L-谷氨酰胺高产菌的选育和发酵条件

以嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)LG-3为出发菌株,经紫外线(UV)和硫酸二乙酯(DES)诱变处理,磺胺胍(SG)、高浓度(NH4)2SO4定向筛选,获得1株谷氨酰胺高产菌株LG-65,在未经优化的条件下摇瓶发酵72 h可产谷氨酰胺43.5 g/L,比出发菌株的产量32.4 g/L提高了34.3%.在此基础上,对其发酵条件进行优化,经72 h摇瓶发酵产量可达47～48 g/L,7 L发酵罐补料分批发酵40 h可达55 g/L.     

一株高产洛伐他汀红曲霉的筛选与液态发酵条件优化

【背景】洛伐他汀(lovastatin)是红曲霉的次生代谢产物,是重要的临床用降血脂药物。在液态发酵条件下,红曲霉的洛伐他汀产量较低,难以满足工业化生产的要求。【目的】筛选获得一株高产洛伐他汀的红曲霉株,并通过优化液态发酵条件提高洛伐他汀的产量。【方法】从红曲米中筛选获得一株高产洛伐他汀的红曲霉株,依据形态学特征、生理生化特性及18S rRNA基因序列分析对分离菌株进行鉴定;通过响应面法对其产洛伐他汀的液态发酵条件进行优化。【结果】获得一株产洛伐他汀的紫红曲霉(Monascus purpureus M4),该菌在甘油57.80g/L、酵母浸粉5.52 g/L、接种量为6.90%条件下,洛伐他汀产量(173.60 mg/L)较优化前提高了4.8倍。【结论】菌株M4产洛伐他汀最优液态发酵条件的建立,为洛伐他汀的大规模生产及该菌株的工业化应用提供了技术支撑。     

一株高产Monacolin K紫红曲霉菌株筛选、鉴定及发酵条件优化

为从天然发酵红曲米中分离的30株红曲霉菌株中筛选高产MonacolinK的菌株,并对其产MonacolinK的发酵条件进行优化。实验采用高效液相色谱法(HPLC)筛选到9株具有产MonacolinK能力的红曲霉菌株,其中以编号ZX26的菌株产MonacolinK能力最高,发酵液中Monacolin K产量达到107.6mg/L,并且产MonacolinK能力具有良好的稳定性。微生物形态学结合ITS基因同源性分析结果表明,编号ZX26菌株为紫红曲霉。进一步采用单因素试验和正交试验法优化紫红曲霉ZX26产MonacolinK的发酵条件,结果表明在培养基组分为葡萄糖70g/L,牛肉膏15g/L,NaNO32g/L,MgSO4·7H2O0.5g/L,KH2PO41.5g/L时,其最优发酵条件为:发酵初始pH4.0,接种量为7%,培养温度30℃,发酵10天,在此条件下,紫红曲霉ZX26发酵液中MonacolinK产量达到271.36mg/L,相对于培养条件优化前MonacolinK产量提高152.19%,经验证此培养条件下MonacolinK产量最佳。     

戊糖乳杆菌发酵产乳酸及高产菌株诱变选育

戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)是能利用木质纤维素水解液发酵产乳酸的潜力菌株,发酵条件优化与高产菌株的选育是提高乳酸产量的重要手段。通过单因素试验、Plackett-Burman设计与响应面试验,对戊糖乳杆菌ATCC 8041产乳酸的发酵培养基及发酵条件进行了优化。结果表明,该菌株发酵培养基的最佳组合为葡萄糖93.11 g/L、酵母浸粉5.19 g/L、碳酸钙29.43 g/L、蛋白胨10.00 g/L、Na2HPO4·12H2O 5.00 g/L、Mg SO4 0.20 g/L、Mn SO4 50 mg/L;最佳发酵条件为37℃、p H6.5、接种量6%、装液量80%。在此优化条件下,该菌株发酵产乳酸为54.12 g/L。进一步以戊糖乳杆菌ATCC 8041为出发菌株,通过原生质体进行紫外诱变,经多重筛选,最终获得一株遗传稳定性好的高产乳酸突变株,命名为戊糖乳杆菌Lactic UVC-02,由中国典型培养物保藏中心保存,注册号为CCTCC M 2013209。该突变株Lactic UVC-02经葡萄糖发酵,乳酸产量达64.17 g/L,比出发菌株ATCC 8041(54.12g/L)提高18.6%。     

