黄芩苷对人肝癌细胞增殖抑制及放疗增敏作用

目的:探讨黄芩苷对人肝癌细胞Hep G2增殖抑制及放疗增敏作用。方法:以人肝癌细胞株Hep G2为研究对象,用CCK-8法和流式细胞仪检测黄芩苷对肝癌细胞增殖的影响和肝癌细胞放射敏感性的改变。结果:CCK-8法检测黄芩苷对Hep G2的生长有显著抑制作用且具有剂量依赖性,与阴性对照组对比差异有统计学意义(P0.05)。黄芩苷能使处于G0/G1、G2/M期的细胞减少,S期细胞增加。同时,黄芩苷对Hep G2放疗具有增敏作用。结论:黄芩苷可抑制人肝癌细胞增殖,可能与影响细胞周期有关;黄芩苷能增强肝癌细胞放射敏感性。     

NAIF1对肝癌细胞 HepG2 增殖与迁移能力的影响

目的:在肝癌细胞Hep G2中过表达外源NAIF1(核凋亡诱导因子1),探讨NAIF1的亚细胞定位以及对Hep G2增殖和迁移能力的影响。方法:以真核表达质粒p EGFP-N1为对照组,p EGFP-N1-NAIF1为实验组,瞬时转染肝癌细胞Hep G2,利用免疫印迹方法检测NAIF1蛋白表达效率;以DAPI染核,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白定位,确定NAIF1的亚细胞定位;通过MTT方法绘制细胞增殖曲线;通过transwell小室法检测NAIF1对Hep G2迁移能力的影响。结果:在肝癌细胞Hep G2中,外源表达NAIF1主要定位于细胞核;与对照组Hep G2/p EGFP-N1相比,Hep G2/p EGFP-N1-NAIF1的细胞增殖、迁移能力下降(P<0.05)。结论:外源表达NAIF1蛋白定位于Hep G2细胞核,过表达NAIF1抑制Hep G2的细胞增殖与迁移能力,NAIF1可能作为肝癌治疗的潜在靶点。     

利用TALEN技术建立恒河猴TRIM5α基因突变细胞株

利用TALEN技术建立恒河猴TRIM5α基因突变细胞株,为进一步研究TRIM5α基因的功能奠定基础。构建针对TRIM5α打靶基因的TALEN,通过点突变的方法获得包含TRIM5α第7个外显子中打靶位点1 211-1 224的基因序列并构建点突变donor载体。将打靶TRIM5α基因的TALEN质粒和donor质粒电转入恒河猴肾细胞(LLC-MK2)中,无限稀释法获得单克隆细胞系,通过抽提基因组DNA,再利用PCR技术扩增目标序列并测序筛选出TRIM5α碱基缺失(1 215-1 216)和点突变(1 213-1 215,1 217)的细胞系。通过共转TALEN质粒和点突变的donor质粒筛选获得了TRIM5α基因敲除和TRIM5α基因点突变的LLC-MK2细胞系。     

打靶恒河猴CD4~+ T细胞的TRIM5α基因影响其感染HIV的能力

目的:探讨打靶恒河猴CD4~+ T细胞的TRIM5α基因对其感染HIV-1能力的影响。方法:从恒河猴的外周血中通过磁珠分选获得CD4~+ T细胞,并采用流式检测阳性率。构建打靶TRIM5α基因的TALEN质粒,通过电转导入CD4~+ T细胞,流式分选出转染TALEN质粒的细胞,提取基因组T7E1酶切检测打靶效率。HIV-1病毒感染打靶TRIM5α的CD4~+ T细胞,并通过ELASA检测病毒感染的情况。结果:成功地从恒河猴的外周血中分选出了CD4~+ T细胞,流式检测阳性率为99.5%。打靶TRIM5α基因的TALEN质粒转染CD4~+ T细胞的转染效率约为24.8%,并可成功打靶TRIM5α,打靶效率约为40%。ELASA检测结果表明打靶TRIM5α的恒河猴CD4~+ T细胞对HIV病毒的感染能力增强。结论打靶恒河猴CD4~+ T细胞的TRIM5α基因可使其易感HIV病毒,为进一步建立恒河猴HIV-1感染动物模型奠定基础。     

