途径工程改造谷氨酸棒杆菌产莽草酸

莽草酸是一种芳香族中间代谢产物,也是合成抗禽流感药物磷酸奥司他韦的前体。目前,国内外莽草酸的生产主要依靠成本较高,周期较长的植物提取法。微生物发酵法合成莽草酸具有生产成本低、周期短等优势成为研究的热点。为了构建产莽草酸的重组谷氨酸棒杆菌,此次研究从基因组水平上对谷氨酸棒杆菌体内的莽草酸代谢途径进行代谢工程改造。通过阻断莽草酸分解代谢途径、解除反馈抑制以及阻断竞争性代谢途径的策略,实现了莽草酸产量的大幅提升。结果显示,所构建的重组谷氨酸棒杆菌SKA06经72 h摇瓶发酵,莽草酸产量达到7.61 g/L,相较出发菌种提升了68倍。并且,基于染色体工程的遗传改造策略克服了引入质粒带来传代不稳定、需要添加抗生素等问题,可以为莽草酸工程菌种的选育提供重要参考。     

微生物代谢合成法在莽草酸及其衍生物研究中的应用

天然产物莽草酸(Shikimic acid)具有抗肿瘤、抗血栓等药理活性,在生物及化学合成中扮演着重要角色,而倍受关注.本文综述了近年来国内外有关微生物代谢合成法在莽草酸及其衍生物研究中的应用,为莽草酸的开发利用提供参考.     

3-脱氢莽草酸生物合成的代谢工程

3-脱氢莽草酸,是芳香族氨基酸生物合成代谢途径中一种重要的中间产物,可作为一些化学合成制剂和药物中间原料。这样以无毒可再生物质为起始原料的合成方法与传统的有机合成化学制剂的方法相比,对环境更加有利。此外,它还是一种十分有效的抗氧化剂。工业上一般采用化学合成法和发酵法来生产3-脱氢莽草酸,随着代谢工程的兴起,使得更加理性改造菌株成为可能,这更加促进了发酵法的广泛应用。本文主要介绍了代谢工程在生物合成3-脱氢莽草酸生产菌改造中的应用情况,其中涉及3-脱氢莽草酸生物合成途径中相关基因及其酶的调控、中心代谢途径的改造和3-脱氢莽草酸合成支路的修饰等,并探讨了将来的发展前景。     

八角茴香中莽草酸提取和纯化工艺的研究

本文对八角茴香中莽草酸的提取和纯化工艺进行优化研究.结果表明,莽草酸的最佳提取工艺条件为:常规水浸提,温度80℃,固液比1:15,提取时间100 min,莽草酸的提取量达到0.1795 g.最佳纯化工艺:莽草酸浸膏搅拌硅胶,柱层析,乙酸乙酯洗脱,莽草酸洗脱量达到0.1742 g,真空浓缩至干,甲醇和水混合结晶,得含量98%的纯品莽草酸.     

芳香族香料化合物生物合成研究进展

芳香族化合物在香料中占很大的比重,传统生产方式有化学合成和植物提取。化学合成依赖于石油资源,并具有环境不友好、反应条件恶劣等缺点。植物提取方法受限于植物资源,且占用耕地。近年来,随着代谢工程和合成生物学技术的发展,利用可再生原料,微生物合成芳香族香料化合物成为一种新的生产方式。文中介绍了大肠杆菌和酵母菌等模式微生物合成芳香族香料的研究进展,包括利用莽草酸途径合成香兰素等,聚酮途径合成覆盆子酮等。综述重点介绍了生物合成途径解析、人工合成途径创建及代谢调控等,为微生物发酵法生产芳香族香料化合物提供参考。     

