疗药物阿霉素（ADM）的多药耐药（multidrug resistance,MDR）性。方法：采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定药物的细胞毒性及耐药细胞逆转倍数;荧光分光光度法测定细胞内药物浓度。结果：无毒剂量的β-榄香烯乳剂(6μg/ml）能显著降低化疗药物ADM对乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADM细胞的IC50,明显增加耐药细胞内药物浓度。结论：初步研究表明β-榄香烯乳剂具有逆转MCF-7/ADM细胞MDR的作用。     

miR-21靶向调节MARCKS基因影响人乳腺癌细胞多西紫杉醇敏感性的研究

目的:探讨miR-21对MARCKS基因表达的调控及其与乳腺癌MDA-MB-231细胞株多西紫杉醇耐药的关系。方法:通过基因芯片筛选到miR-21在亲代敏感细胞株(MDA-MB-231/S)与多西紫杉醇耐药细胞株(MDA-MB-231/Doc)中存在差异表达,应用实时荧光定量(RT-qPCR)方法验证此差异,同时分别检测MDA-MB-231/S细胞和MDA-MB-231/Doc细胞转染miR-21模拟物和抑制物后的表达变化;通过靶基因预测软件预测miR-21与MARCKS基因的关系;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、流式细胞术、RT-qPCR和蛋白质印迹法检测miR-21表达变化对三阴性乳腺癌细胞多西紫杉醇耐药性的影响,并探讨其与MARCKS基因表达的关系。结果:与MDA-MB-231/S相比,miR-21在MDA-MB-231/Doc中的表达水平明显升高(2.03±0.06)倍(P0.05)。与阴性对照组比,MDA-MB-231/S细胞转染miR-21 mimics后miR-21表达水平明显增高(2.26±0.07)倍(P0.05),而MARCKS基因在mRNA和蛋白水平上均明显下调。MDA-MB-231/Doc细胞转染miR-21 inhibitors后,miR-21表达水平是阴性对照组的(0.36±0.03)倍(P0.05),MARCKS基因的mRNA和蛋白水平高于其阴性对照组。转染miR-21 mimics后的MDA-MB-231/S细胞IC50显著高于其阴性对照组(P0.05),相反,与阴性对照组相比,MDA-MB-231/Doc细胞转染miR-21 inhibitors后,其IC50显著降低(P0.05)。MDA-MB-231/S转染miR-21 mimics后,miR-21表达量明显上调,MARCKS基因分别是阴性对照组的(3.564±0.336)倍和(2.019±0.268)倍(P0.05)。结论:miR-21可能通过靶向调节MARCKS基因增强乳腺癌细胞对多西紫杉醇的耐药性。     

参麦注射液对肺腺癌耐药细胞株的逆转作用

本研究探讨了参麦注射液对人肺腺癌耐药细胞株A549/DTX(多西他赛)的耐药逆转作用,并初步分析其作用机制。以MTT法检测参麦注射液、多西他赛及联合应用对耐药细胞株的增殖抑制率,并计算耐药逆转倍数。用流式细胞术测定参麦注射液联合多西他赛对A549/DTX细胞株的促凋亡作用;用Western blotting分析参麦注射液对A549/DTX细胞株的凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达水平的影响。研究表明,参麦注射液增加耐药细胞株对DTX的敏感性,耐药逆转倍数为3.92,并明显增强DTX对A549/DTX细胞株的促凋亡作用。同时抑制了Bcl-2和P-gp蛋白表达,与对照组相比差异显著(p0.05)。故参麦注射液能部分逆转A549/DTX细胞株耐药性,其作用通过诱导细胞凋亡及降低P-gp表达实现。     

MicroRNA-575靶向抑制BLID促进非小细胞肺癌细胞的增殖和侵袭

目的:通过体外实验探讨miR-575对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖与侵袭能力的影响及相关机制。方法:采用实时定量PCR法检测不同非小细胞肺癌细胞系中miR-575、BLID的表达;CCK-8法检测转染miR-575模拟物、抑制因子后不同时间A549细胞增殖情况的变化;Transwell法检测A549细胞的侵袭情况;Targetcan法及双荧光素酶检测miR-575对BLID 3'UTR端的靶向作用;Western blot法检测BLID蛋白的表达。结果:A549、SPC-A1、H1299、H1650等人非小细胞肺癌细胞系中miR-575的表达均显著高于永生化的人支气管上皮细胞系16HBE(P0.001)。MiR-575模拟物转染的A549细胞miR-575的表达明显高于对照组(P0.001),同时细胞的增殖和侵袭力增强(P0.05);反之,miR-575抑制因子转染的A549细胞miR-575的表达显著降低,且细胞的增殖和侵袭力明显降低(P0.01)。Targetscan法预测BLID可能是miR-575的下游靶基因,荧光素酶结果显示miR-575不仅能够有效抑制野生型BLID 3'UTR端的荧光素酶反应(P0.01),而且能够降低BLID的蛋白表达量(P0.01)。实时定量PCR结果显示BLID在NSCLC细胞系中均呈现显著的低表达(P0.001),且转染BLID后,NSCLC细胞的增殖和细胞侵袭被明显抑制(P0.05),而当miR-575与BLID共转染时,miR-575能够逆转BLID所抑制的细胞增殖和侵袭(P0.01)。结论:在NSCLC细胞系中,miR-575的表达上调,且能够通过直接作用于下游靶点抑癌基因BLID从而促非小细胞肺癌细胞增殖及侵袭。     