肝星形细胞分泌的趋化因子CXCL1在肝癌转归中的作用

该文探讨了人肝星形细胞(hepatic stellate cells,HSC)对肝癌细胞(Hep G2、SMMC-7721)的迁移、侵袭能力和上皮–间质转化(epithelial-msenchymal transition,EMT)的影响及其机制。采用条件培养法培养肝癌细胞,利用细胞划痕和Transwell实验分析肝星形细胞对肝癌细胞的迁移和侵袭作用。Western blot分析肝星形细胞自身及其分泌到培养液中趋化因子CXCL1[chemokine(C-X-C motif)ligand 1]和肝癌细胞的CXCL1受体2—CXCR2(CXCL1 receptor 2)的表达量,以及条件培养下肝癌细胞中p-PI3K、p-AKT、p-GSK-3β和Snail的表达变化。激光共聚焦显微术和Western blot检测肝癌细胞上皮标志物E-cadherin、间质标志物N-cadherin和Vimentin的表达变化。结果显示,在HSC中大量表达并分泌趋化因子CXCL1,而肝癌细胞Hep G2、SMMC-7721中高表达CXCR2。肝癌细胞通过条件培养后,细胞形态改变,细胞黏附下降,细胞迁移和侵袭能力增强,上皮标志物E-cadherin蛋白表达下调、间质标志物N-cadherin蛋白和Vimentin蛋白表达上调,PI3K/AKT信号通路中的关键成员PI3K和AKT磷酸化水平上调,p-GSK-3β和转录因子Snail表达上调。在肝癌细胞条件培养下加入CXCR2受体的特异性抑制剂(SB265610)后,肝癌细胞上皮标志物E-cadherin蛋白表达上调、间质标志物N-cadherin蛋白和Vimentin蛋白表达下调,p-PI3K、p-AKT、p-GSK-3β和Snail的表达下调。以上结果说明,肝星形细胞可能通过CXCL1/CXCR2轴活化PI3K/AKT信号通路并最终促进肝癌细胞上皮–间质转化。     

野鸦椿酸对人肝癌细胞的抑制作用及机理研究

探讨圆齿野鸦椿中野鸦椿酸(EA)对人肝癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响及其机制研究。从圆齿野鸦椿果皮中提取得到EA,通过培养人肝癌细胞Hep G2细胞,以MTT法分析EA对Hep G2细胞增殖的影响,流式细胞术评价不同浓度(20、40、80μmol/L)的EA对Hep G2细胞的凋亡状态和周期分布情况,细胞划痕、Transwell小室实验考察对Hep G2细胞侵袭转移能力的变化,用Western blot法和荧光定量PCR法检测野鸦椿酸对上皮-间质转化(EMT)相关标志物E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、MMP-2和MMP-9的蛋白和mRNA表达的影响。结果显示,EA抑制人肝癌细胞Hep G2细胞的增殖,24、48、72 h的IC50分别为32. 16±4. 58、26. 45±3. 79、和16. 76±4. 01μmol/L。随EA浓度的增大,细胞的凋亡率逐渐升高,且发生显著的G0/G1期阻滞。EA可降低Hep G2细胞的侵袭和迁移能力,上调E-Cadherin的蛋白和mRNA的水平,下调N-Cadherin、Vimentin、MMP-2和MMP-9的蛋白和mRNA表达。EA抑制人肝癌细胞增殖和侵袭转移能力,可能与其调控EMT相关信号通路有关。     

叶酸修饰四代聚酰胺-胺型枝状聚合物纳米粒靶向肝癌细胞HepG2的研究

目的该研究旨在探讨叶酸修饰四代聚酰胺-胺型枝状聚合物纳米粒对肝癌Hep G2靶向效果,为构建新型的靶向肝癌的纳米递送系统提供实验数据。方法 MTT法确定Hep G2细胞摄取PAMAM NPs和PAMAM-叶酸NPs适当的浓度;通过激光共聚焦和荧光显微镜定性观察Hep G2对罗丹明B标记的PAMAM NPs和PAMAM-叶酸NPs的摄取;并采用流式细胞计数仪定量研究Hep G2细胞对两者的摄取差别;尾静脉注射荷Hep G2瘤裸鼠研究两者体内分布情况。结果 PAMAM NPs和PAMAM-叶酸NPs的浓度在0.2 mg/m L时细胞存活率较高且对Hep G2细胞的毒性较小。激光共聚焦断层扫描显示Hep G2细胞可以较好地摄取PAMAM-叶酸NPs,同时流式细胞仪定量显示PAMAM-叶酸NPs在Hep G2细胞的分布较PAMAM NPs高40%(P0.05)。PAMAM NPs和PAMAM-FANPs在移植瘤中的分布明显多于其他脏器,并且随时间的延长PAMAM-FA NPs体现了更好的靶向效果。结论体外与体内实验证明FA修饰的PAMAM NPs对肝癌细胞Hep G2有很好的靶向效果,可为肝癌的靶向治疗提供较好的药物载体。     