雪松松针中莽草酸的纯化方法研究

为建立莽草酸的纯化方法,以莽草酸的含量为指标,对雪松松针水提液的醇沉、大孔吸附树脂单用或与不同柱层析合用的纯化方法进行了探索。最终确定的莽草酸的纯化工艺流程为:提取-醇沉-柱层析-重结晶,其中醇沉法可以将莽草酸的含量由12.69%提升到20.08%,大孔吸附树脂柱层析法单用可以将莽草酸的含量由20.08%提升到35.73%,回收率均超过95%;大孔吸附树脂柱结合硅胶柱层析法可得到纯度为80.05%的莽草酸近白色固体,回收率达60.04%,再经二氯甲烷和甲醇重结晶得到纯度为96.54%的莽草酸白色粉末,表明该纯化方法简单可行,重复性好,易于实施工业化生产。     

八角莽草酸不同纯化方法的比较研究

利用重结晶、醇沉和柱层析等方法对八角莽草酸进行提取纯化,并比较了不同方法的纯化结果。结果表明:乙醇沉淀法的纯化效果明显,醇沉后进行硅胶柱或大孔树脂柱层析分离纯化莽草酸的效果都大为提高,纯度都达到82%以上。利用一种新的洗脱体系-乙酸乙酯和甲醇的混合溶剂,用于硅胶柱层析法纯化莽草酸,能将莽草酸与其近似物很好地分离,纯度达到94.6%,纯化的效果优于大孔树脂柱。最终确定了高效提取纯化莽草酸的工艺流程:微波提取——醇沉法初步纯化——柱层析法进一步纯化。     

理性设计和构建过量合成莽草酸的大肠杆菌代谢工程菌

利用代谢工程手段理性改造野生大肠杆菌的莽草酸(Shikimic acid,SA)合成途径及相关代谢节点,以构建高产莽草酸的工程菌株.根据细胞代谢网络分析,利用Red-Xer重组系统连续删除了野生型大肠杆菌CICIMB0013的莽草酸激酶基因(aroL、aroK),葡萄糖磷酸转移酶系统(PTS)的关键组分EIICBglc的编码基因(ptsG)以及奎宁酸/莽草酸脱氢酶基因(ydiB)并系统评价了基因删除对细胞的生长、葡萄糖代谢和莽草酸积累的影响.aroL、aroK的删除阻断了莽草酸进一步转化成为莽草酸-3-磷酸,初步提高莽草酸的累积.删除ptsG基因使大肠杆菌PTS系统部分缺失,细胞通过GalP-glk(半乳糖透性酶-葡萄糖激酶)途径,利用ATP将葡萄糖磷酸化后进入细胞.利用该途径运输葡萄糖能够减少PEP的消耗,使得更多的碳代谢流进入莽草酸合成途径,从而显著提高了莽草酸的产量.在此基础上删除ydiB基因,阻止了莽草酸合成的前体物质3-脱氢奎宁酸转化为副产物奎宁酸(Quinic acid,QA),进一步提高了莽草酸的累积.初步发酵显示4个基因缺失的大肠杆菌代谢工程菌生产莽草酸的能力比原始菌提高了90多倍.     

莽草酸生物合成途径的调控

莽草酸是合成生物碱等许多其它物质的前体.近年来,莽草酸作为临床上惟一有效的抗禽流感药物--达啡的原料而倍受关注.简述了莽草酸生物合成的途径,着重从基因工程角度分析了莽草酸合成过程中的关键酶及其对莽草酸产量的影响,旨在为研究和开发微生物工程菌生产莽草酸提供参考.     

使用动态分子开关调控大肠杆菌生产莽草酸

莽草酸是大肠杆菌合成芳香族氨基酸的中间代谢物,也是抗流感药物"达菲"的重要合成前体。合成莽草酸需要截断莽草酸途径,导致芳香族氨基酸无法合成,因此面临细胞生长受到抑制的问题。使用动态调控策略通过将细胞生长和莽草酸的合成相互分离,可以提高菌株的生产性能。通过使用生长偶联型启动子和降解决定子(Degrons),组建动态分子开关。利用该动态分子开关实现细胞生长与莽草酸合成分离,在5L发酵罐中经过72h发酵得到了14.33g/L的莽草酸。结果表明,这种动态分子开关可以通过调控靶蛋白丰度来改变碳流量平衡,使菌株获得更优秀的生产性能。     

