原核表达载体pET28a-EGFP的构建与表达

以质粒PEGFP-N3中增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP）基因片段为模板,利用PCR技术扩增得到EGFP基因片段,并设计引物在其2端引入酶切位点EcoRⅠ和HindⅢ,对引入酶切位点的EGFP片段和pET28a质粒进行双酶切处理后,利用T4连接酶连接得到了重组质粒pET28a-EGFP。利用热击法把得到的重组质粒pET28a-EGFP转化至E.coliBL21（Escherichia coliBL21）感受态细胞中,当大肠埃希菌LB（Luria-Bertani）培养液在600 nm下的光密度值OD600=0.4时,通过添加异丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）作为诱导剂诱导EGFP表达。结果表明：重组质粒酶切鉴定及测序结果正确。在自然光下,转化子在LB固体培养基（含1 mmol/L的IPTG和50μg/mL的卡那霉素（Kan））中菌落呈绿色。在荧光显微镜下受蓝光激发,可以清楚观察到发绿色荧光的转化子。成功构建的原核表达载体pET28a-EGFP在E.coliBL21中得到了高效表达,为以后作为荧光标记物标记食源性病原菌提供了一定的理论和技术支持。     

融合表达载体pET32a/Trx-EK-MrVIB的构建及在大肠杆菌中表达

人工设计合成芋螺毒素基因Mr VIB来构建表达载体p ET32a/Trx-EK-Mr VIB,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)plys S进行诱导表达。菌体经超声破碎后利用Ni-NTA琼脂糖柱进行亲和层析纯化融合蛋白,SDS-PAGE电泳分析融合蛋白表达。结果表明融合表达载体p ET32a/Trx-EK-Mr VIB经PCR扩增和测序鉴定具有正确的开放阅读框。SDS-PAGE电泳显示融合蛋白在大肠杆菌中获得高效可溶性表达,经一步亲和层析获得纯度大于90%的融合芋螺毒素达73.6 mg/L。本文成功构建了融合表达载体p ET32a/Trx-EK-Mr VIB,融合芋螺毒素Trx-EK-Mr VIB在大肠杆菌中获得高效可溶性表达。     

靶向性DNA甲基化酶在pET32a原核表达载体中的表达和鉴定

目的:在pET32a原核表达载体中表达融合myc-6his标签的靶向性甲基化酶B1-3a并进行鉴定。方法:以含有B1-3a基因的pcDNA4.0-B1-3a-myc-6his质粒为模板,通过PCR的方法扩增获得融合有myc-6his标签序列的目的区段B1-3a,然后克隆入表达载体pET32a;以SDS-PAGE和Western blot方法对表达产物进行鉴定。结果:表达产物中在分子量43kD左右可见与目的蛋白分子量相符的条带,该条带可被6his标签单克隆抗体特异识别。结论:正确构建了靶向性甲基化酶B1-3a的原核表达载体,靶向性甲基化酶能够在pET32a中成功表达。     

分选酶A在pET32a(+)原核表达载体中的表达和鉴定

旨在pET32a(+)原核表达载体中表达金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中的转肽酶分选酶(SrtA)并进行鉴定.以含有pET22-srtA质粒为模板,设计并合成引物,PCR扩增得到SrtA△N24和SrtA△N59基因,经过BamH Ⅰ、Xho Ⅰ酶切,克隆入表达载体pET32a(+)中,构建重组载体pET32a-SrtA△N24及pET32a-SrtA△N59,并转化入大肠杆菌BL21(DE3).经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blotting对表达产物分别进行分析和鉴定.然后对重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达条件进行了优化.结果显示重组载体pET32a-SrtA△N24和pET32a-SrtA△N59分别表达出相对分子量为约42 kD和37 kD的融合蛋白,经SDS-PAGE和Westem blotting检测显示其分子量与预期的大小相符合.成功构建了重组质粒pET32a-SrtA△N24和pET32a-SrtA△N59,并且在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效融合表达.     