三氧化二砷联合氨氯地平对肝癌HepG2细胞体外作用的实验研究

目的:探讨三氧化二砷与氨氯地平单独用药及联合用药对肝癌Hep G2细胞增殖和凋亡的作用。方法:用不同浓度的三氧化二砷(4.0、2.0、1.0μmol/L)和氨氯地平(27×103、18×103、12×103 mg/m L)处理体外培养的人肝癌Hep G-2细胞,观察细胞形态的变化,采用CCK-8法检测两种药物单独及联合应用对Hep G-2细胞生长增殖的影响,并通过流式细胞术观察其对细胞凋亡及细胞周期的影响。结果:三氧化二砷和氨氯地平均可以浓度依赖性方式显著增加Hep G2细胞的生长抑制率及其凋亡率,以联合用药的作用较单独用药更显著(P0.05)。与三氧化二砷和氨氯地平单独用药相比,联合用药可显著阻滞Hep G2细胞于G2期及S期。结论:三氧化二砷和氨氯地平均可显著抑制人肝癌Hep G2细胞的生长和增殖,并促进其凋亡,且二者联合应用时具有协同作用。     

rBTI通过上调PTEN的表达抑制Hep G2细胞增殖

磷酸酶及张力蛋白的同源基因(PTEN) 是一种抑癌基因,可以调控细胞的增殖,与癌症的发生和发展息息相关。本研究采用MTT法和流式细胞术分别检测了重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(rBTI)对人肝癌细胞株Hep G2细胞的增殖以及周期的影响。免疫荧光及Western印迹法检测了PTEN和p PTEN的亚细胞定位及蛋白表达的变化。采用qRT-PCR及Western印迹法检测了周期相关蛋白的表达。旨在探究PTEN和p PTEN在rBTI抑制Hep G2细胞增殖和周期阻滞中的作用。结果表明,rBTI能显著抑制Hep G2细胞增殖,将细胞周期阻滞在G0/G1期,并呈时间和剂量依赖性;rBTI作用于Hep G2后,可显著上调PTEN和p-PTEN的表达。同时发现,p-PTEN主要分布于细胞核中,能与核仁发生共定位;周期相关蛋白检测表明,细胞内p53、p21转录水平和蛋白水平均增加。综上所述,rBTI通过上调PTEN的表达,使得细胞周期阻滞于G0/G1期,进而抑制Hep G2细胞的增殖。     

单宁酸协同顺铂增强肝癌HepG2细胞内质网应激PERK-ATF4通路的激活水平

本文主要研究单宁酸(TA)联合顺铂(CDDP)对肝癌Hep G2细胞内质网应激PERK-ATF4通路的影响,以探究TA协同CDDP抗肝癌的分子机制。用180μM TA、0.9μg/m L CDDP单独用药或者联合用药处理肝癌Hep G2细胞24 h和48 h后,利用实时荧光定量PCR技术(q-RT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western Blot)技术检测细胞PERK、p-PERK、ATF4、CHOP、Procaspase3与Cleaved caspase3分子的表达水平。q-RT-PCR及Western Blot结果显示,TA与CDDP联合用药能显著上调细胞PERK、ATF4、CHOP的表达水平和Caspase3的剪切活化水平,下调PERK的磷酸化水平(P0.01或P0.05)。TA协同CDDP增强了肝癌Hep G2细胞内质网应激PERK-ATF4通路的激活水平,其可能是通过激活细胞ERS,促进PERK-ATF4通路相关分子和ERS标志性分子CHOP的表达,抑制PERK的磷酸化,从而促进Caspase3的剪切活化来诱导细胞凋亡的发生。     

短发夹RNA慢病毒载体稳定抑制NLRP3表达的HepG2细胞的构建

目的:构建针对NLRP3基因的短发夹RNA(sh RNA)慢病毒表达载体,在Hep G2细胞中鉴定该载体对NLRP3的抑制效果。方法:设计针对NLRP3基因的sh RNA序列,将其插入慢病毒表达载体p WPT-U6-sh RNA-CMV-GFP中,将载体与包装质粒ps PAX2、p MD2.G共转染293T细胞,进行病毒包装;得到的病毒原液浓缩后系列稀释为9个浓度递减的病毒液,分别转染293T细胞后进行滴度测定;用获得的慢病毒液感染人肝癌细胞系Hep G2,获得稳定沉默NLRP3的细胞株;利用实时定量PCR和Western印迹检测稳定细胞株中NLRP3的沉默效应。结果:构建了具有沉默效应的慢病毒干扰载体;稀释法测定干扰病毒滴度为2×108TU/m L;实时定量PCR和Western印迹实验均证实慢病毒转染后,细胞株中NLRP3表达水平明显降低。结论:构建了人NLRP3基因特异性慢病毒干扰载体,获得NLRP3基因稳定干扰的Hep G2细胞株。     