miR-363-3p靶向 TWIST1调控上皮间质转化抑制非小细胞肺癌A549细胞迁移和侵袭

目的探讨miR-363-3p靶向TWIST1调控非小细胞肺癌A549细胞迁移和侵袭的分子机制。 方法将体外培养的A549细胞分为空白对照组（细胞未做任何处理）;模拟物对照组（转染miR-363-3p模拟物阴性对照）;模拟物组（转染miR-363-3p模拟物）;后期实验另设：模拟物+ pcDNA组（转染miR-363-3p模拟物和pcDNA3.1空载体质粒）;模拟物+ TWIST1组（转染miR-363-3p模拟物和pcDNA3.1-TWIST1过表达质粒）。采用RT-PCR检测细胞中miR-363-3p的表达,Western blot检测细胞中TWIST1蛋白和上皮间质转化（EMT）相关蛋白Vimentin、E-cadherin的表达,Transwell小室实验检测细胞的迁移和侵袭。双荧光素酶报告基因实验检测miR-363-3p和TWIST1的靶向关系。两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。 结果与空白对照组和模拟物对照组比较,模拟物组A549细胞中miR-363-3p表达水平（1.00±0.08、0.97±0.05比3.82±0.45）升高,TWIST1 mRNA （1.00±0.06、0.98±0.06比0.39±0.02）和蛋白的表达水平（0.81±0.05、0.78±0.06比0.42±0.02）降低,差异具有统计学意义（P均< 0.05）。与空白对照组和模拟物对照组比较,模拟物组A549细胞Vimentin蛋白表达水平（0.58±0.04、0.55±0.05比0.36±0.03）降低,E-cadherin蛋白的表达水平（0.22±0.02、0.25±0.03比0.47±0.03）增高,迁移细胞数（85.75±5.45、83.52±6.85比53.05±4.50）和侵袭细胞数（128.26±6.15、125.95±8.05比71.64±5.75）降低,差异有统计学意义（P均< 0.05）。与模拟物对照组比较,模拟物组细胞中Vimentin蛋白的表达水平（0.55±0.05比0.36±0.03）降低,而E-cadherin蛋白表达水平（0.25±0.03比0.47±0.03）升高,迁移细胞数（83.52±6.85比53.05±4.50）和侵袭细胞数（125.95±8.05比71.64±5.75）均减少（P均< 0.05）。TWIST1是miR-363-3p潜在的靶基因。与模拟物+ pcDNA3.1组比较,模拟物+ TWIST1组A549细胞中Vimentin蛋白的表达水平（0.32±0.02比0.42±0.03）升高,而E-cadherin蛋白表达水平（0.56±0.04比0.38±0.03）降低,A549细胞的迁移数（49.45±4.22比67.52±5.05）和侵袭数（72.45±5.73比108.35±6.56）增加（P均< 0.05）。 结论miR-363-3p可通过靶向TWIST1调控EMT抑制A549细胞迁移和侵袭。     

miR-155-5p增强卵巢癌细胞UWB1.289对PARP抑制剂的敏感性

摘要 目的：探讨卵巢癌细胞UWB1.289中miR-155-5p对PARP抑制剂敏感性的影响及可能涉及的分子机制研究。方法：采用qRT-PCR技术检测miR-155-5p在有BRCA1/2突变和无BRCA1/2突变的卵巢癌组织及卵巢癌细胞中的表达情况。利用细胞转染、qRT-PCR以及Western Blot技术检测转染miR-155-5p模拟物和抑制剂的卵巢癌细胞UWB1.289中miR-155-5p的表达以及同源重组修复相关基因SIRT1、BRG1的表达。通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-155-5p与SIRT1、BRG1之间的靶向性。运用CCK-8检测卵巢癌细胞UWB1.289中miR-155-5p对PARP抑制剂敏感性的影响。结果：与无BRCA1/2突变的卵巢癌组织及卵巢癌细胞相比,miR-155-5p在有BRCA1/2突变的卵巢癌组织及卵巢癌细胞中低表达。转染miR-155-5p模拟物可增加卵巢癌细胞UWB1.289中miR-155-5p的表达,同时降低同源重组修复相关基因SIRT1、BRG1的表达;转染miR-155-5p抑制剂可下调卵巢癌细胞UWB1.289中miR-155-5p的表达,同时增加SIRT1、BRG1的表达,进一步通过双荧光素酶报告基因实验证实miR-155-5p与SIRT1、BRG1存在特异性靶向结合序列。与对照组相比,干扰同源重组修复相关基因以及miR-155-5p过表达均可增强卵巢癌细胞UWB1.289对PARP抑制剂的敏感性。结论：miR-155-5p可能通过影响同源重组修复基因增强卵巢癌细胞UWB1.289对PARP抑制剂的敏感性。