小麦TaMBD2原核表达载体的构建和诱导表达

构建了小麦甲基结合域蛋白基因TaMBD2的原核表达载体pGEX-TaMBD2,并在大肠杆菌BL21(DE3)工程菌株中优化了融合蛋白GST-TaMBD2的诱导表达条件.结果表明,用0.3、0.5和1.0 mm01.L-1的IPTG诱导后,融合蛋白GST-TaMBD2均能有效表达,以1.0mmol·L-1IPTG诱导的效果最好;从诱导表达的时间来看,3种浓度IPTG诱导1 h后融合蛋白均开始表达,且表达量随着诱导时间的延长而逐渐增加,但在诱导6 h后的表达量增加幅度不大,因此确定诱导融合蛋白GST-TaMBD2表达的最佳IPTG浓度为1.0 mm01.L-1诱导时间为6 h.     

花生Δ~(12)脂肪酸脱氢酶基因高效表达载体构建与原核表达(英文)

花生是世界范围内广泛种植的重要油料作物之一,其种子中富含油酸和亚油酸。△12脂肪酸脱氢酶(FAD2)是亚油酸合成的关键酶,催化油酸(18:1)在△12位上脱氢生成亚油酸(18:2),但由于△12脂肪酸脱氢酶本身的特性,目前还没有有效的方法将其纯化并在蛋白水平作进一步的研究,尚需对其结构和功能之间以及表达调控进行更深入全面的研究。本文利用从花生中克隆的△12脂肪酸脱氢酶基因(GenBank接受号为AY1006)构建高效表达载体,把花生?12脂肪酸脱氢酶基因全长序列插入到大肠杆菌高效表达载体pRSETB中,构建了pRSET/HO-A融合表达载体,并转化到大肠杆菌表达菌BL21(DE3)pLysS中,在IPTG诱导下,pRSET/HO-A融合表达载体在BL21(DE3)pLysS菌株中高效表达了?12脂肪酸脱氢酶。利用Clon-Tech蛋白纯化Kit进一步分离了目的蛋白,同时加入外源性底物油酸在20℃温育6h后,进行脂肪酸甲酯化处理,通过气相色谱(GC)和气相色谱/质谱(GC-MS)分析表明,所编码的酶具有?12脂肪酸脱氢酶的活性,能将外源性的底物油酸转化为亚油酸,转化率为11.8%。花生△12脂肪酸脱氢酶基因的原核表达目前国内外还未见报导,本实验为其进一步的大量纯化和结构功能分析奠定了基础。     

CDH17/pcDNA3.1(-)真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建肝肠钙黏连蛋白(CDH17)基因pcDNA3.1(-)真核表达质粒,为进一步研究胃癌发病的分子机制和生物学行为以及寻找新的抗转移措施奠定理论基础。方法:用Trizol Reagent抽提胃腺癌组织中总RNA,采用逆转录巢式PCR方法扩增CDH17目的片段,双酶切纯化PCR产物及pcDNA3.1(-),再将CDH17基因片断插入pcDNA3.1(-)线性质粒,即构建成CDH17/pcDNA3.1(-)真核细胞表达质粒,将质粒转染感受态细胞DH5a,筛选阳性克隆行双酶切鉴定及DNA测序鉴定。结果:DNA测序结果与预期目的片段序列一致。结论:CDH17/pcDNA3.1(-)真核细胞表达质粒构建成功。     

MAGE-3原核表达载体的构建和表达

通过RT-PCR扩增957bp的MAGE-3全长编码序列,将该片段克隆至Pgex-4T-2原核表达载体,转化大肠杆菌BL-21,经IPTG诱导表达,并经12%SDSPAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝染色及Western blot鉴定,证明了目的基因的有效表达,目的蛋白高达细菌总蛋白的32%。表达产物经Glutathione Sepharose 4B 纯化后,每100mL菌液最终可获得3mg的目的蛋白,蛋白纯度在90%以上。纯化的GST-MAGE-3蛋白在体外冲击树突状细胞,能诱导特异性CTL杀伤肿瘤细胞活性。     

串联亲和纯化原核表达载体的构建

【目的】构建串联亲和纯化原核表达载体,用于研究细菌中(生理状态或接近生理条件下的)蛋白-蛋白相互作用。【方法】设计并合成两条串联亲和标签序列,分别可以在靶蛋白N端和C端融合Protein G和链亲和素结合肽(Streptavidin binding peptide,SBP)标签;以pUC18载体为骨架,去除原有的阻遏蛋白基因,构建组成型表达载体pNTAP和pCTAP。【结果】成功构建N端和C端标签表达载体pNTAP和pCTAP,它们在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)、肠出血性大肠杆菌O157:H7和痢疾杆菌福氏5型M90T菌株中都可以实现表达。【结论】本实验构建的两个串联亲和纯化表达载体可以在部分革兰氏阴性细菌中表达,为研究细菌内蛋白-蛋白相互作用及致病菌毒力蛋白的作用机制奠定了基础。     