代谢甘油高产乳酸的菌种选育及培养基优化

分离出一株可高效利用甘油生产乳酸的菌株, 经过生理生化和16S rDNA分子鉴定, 确定其属于大肠埃希氏菌, 命名为Escherichia coli AC-521。通过五因素四水平正交试验, 优化了其最佳发酵培养基成分为初始甘油70 g/L, 酵母粉4 g/L, 蛋白胨7 g/L, (NH4)2SO4 10 g/L, K2HPO4 2.5 g/L。利用该最佳条件的5 L发酵罐批式补料发酵实验表明: 该菌株发酵80 h后, 乳酸产量可达到74.5 g/L, 得率为0.87 mol/mol甘油。     

高产DHA破囊壶菌Aurantiochytrium sp. PKU#SW7诱变株的筛选

【目的】对野生菌株Aurantiochytrium sp.PKU#SW7诱变育种,筛选高产DHA突变株。【方法】采用UV诱变和化学药物胁迫筛选方式,以菌株的生物量、油脂产量、DHA产量作为筛选指标,获得高产DHA突变株。【结果】经鉴定获得一株DHA高产突变株PKU#PM003,该菌株传代4次后仍保持较好的遗传稳定性。摇瓶发酵后,PKU#PM003生物量产量高达6.62 g/L,比原始菌株5.95 g/L提高了11.26%,脂肪酸含量高达4.01 g/L,比原始菌株3.18 g/L提高了26.1%,DHA在脂肪酸中所占比例由29.97%增加到33.43%,产量提高了41.01%,油脂突变效果显著。【结论】突变株PKU#PM003可作为性状优良的工业化发酵生产菌种,并在DHA产量提升上仍具有巨大的空间。     

利用豆制品废水发酵枯萎病拮抗菌Pb-4条件研究

利用豆制品生产过程中的废水(黄浆水)对枯萎病拮抗菌Pb-4菌株的发酵培养基及其发酵条件进行优化。通过单因素试验筛选Pb-4菌株黄浆水培养基中的碳源;设置因素水平为L_(18)(3~5)正交试验,对Pb-4菌株黄浆水培养基中最佳碳源和无机盐成分进行筛选和优化,确定发酵培养基配方;通过响应面优化试验对Pb-4菌株的发酵温度、p H和接种量进行优化。结果显示,通过筛选确定玉米粉为黄浆水培养基的最佳碳源;优化后的发酵培养基配方为:1 000 m L黄浆水中添加玉米粉30 g、(NH_4)_2SO_4 2g、Mg SO_4 1.5 g、CaCO_3 1.5 g和FeSO_4 0.3 g;优化后的发酵条件为:温度36.3℃、p H7.4、接种量5%、摇瓶培养40 h。在此优化条件下,发酵菌数可达42.8×10~8 CFU/m L、最大生物量OD_(660)值为0.393,与预测理论最大值0.390 2相吻合。优化后的发酵培养基能够替代蛋白胨、酵母粉和葡萄糖等常规培养基,具有简单、廉价和环保等特点,可作为微生物菌剂规模化生产的原料。     

根霉cw-1产纤溶酶的发酵条件优化

目的:确定根霉cw-1高产纤溶酶的液体发酵培养基组成及培养条件,使纤溶酶产量得到明显提高。方法和结果:采用响应面法对该菌种产纤溶酶的发酵条件进行优化。首先利用Plackett Burman试验设计筛选出影响产酶量的3个主要因素,即麸皮的浓度、豆粕的浓度和初始p H。在此基础上使用Design-Expert软件进行Box-Behnken试验设计,通过响应面分析得出菌株cw-1发酵产酶的最佳条件为:麸皮28.67g/L、豆粕46.28g/L、初始p H 5.8。经过试验验证,优化后粗酶液酶活达到243.22 U/m L(尿激酶单位),与响应面预测结果一致,较优化前酶活提高41倍。     