肝癌细胞SOX_7基因失活及其启动子区的甲基化状态的研究

目的:肝癌细胞SOX7基因失活及其启动子区的甲基化状态。方法:定量PCR检测肝癌细胞Hep G2和20例SOX7m RNA低表达肝癌患者癌组织SOX7甲基化水平。运用统计分析软件对数据进行分析。结果:定量PCR检测的甲基化结果显示,SOX7DNA启动子区在肝癌细胞Hep G2开始出现甲基化现象,但在SOX7m RNA表达下调的二十例肝癌组织中只有四例具备启动子区甲基化现象。结论:SOX7DNA启动子区于肝癌细胞Hep G2中出现甲基化现象,但在SOX7m RNA表达下调的肝癌组织中发现SOX7DNA启动子区甲基化状况并不具有显著性。     

溶血磷脂酸对不同转移性肝癌细胞迁移行为的影响

旨在研究溶血磷脂酸(Lysophosphatidic acid,LPA)对两种转移性不同的肝癌细胞MHCC97H和Hep G2迁移行为的影响。采用Transwell法检测肝癌细胞的迁移能力,RT-PCR检测肝癌细胞中LPA受体(LPA receptor,LPAR)m RNA水平的表达。结果显示,LPA对低转移性肝癌细胞Hep G2的迁移没有明显影响,但显著促进高转移性肝癌细胞MHCC97H的迁移能力。LPA对两种细胞的增殖都没有明显影响。RT-PCR实验发现两种肝癌细胞中LPAR的表达呈现差异,LPAR1在MHCC97H细胞中表达,但Hep G2细胞不表达。用LPAR1/3抑制剂Ki16425阻断MHCC97H中LPAR1的作用后发现,LPA对MHCC97H细胞的促迁移作用消失,表明LPA通过与LPAR1作用促进了MHCC97H细胞的迁移。LPA对不同转移性肝癌细胞迁移能力的影响存在差异,该差异可能来自于细胞表达LPAR的不同。     

CXCR4的抑制性多肽对乳腺癌细胞CXCR4和HER-2表达及HERCEPTIN药物敏感性的影响

目的 探讨CXCR4抑制性多肽对人乳腺癌细胞株SKBR3膜受体HER-2和CXCR4的蛋白表达及其对Herceptin药物敏感性的影响.方法 抑制性多肽、Herceptin单独或联合处理乳腺癌SKBR3细胞24、48h后,用MTT法观测SKBR3细胞的增殖抑制效应;Weatern blot和免疫纽化法检测SKBR3细胞中CXCR4和HER-2蛋白表达;RT-PCR检测HER-2、CXCR4 mRNA的表达,流式细胞仪检测细胞周期的变化.结果 多肽和Herceptin可不同程度地下调人乳腺癌细胞SKBR3中CXCR4和HER-2的蛋白表达.多肽对细胞生长抑制不明显,与Herceptin联合用药后,生长抑制率高于对照组和Herceptin单独用药组(P<0.001),48h生长抑制率为57.94%±5.3,且呈时问依赖(P<0.05),Herceptin单独作用SKBR3-细胞,细胞周期阻滞于G0/GI期,并且S期的比例减少,与多肽联合作用后,细胞周期又进一步阻滞于G2/M期,S期细胞进一步降低.结论 抑制性多肽能不同程度地下调膜受体HER-2和CXCR4的表达,提高人乳腺癌细胞株SKBR3对Herceptin药物的敏感性.     

紫檀芪对人肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响

为了探讨紫檀芪(PTE)对人肝癌细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制,肝癌细胞系Hep G2被选择作为研究对象,并对紫檀芪与其的作用进行了不同角度的研究。MTT法被用来检测不同浓度紫檀芪对Hep G2细胞活力的影响;倒置显微镜和流式细胞术检测紫檀芪处理后Hep G2细胞的凋亡情况;实时定量PCR和Western blot分别检测紫檀芪处理后Bax、Bcl-2、Fas、Cycs(细胞色素C)和Caspase3基因m RNA和蛋白表达情况。结果显示紫檀芪对Hep G2细胞增殖有很强的抑制作用,在最佳条件下,抑制率为(40.85±2.55)%。形态学观察发现紫檀芪作用后的细胞呈明显凋亡状态,凋亡率为(15.61±0.71)%,出现细胞周期阻滞现象。进一步的研究表明,经紫檀芪处理后,Hep G2细胞的线粒体膜电位明显下降(p0.01),Bcl-2的表达增强,Bax、Fas、Cycs和Caspase3的表达明显降低(p0.05)。这些实验事实暗示紫檀芪能够抑制Hep G2细胞增殖并促进其发生凋亡,其机制可能是通过上调Bax、Fas、Cycs和Caspase3基因,下调Bcl-2基因来实现的。     