果蝇dro基因的克隆与原核表达载体构建

目的:检测drosocin对农作物致病菌的抑菌作用,构建含drosocin基因dro的原核表达载体。方法:以黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)DNA为模板,由特异引物通过PCR方法扩增dro基因的编码序列,将此片段连接在克隆载体pMD18-T上进行测序,再用酶切-连接的方法将目的片断亚克隆到携带有6×组氨酸二氢叶酸还原酶标签的原核表达载体pQE40上。结果:克隆得到大小为195bp的dro基因片段,并成功构建了原核表达载体pQE40/dro。结论:克隆到dro基因,构建了原核表达载体pQE40/dro,并获得了转化株M15[pREP4]/dro。     

人白介素-38原核表达载体的构建及其蛋白表达、纯化

$目的%构建人白介素(interleukin,IL)-38原核表达载体,原核表达IL-38重组蛋白、纯化及活性分析。[方法]PCR扩增IL-38成熟蛋白编码区,构建IL-38原核表达载体p ET-44-h IL-38,转化BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导,表达IL-38重组蛋白,并利用其C末端的组氨酸标签进行镍离子亲和层析纯化,将纯化的重组IL-38作用于脂多糖(LPS)诱导的THP-1细胞,研究纯化IL-38蛋白的生物学活性。[结果]构建的IL-38原核表达载体测序结果与Gen Bank中基因序列一致;IPTG诱导产生的IL-38蛋白主要以可溶性形式存在,纯化的目的蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳分析和Western Blot鉴定发现,蛋白纯度可达98%,细胞实验证明纯化的目的蛋白具有较高的生物学活性。[结论]成功构建了IL-38的原核表达载体,制备了具有生物活性的IL-38重组蛋白。     

建鲤leptin两种原核表达载体的构建和表达

使用SignalP-4.0软件预测信号肽剪切位点,设计引物扩增建鲤(Cyprinus carpio var.jian)leptin基因(jlLEP-A1,jlLEP-B)不含信号肽的ORF区域。扩增产物分别连接到pET-32a(+)和pGex-4T-1原核表达载体,构建重组质粒,测序验证插入位点的正确性。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白pET-32a(+)/jlLEP-A1,pET-32a(+)/jlLEP-B和pGex-4T-1/jlLEP-A1,pGex-4T-1/jlLEP-B。结果表明,在37℃和1 mmol/L IPTG的条件下诱导5 h,重组蛋白表达量最大。SDS-PAGE电泳显示重组蛋白主要以可溶蛋白形式存在。这一结果为后续的建鲤leptin基因功能研究奠定了基础。     

鼻咽癌侯选抑瘤基因BRD7原核表达载体的构建及其表达(英)

BRD7基因是一个鼻咽癌侯选抑瘤基因,为了构建BRD7基因的原核表达载体并使其在大肠杆菌得到表达,设计了带有SalⅠ,NotⅠ酶切位点的引物,以已构建好的质粒pGEM-T Easy/BRD7为模板,用PCR扩增出BRD7基因的完整阅读框架,并用SalⅠ,NotⅠ酶切PCR产物和原核表达载体PGEX-4T-2,然后用T4 DNA连接酶将其连接,得到重组表达质粒PGEX-4T-2/BRD7,经双酶切鉴定和测序验证,表达载体构建正确.重组表达质粒转化感受态大肠杆菌Jm105后用IPTG诱导,成功表达了一分子质量约为90 ku的融合蛋白;37℃诱导4 h后,SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳后,经扫描分析该融合蛋白产量占菌体蛋白总量28.48%, 蛋白质印迹(Western-blot)证实了该融合蛋白的表达获得成功.这为BRD7基因的蛋白纯化及抗体制备,进一步开展其功能研究奠定了基础.     