常压室温等离子体诱变选育L-精氨酸生产菌及发酵条件优化

【目的】通过常压室温等离子体诱变技术选育L-精氨酸高产菌株,利用响应面设计探索突变菌株生产L-精氨酸的最佳发酵条件。【方法】采用常压室温等离子体生物诱变系统对实验室保藏的Corynebacterium glutamicum GUI089进行系列诱变,选育L-高精氨酸和8-氮鸟嘌呤抗性菌株。在单因子实验的基础上,应用Plackett-Burman设计从7个因素中筛选出对L-精氨酸合成具有显著效应的(NH4)2SO4、葡萄糖和尿素3个因素。基于上述结果,进一步采用响应面设计优化出主要影响因素的最佳参数水平。【结果】经过一系列的诱变和筛选,选育出一株L-高精氨酸(15 g/L)和8-氮鸟嘌呤(0.7 g/L)抗性菌株,并将此菌株命名为C.glutamicum ARG 3-16。此菌株的L-精氨酸产量比出发菌株提高了49.79%,且发酵液中杂酸的浓度明显降低,特别是L-脯氨酸、L-谷氨酸和L-缬氨酸。在经响应面优化后的最佳发酵条件下,L-精氨酸的产量达到39.72±0.75 g/L,比优化前提高了10.49%。【结论】通过常压室温等离子体诱变技术成功选育出一株L-精氨酸高产菌株,利用响应面法有效地优化了发酵条件,实验结果表明突变株ARG 3-16具有潜在的生产应用价值。     

CpG基序重组菌发酵培养基的优化

目的:为提高CpG基序重组菌的发酵水平,降低CpG重组质粒的生产成本,运用响应面法优化CpG重组菌发酵培养基。方法:利用Plackett-Burman试验筛选出影响发酵水平的3个最显著因素:糖蜜、玉米浆和工业蛋白胨。然后用响应面设计试验并优化得到最显著因素的最佳浓度,并进一步通过发酵试验验证优化后的培养基。结果:得到一组具有较高菌浓及质粒产量且价格低廉的发酵用培养基:糖蜜4.5g/L,玉米浆8.5g/L,工业蛋白胨8.5g/L,甘油10mL/L,KH2PO41.5g/L,K2HPO42.3g/L,MgSO4.7H2O 0.25g/L,在此培养条件下,OD600实测值为0.6771,理论值为0.6643,两者接近,与标准LB培养基相比,质粒产量提高了15%左右。结论:最终筛选到的培养基具有较高的性价比。     

基于核糖体工程理论的常压室温等离子体诱变筛选多杀菌素高产菌

利用核糖体工程理论,采用常压室温等离子体(ARTP)诱变对刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)进行诱变筛选。以刺糖多孢菌QYLZ 88912菌株为出发菌株,对其进行ARTP诱变,选取三个不同致死率的照射时间,将孢子悬液混合,以增加抗性筛选几率。然后基于核糖体工程技术理论对混合孢子悬液进行初筛,最终筛选出了1株多杀菌素高产菌Sg200Rif110St40Er90-028。该菌株同时具有磺胺胍、利福平、链霉素、红霉素的多重抗性,摇瓶发酵试验表明,发酵7d后多杀菌素浓度可达到1 516.93 mg/L,较出发菌株QYLZ 88912的产量610.75 mg/L提高了148.37%,且遗传性稳定。以得到的高产菌Sg200Rif110St40Er90-028作为出发菌株,对发酵培养基进行响应面优化实验,优化后的培养基(g/L):葡萄糖46.97、麦芽糊精35、酵母粉40.36、水浸棉籽粉32.88、碳酸钙3,多杀菌素的产量为2 361.81 mg/L,比出发菌株的产量提高了286.71%。     