改进莽草酸合成代谢的大肠杆菌工程化研究新进展

莽草酸是芳香族氨基酸合成中的重要中间产物,具有广泛的药用价值,是抗流感药物"达菲"的重要合成前体。微生物发酵生产莽草酸具有许多优点,其中大肠杆菌常用于微生物大规模发酵生产应用。通过对大肠杆菌进行代谢工程改造,是构建工业化莽草酸高产菌的主要技术手段。磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(phosphoenolpyruvate:carbohydrate phosphotransferase system,PTS)是大肠杆菌细胞内参与葡萄糖从膜间质转运和磷酸化到胞内的主要活性转运系统,影响莽草酸合成前体磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的利用率。通过对PTS系统的定向修饰和改造,调节细胞内代谢流向,提高碳源利用率,增加莽草酸前体合成量,结合对代谢途径中的特定修饰,能够构建出较为理想的莽草酸高产菌。研究显示在10 L放大体系中最佳产率可达0.36 mol/mol,莽草酸浓度可达84 g/L。本文针对代谢改造中莽草酸途径和葡萄糖转运系统的改造方面进行简单概述,并综述了近年来有关此方面的最新研究进展。     

奎尼酸生物合成的代谢工程

奎尼酸及其衍生物氢醌和苯醌等是一类重要的化工原料,可作为一些化学合成制剂和药物中间原料,且在食品和化学工业中有着广泛的应用。目前奎尼酸的制备方法有植物提取法、化学合成法、酶工程法和微生物发酵法,其中微生物发酵法是近年发展起来的一种十分经济有效的方法。在介绍奎尼酸的制备方法的基础上重点综述了应用代谢工程在生物合成奎尼酸基因工程菌的改造中的研究进展,其中涉及奎尼酸生物合成途径中相关基因及其酶的调控、中心代谢途径的改造和修饰等,并探讨了将来的发展前景。     

奎尼酸的生物合成与应用

奎尼酸是一种具有极高价值的精细化工产品和医药中间体,在医药、食品、化工等行业均有广泛的应用价值。奎尼酸广泛存在于多种植物中,其咖啡酰类衍生物在抗病毒、治疗心血管疾病等研究中得到越来越多的关注和应用。目前获得奎尼酸的方法主要有4种,即植物提取法、化学合成法、酶工程法和微生物发酵法。随着分子生物学的不断发展,结合现代生物技术,应用基因工程方法,必将成为获得奎尼酸的重要途径。本文综述奎尼酸的分布、生物合成及其应用。     

利用代谢工程改善大肠杆菌的3-脱氢莽草酸生产

3-脱氢莽草酸是芳香族氨基酸合成代谢途径中的一种重要中间产物。除可作为一种高效的抗氧化剂,还可用于合成己二酸、香草醛等一些重要的化工产品,具有重要的应用价值。相关研究证明具有去酪氨酸反馈抑制的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因aroFFBR以及转酮醇酶基因tktA可以有效影响3-脱氢莽草酸的过量合成。通过增加aroFFBR和tktA串联过量表达的拷贝数,可使工程菌株在摇瓶发酵条件下3-脱氢莽草酸产量提高2.93倍。通过同源重组无痕基因敲除技术依次敲除出发菌大肠杆菌Escherichia coli AB2834的乳酸、乙酸、乙醇等副产物合成途径中的重要基因ldhA、ackA-pta和adhE,可使工程菌株的3-脱氢莽草酸产量进一步提高,达到了1.83 g/L,是初始出发菌株大肠杆菌E.coli AB2834产量的6.7倍。利用5 L发酵罐进行分批补料发酵,62 h后工程菌株3-脱氢莽草酸产量达到了25.48 g/L。本研究可为构建有应用前景的3-脱氢莽草酸生产菌株提供重要参考。     