甲壳胺对HepG2细胞蛋白酪氨酸激酶和磷酸酶活性的影响

目的:初步探讨甲壳胺诱导人肝癌Hep G2细胞凋亡的信号转导机制。方法:采用酶联免疫法,动态检测甲壳胺作用于Hep G2细胞后,细胞膜相及胞浆内的蛋白酪氨酸激酶(PTK)及蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)活性的变化。结果:甲壳胺可以抑制Hep G2细胞内的PTK活性,并呈一定的浓度依赖性;甲壳胺作用Hep G2细胞后,随着PTK活性的减弱,PTP的活性也短暂下降。结论:甲壳胺诱导Hep G2细胞凋亡时,涉及到PTK的活性改变。观察到膜相蛋白中PTK的活性改变早于胞浆蛋白,提示可能存在一个信号的跨膜转运过程;同时伴有PTP的活性变化,可能反映了胞内蛋白酪氨酸残基的磷酸化与去磷酸化即时调节机制。     

长链非编码RNA对HepG2 肝癌细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨长链非编码RNA RP13-514E23.1在肝癌细胞系中的表达,并观察上调该基因后其下游基因MAPK10的变化及对肝癌细胞Hep G2增殖、凋亡的影响。方法:通过荧光定量PCR(q RT-PCR)检测RP13-514E23.1在正常肝细胞与肝癌细胞系中的表达差异,进一步构建质粒转染肝癌Hep G2细胞上调RP13-514E23.1的表达,以Mock组(只加转染试剂)和NC组(转染空载体pc DNA3.1-NC)作为对照评估转染效率及对MAPK10表达的影响。用CCK-8实验和流式细胞术检测转染前后Hep G2细胞的增殖、凋亡的变化。结果:Lnc RNA RP13-514E23.1在大部分肝癌细胞系(Hep G2,SMMC,Huh7,Hep3B)中的表达明显低于正常肝细胞(0.58±0.05 vs 1.00,P0.05);转染pc DNA-RP13-514E23.1后,q RT-PCR检测Hep G2细胞的RP13-514E23.1和MAPK10m RNA表达量显著升高(分别为29.90±1.40、2.42±0.25,P0.05),western blot检测MAPK10蛋白表达量较对照组也升高(2.10±0.16,P0.05);CCK-8结果显示Hep G2细胞在各个时间段增殖均受到抑制(P0.01),Mock组、NC组和实验组的凋亡率分别为(5.53±1.17)%、(6.40±2.84)%和(46.87±3.45)%(P0.01)。结论:Lnc RNA RP13-514E23.1在肝癌细胞系中表达异常降低,上调其表达后MAPK10的表达升高,且Hep G2细胞增殖受到抑制、凋亡增加。     

慢病毒介导稳定表达MCM7、CDC6细胞株的建立

[目的]构建包装微小染色体维持蛋白7(Mcm7)、细胞分裂周期蛋白6(Cdc6)过表达慢病毒,并筛选Hep G2和LO2稳定过表达细胞株。[方法]通过PCR获得人的mcm7、cdc6基因,采用双酶切法构建重组慢病毒过表达载体。慢病毒过表达载体与ps PAX2、p MD2. G包装质粒共转染293T细胞后包装出慢病毒。慢病毒感染Hep G2和LO2后,通过有限稀释法筛选获得稳转细胞株,再经q PCR以及Western Blot鉴定过表达效果,FACS检测周期分布。[结果]成功构建并包装出了慢病毒,慢病毒滴度为1. 3×106TU/m L,感染Hep G2和LO2细胞后筛选获得稳转细胞株,并从mRNA和蛋白水平验证,Mcm7稳转株过表达效率超过0. 4倍,Cdc6稳转株过表达效率超12倍,稳转株周期分布与母代细胞没有显著差异(P 0. 05)。[结论]Mcm7、Cdc6稳转株构建成功,稳转株过表达效果明显,Mcm7、Cdc6的稳定过表达没有扰乱细胞周期进程。