产漆酶菌株分离及发酵条件优化

[目的]筛选高产漆酶菌株。[方法]利用愈创木酚-PDA平板筛选高产漆酶菌株,单因素实验确定最佳产酶条件。[结果]筛选到一株高产漆酶菌株,编号QMJZ-5。结合形态观察和5.8S rDNA-ITS序列分析,确定该菌株是血红密孔菌(Pycnoporus coccineus),优化发酵培养基:甘油20 g/L,豆粕6.0 g/L,香兰素0.15 g/L,阿魏酸0.15 g/L,KH_2PO_41.0 g/L,Na_2HPO_4·12H_2O 0.2 g/L,CuSO_4·5H_2O 1.5 mmol/L,初始pH 5.0,30℃,发酵8 d,产酶55 U/m L。[结论]筛选到1株高产漆酶菌株。     

南极细菌Pseudoalteromonas sp.3-3-1-2产胞外多糖条件优化

利用单因子试验和响应面法对南极细菌Pseudoalteromonas sp.3-3-1-2产胞外多糖条件进行了优化。通过单因子试验确定菌株3-3-1-2产胞外多糖的最佳碳源和氮源分别为蔗糖和KNO3,其最佳添加量分别为40 g/L和10 g/L;最适培养温度为15.0℃;最佳培养基盐度和初始p H分别为4.5%和9;并确定了对产糖有显著影响的单因素——碳源(蔗糖)、氮源(KNO3)和温度。通过Box-Behnken进行试验设计和Design-Expert响应面软件分析,得到了菌株3-3-1-2产胞外多糖发酵条件的优化条件:蔗糖43.1 g/L、KNO39.6 g/L和温度17.2℃。在此优化条件下,菌株3-3-1-2发酵液的粗胞外多糖产量可达3.03 g/L。     

阿维菌素生产菌的常压室温等离子体诱变育种及培养基优化

【目的】通过诱变筛选技术选育阿维菌素高产突变株,对其发酵培养基进行响应面优化,提高阿维菌素产量。【方法】采用常压室温等离子体(ARTP)诱变技术,结合链霉抗性和卡那霉素抗性筛选法及96深孔板高通量筛选法,筛选阿维菌素高产株。在单因素实验的基础上,应用响应面分析法对其发酵培养基进行优化,最后确定最佳培养基配方。【结果】获得一株遗传性状稳定的阿维菌素高产株K-1A6,其阿维菌素产量达到4.22 g/L,比出发菌株9-39提高了23.4%,在最佳培养基中阿维菌素产量达到5.36 g/L,较优化前提高了27.01%。【结论】通过对阿维链霉菌9-39菌株进行ARTP诱变筛选及发酵培养基优化研究能显著提高阿维菌素的产量。     

酶法合成2-氧-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)条件的研究

采用单因素优化法对环糊精葡萄糖苷转移酶(CGTase)合成糖基抗坏血酸(AA-2G)条件进行优化,AA-2G的产量为2.76 g/L,比未优化前0.46g/L提高了500%。再采用响应面法对AA-2G合成条件进行优化。由Plackett-Burman法筛选出三个主要因素为:pH、V_C和麦芽糊精浓度;由最陡爬坡实验得出最佳响应面区域;最后由Box-Behnken实验,得到最优条件为:pH 5.51,V_C36.16g/L,麦芽糊精28.54 g/L,转化时间24 h,温度37℃。在此条件下,AA-2G的理论产量为3.15 g/L,通过验证实验,得出AA-2G的产量为3.13 g/L,与预测的理论值接近,比单因素优化的结果(2.76g/L)提高了14%。     

响应面法优化L-谷氨酰胺发酵培养基的研究

目的:采用响应面法对L-谷氨酰胺发酵培养基成分进行优化,以提高L-谷氨酰胺发酵产量。方法:首先利用Plackett-Burman试验设计筛选出影响L-谷氨酰胺产量的主要因素葡萄糖、玉米浆和(NH4)2SO4,在此基础上采用最陡爬坡实验逼近最大响应区域,并利用中心组合设计及响应面分析法进行回归分析。结果:通过求解回归方程得到L-谷氨酰胺发酵培养基最佳浓度为葡萄糖100 g/L、玉米浆4.5 ml/L、(NH4)2SO437.2 g/L,L-谷氨酰胺产量理论最大值达41.0 g/L。结论:经模型验证,预测值与验证试验平均值接近,在优化条件下谷氨酰胺产量提高了37.6%。     