重组原核表达载体pQE30-HPV58L1的构建及鉴定

目的：构建重组原核表达载体以获得HPV58L1活性蛋白,为进一步研制HPV58基因工程疫苗打下基础。方法：用聚合酶链反应（PCR）扩增HPV58L1完整编码区基因,将PCR扩增产物克隆至pUC19质粒中并测序。利用pQE30质粒载体构建重组原核表达载体pQE30-HPV58L1,并通过酶切电泳验证重组结果的正确性。结果：PCR扩增出1.6Kb特异性片段,经克隆至pUC19后测序表明序列同源性与Gen-Bank报道一致。重组质粒pQE30-HPV58L1酶切后显示其大小约5.1Kb,酶切图谱与预期相同。结论：成功构建了重组原核表达载体pQE30-HPV58L1。     

原核和真核双表达载体的构建及功能分析

为了构建能驱动重组蛋白在真核及原核表达系统同时表达的双表达载体,该研究将T7启动子和T7终止子分别克隆到真核表达载体pIRES-EGFP启动子CMV下游和新霉素抗性基因上游,构建双表达载体pIRES-CMV/T7-EGFP,并进一步将增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP)基因替换为人转铁蛋白(human transferrin,HTrf)基因,构建得到pIRES-CMV/T7-HTrf载体。将构建成功的重组载体转染中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞和转化大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli) BL21,再利用荧光显微镜、流式细胞术及Western blot分析重组蛋白是否表达及其表达水平。荧光显微镜观察、流式细胞仪分析及Western blot检测显示eGFP和HTrf既能在CHO细胞中成功表达,也能在大肠杆菌BL21中表达。该研究成功构建了在原核及真核表达系统中均可以表达重组蛋白的双表达载体。     

犬瘟热病毒H基因原核表达载体的构建

利用本实验以前构建的含有犬瘟热病毒H基因的pMD18-T质粒,根据pMD18-T-H序列设计带有XbalI和HindⅢ酶切位点的引物,对H基因进行PCR扩增,得到约1800bp左右的片段。该片段被克隆到pMD18-Tsimple载体上,用XbalI和HindⅢ进行单、双酶切鉴定．筛选阳性克隆。将阳性克隆再用XbalI和HindⅢ进行双酶切,纯化回收CDVH基因片段。将原核表达载体pPROEXTMHTa、pet-30b用同样的方法酶切,回收载体片段。将CDVH基因片段分别用T4连接酶连接到回收的pPROEXTMHTa、pet-30b载体上,构建原核表达载体质粒pPROEXTMHTa-H和pet-30b-H。再用XbalI和HindⅢ进行单、双酶切鉴定阳性载体。本实验为下一步H蛋白表达、纯化并作为CDV诊断用抗原及CD的免疫预防奠定了基础。     

玉米叶绿体表达载体的构建及AsRED基因原核表达

从玉米幼嫩叶片中提取玉米叶绿体基因DNA,通过PCR克隆出叶绿体同源重组片段trnA和trnI、叶绿体特异性启动子Prrn以及终止子psbA.构建玉米叶绿体表达载体pBAIRTARED,含有一个人工操纵子,其中,筛选标记基因aadA和红色荧光蛋白报告基因AsRED处于Prrn启动子和psbA终止子控制.将构建的载体转化大肠杆菌BL21（DE3）,观测到重组细胞呈现红色,表明构建的载体可以用于玉米叶绿体转化以及表达报告基因.     

人IL-3基因原核表达载体的构建及表达

目的:构建人IL-3基因原核表达载体pET32a-IL-3,并在大肠杆菌中诱导表达。方法:通过佛波酯(TPA)和植物球血凝素(PHA)刺激人T淋巴细胞系Jurkat细胞,增加IL-3mRNA表达水平,提取mRNA,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)获得cDNA,以Jurkat细胞cDNA为模板,通过PCR方法扩增得到人IL-3基因,将其克隆入原核表达载体pET32a(+)中,将重组质粒转化入大肠杆菌宿主菌株BL21中,以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白表达,并通过改变IPTG浓度,诱导时间,诱导温度等条件最终实现蛋白的可溶性表达。表达产物用SDS-PAGE检测表达情况。结果:酶切鉴定和测序结果证明成功构建了原核表达载体pET32a-IL-3。SDS-PAGE检测结果证明实现了人IL-3基因在大肠杆菌中的可溶性表达。结论:成功构建了人IL-3基因的原核表达载体并在大肠杆菌中获得了良好的表达。