基于莽草酸途径微生物合成芳香族化合物及其衍生物的研究进展

芳香族化合物是一类重要的天然产物,在自然界中广泛存在,应用于食品、医药、化工等多个领域,主要通过化学合成、植物提取等方式获得。近年来,随着石化资源减少、人类环保意识的加强,微生物合成芳香族化合物及其衍生物成为热点。莽草酸途径合成的芳香族化合物及其衍生物多种多样。现重点综述通过莽草酸途径合成的"达菲"药物前体莽草酸、大宗化学品己二酸前体顺,顺-粘康酸、芳香族氨基酸及其他高附加值芳香族氨基酸衍生物的微生物合成研究进展,为建立生产高附加值化合物的细胞工厂提供参考。     

八角茴香春果和秋果以及不同部位的莽草酸含量分析

采用HPLC法对不同季节和不同部位的八角茴香药材主成分莽草酸的含量进行分析,发现枝条、叶片、春果、秋果的莽草酸含量依次为2.64%、4.94%、8.63%、12.16%;色谱条件:Venusil HILIC(5μm,4.6 mm×250 mm)色谱柱,流动相:乙腈-0.5%三氟乙酸(95:5),流速1.0 mL·min~(-1),检测波长为210 nm。莽草酸进样量在0.001～6μg范围内线性关系良好。莽草酸的线性回归相关系数r=0.9984,平均回收率为98.4%,相对标准偏差(RSD)为1.26%。该研究为制定八角茴香药材质量检测标准提供了简便、快速、准确的方法。     

响应曲面法优化马尾松中莽草酸的超声提取工艺

以马尾松松针为原料,采用超声波提取法从松针粉中提取莽草酸,通过考察料液比((VH2O∶m松针粉,mL:g)、提取时间、提取温度及超声波功率等因素对松针中总莽草酸含量的影响,并在单因素试验的基础上,选取料液比、提取时间、超声波功率3个变量,进行Box-Behnken中心组合设计优化,获得马尾松松针中莽草酸的最佳提取工艺参数为料液比1∶26,提取时间为46min,超声波功率为359 W,此条件下莽草酸的提取率为1.948%。     

核黄素的制备与应用研究

核黄素是一种水溶性的微生素,主要以黄素单核苷酸和黄素腺嘌呤二核苷酸的形式,参与机体的氧化还原反应,与机体的能量代谢密切相关。核黄素的制备方法有提取法、化学合成法、半发酵半合成法、微生物发酵法,目前微生物发酵法为主要的商业化生产方法。核黄素产品广泛应用于医药、食品添加剂、饲料添加剂行业,具有较高的应用价值。     

微生物法生产L-丝氨酸代谢工程研究进展

L-丝氨酸是生物体内一种重要的中间代谢产物,为甘氨酸等多种氨基酸、核苷酸、胆碱、磷脂的合成前体,现已广泛应用于医药、食品、化妆品等领域。L-丝氨酸的生产方法有蛋白质水解提取法、化学合成法、转化法及微生物发酵法,其中微生物发酵法具有原料廉价、环境污染小、产物纯度高等优点。系统综述了微生物发酵法生产L-丝氨酸所涉及的代谢工程策略,包括微生物合成L-丝氨酸的各种代谢调控机制及相应采取的改造措施和效果,并探讨了L-丝氨酸育种技术未来的发展趋势。     

微生物生产3-羟基丁酮研究进展

3-羟基丁酮是一种重要的化学合成中间体和多功能材料,广泛应用于食品、制药、化工等领域。相比化学合成法和生物酶转化法,微生物发酵法具有低成本、高纯度、高产率等特点。本文在详细总结微生物发酵生产3-羟基丁酮在菌种选育、代谢机制以及高产策略等方面研究进展的基础上,展望了微生物发酵法生产3-羟基丁酮的优势和发展方向。