玉米原料高产γ-聚谷氨酸优良菌株的选育及发酵条件优化

以实验室筛选到的一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）B-1为出发菌株,采用紫外诱变技术对出发菌株进行反复诱变,得到一株能够利用玉米原料生产γ-聚谷氨酸的优良高产菌株B-115,摇瓶发酵γ-聚谷氨酸的产量由原菌株的12.5g/L提高到19.5g/L。再以该菌株为研究对象利用响应面法进行碳源、氮源、谷氨酸钠、金属离子等发酵条件的优化实验,经48h摇瓶发酵,γ-聚谷氨酸产量达到40.98g/ L。     

产γ-聚谷氨酸菌株的诱变选育及其种子液工艺优化

以已筛选的1株产γ-多聚谷氨酸解淀粉芽胞杆菌C1为出发菌株,对其进行紫外线-亚硝基胍(NTG)复合诱变,并运用单因素试验和正交试验设计对诱变菌株的种子培养工艺进行优化。通过复合诱变选育得到1株能够稳定遗传的正突变菌株C1-6,其摇瓶发酵生产γ-PGA的产量由18.4 g/L提高到24.2 g/L,增加了31.5%,且传代8次后仍能保持稳定。通过单因子试验筛选到玉米粉和黄豆粉作为C1-6生长的C源和N源。正交试验后,C1-6在成分为K2HPO41.0 g/L、Mg SO40.5 g/L、黄豆粉15.0 g/L、玉米粉5.0 g/L,p H 6.5的培养基中,37℃、装液量1/5(150 m L三角瓶装液30 m L)的培养条件下可获得较大的生物量,OD600达到6.31。     

响应面法优化纤维堆囊菌SoF5-76产埃博霉素B发酵培养基

以纤维堆囊菌SOF5-76为试验菌株,用响应面分析法对其产埃博霉素B的培养基进行优化,以提高埃博霉素B的产量。在单因素试验的基础上,利用Plackett-Burman筛选出对埃博霉素B产量有显著影响的3个因素为马铃薯淀粉、脱脂奶粉和无水氯化钙,在此基础上通过最陡爬坡试验逼近最佳响应面区域;再运用Box-Behnken试验设计和响应面分析法进行回归分析,确定重要因素的最优浓度。得到最佳发酵培养基为:马铃薯淀粉3.9 g/L、脱脂奶粉2.2 g/L、无水氯化钙1.3 g/L、葡萄糖1 g/L,豆饼粉1.5g/L,七水硫酸镁2.5 g/L,EDTA-Fe3+3 mL/L,微量元素(TE)0.5 mL/L,VB121 mL/L。在此最优条件下发酵埃博霉素B的产量为29.95 mg/L,与模型预测值接近,发酵产量比优化前提高了1.1倍。     

猪源屎肠球菌WEI-9的高密度培养

目的对分离自健康仔猪肠道的屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9的高密度发酵培养基进行响应面优化,为菌株WEI-9的工业化生产奠定基础。方法首先采用单因素试验确定最适高密度发酵培养基的碳源和氮源,随后采用Plackett-Burman设计筛选出影响菌株WEI-9发酵活菌数的显著因素,利用最陡爬坡试验得出显著因素逼近最大活菌数产量的响应区域,最后应用Box-Behnken设计和响应面分析法确定显著影响因子的最佳浓度。结果优化后的最适高密度发酵培养基成分和配比为:乳清粉21.34 g/L,蛋白胨21.94 g/L,Na AC·3H2O 5 g/L,柠檬酸铵2 g/L,K2HPO4·3H2O 2 g/L,Mg SO4·7H2O 0.2 g/L,Mn SO4·H2O 0.05 g/L,吐温-80 1 g/L,发酵液最高活菌数达到1.6×109CFU/m L,是相同条件下MRS培养基中活菌数的1.98倍。结论本研究实现了猪源屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9的高密度培养。