6C6鼠-人嵌合抗体的纯化及鉴定

采用基因工程技术 ,将小鼠 6C6单克隆抗体可变区基因与人抗体恒定区基因连接 ,构建了鼠 人 6C6嵌合抗体基因 ,并在CHO细胞中高效表达 .利用ProteinA亲和层析柱从细胞培养上清中分离纯化 6C6嵌合抗体 ,得到电泳纯度大于 98%的 6C6嵌合抗体 ,其重链 (5 5kD)和轻链 (2 4kD)符合IgG相对分子质量的理论值 .Western印迹、细胞免疫荧光和免疫组织化学实验结果均呈阳性 .表明6C6嵌合抗体可识别人乳腺癌细胞表面上的肿瘤相关抗原 ,保持了 6C6单克隆抗体的特性 ,为后续的研究工作奠定了基础     

功能性抗HBsAg人—鼠嵌合抗体在昆虫细胞中的高效表达

经同源重组我们构建了同时含抗乙肝病毒表面抗原嵌合抗体重、轻链基因的双重组 ＢａｃＨＬ４．２。利用双重感染和双重组病毒感染秋粘虫Ｓｆ９细胞,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果说明嵌合抗体重、轻链同时在胞内得到了表达。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析表明两种情况均能在胞内组装成Ｈ２Ｌ２完整免疫球蛋白分子。ＥＬＩＳＡ和功能性免疫迷检测证明重组嵌合抗体与父本鼠源单抗ＯＨ３一样能特异性识别具有天然构象的ＨＢｓＡｇ,而不识别经     

抗埃博拉病毒核蛋白NP人-鼠嵌合抗体的研究

埃博拉病毒感染致死率最高可达90%,属烈性传染病,检测诊断对于疫情控制就显得异常重要。目前我国实验室通过实时定量荧光PCR检测埃博拉病毒核酸进行确诊,但耗时相对较长,对检测的人员和仪器要求较高。ELISA法检测血清是病原学诊断的主要指标,该种检测方法简单易操作,能够有效判断患者是否感染埃博拉以及感染程度,可用于流行病学调查,血清学指标的检测可以作为核酸检测的有力补充。由于埃博拉出血热在我国境内尚无病例出现,尤其需要储备血清学检测阳性质控物。通过基因工程抗体技术构建并表达抗埃博拉病毒核蛋白NP人-鼠嵌合抗体,为埃博拉出血热血清学检测做人源阳性对照储备。采用RT-PCR技术,从分泌抗埃博拉核蛋白单克隆抗体的鼠杂交瘤细胞株中分离克隆抗体轻重链可变区基因,对其进行序列分析。根据序列分析的结果,设计特异性引物将鼠源抗体可变区基因VH、VL分别克隆至携带有人抗体轻重链恒定区基因的真核表达载体HL51-14,瞬时转染293T细胞,表达并纯化获得人鼠嵌合IgG抗体,随后对其进行了免疫学检测和功能鉴定。结果表明正确构建抗埃博拉病毒核蛋白人鼠嵌合抗体真核表达载体,成功表达并纯化获得两株人鼠嵌合单抗。     

抗FGF2人鼠嵌合抗体在HEK293T细胞中的表达优化

目的：FGF2是肿瘤血管新生过程中最重要的因子之一,因此通过制备抗FGF2人鼠嵌合抗体中和其发挥作用,以达到抑制肿瘤生长的目的。方法：利用分泌抗FGF2抗体的杂交瘤细胞株IgG9B9和人B淋巴细胞,分别克隆抗体轻链可变区V_L、重链可变区V_H和人重链恒定区C_H基因,从pComb3λ载体中扩增出人λ 链恒定区C_L基因,通过重叠PCR,将V_L,V_H和C_L,C_H片段分别连接形成嵌合抗体的轻链L和重链H,将L/H链以单独构建或串联于同一载体的方式,构建抗FGF2嵌合抗体表达载体,并通过调控元件WPRE优化载体、共转染促生长因子aFGF以及调整表达温度等方式提高嵌合抗体在真核细胞中的表达。结果：成功构建了优化表达载体PLexm-WPRE、PLexm-aFGF;L、H链基因也成功构建,并以L、H或L-F2A-H（2A连接肽将L和H连接起来）的方式分别成功连接到PLexm,PLexm-WPRE载体中。转染细胞上清的ELISA鉴定结果表明,L/H链单独构建要比串联构建的方式具有更高的表达水平,WPRE能有效促进抗体的表达而aFGF并不能促进其表达,与31、37℃相比,33℃时抗体的表达量最高,同时嵌合抗体表现出了很好的结合活性及中和活性,竞争IC50=6.25μg/ml。通过亲和层析获得了高纯度的抗FGF2嵌合抗体。结论：在33℃下,人鼠嵌合抗体基因在WPRE存在下表达量最高,且与抗原FGF2有很好的结合活性及中和活性,为临床应用奠定了基础。     

嵌合型口蹄疫病毒样颗粒构建、表达及鉴定

为提高口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV)病毒样颗粒(Virus-likeparticles,VLPs)的特异性识别和递呈,为靶向疫苗研究奠定基础,利用反向PCR技术,将卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)第257–264位氨基酸(Amino acids,aa)的短肽嵌入FMDV结构蛋白VP3第171–172位aa或第173–174位aa,通过大肠杆菌表达FMDV结构蛋白VP0、VP1和嵌合型VP3,体外组装得到嵌合OVA257-264肽的病毒样颗粒(VLPOVA)。用动态光散射、透射电镜检测VLPOVA大小和形态,免疫印迹、酶联免疫吸附试验和激光共聚焦显微镜检测短肽的嵌入情况。结果显示在VP3的第173–174位aa嵌入OVA,不影响蛋白表达和VLPs的组装且OVA位于VLPOVA的表面,VLPOVA粒径比VLPs稍大。     

免疫球蛋白变区基因的体外扩增及人—鼠嵌合抗体的表达

应用聚合酶链反应法体外扩增抗人小细胞肺癌单克隆抗体的变区基因,经核苷酸序列分析,轻链变基因为３２４ｂｐ,编码１０８个氨基酸,重链变区基因为３１５ｂｐ,编码１１７个氨基酸,将重变区基因克隆至ｐＳＶ２△ＨｇｐｔＨｕγ３质粒,经一系列克隆,筛选,得一插入方面正确的表达人－鼠嵌合重链抗体的载体－ｐＳＶ２△Ｈｇｐｔ２Ｆ７ＶＨＨｕγ３。用电穿孔方法将该粒导入鼠源骨髓瘤细胞Ｊ５８８Ｌ,用霉酚酸进行初步筛选,最终     

免疫球蛋白变区基因的体外扩增及人－鼠嵌合抗体的表达

应用聚合酶链反应法体外扩增抗人小细胞肺癌单克隆抗体的变区基因,经核苷酸序列分析,轻链变区基因为３２４ｂｐ,编码１０８个氨基酸;重链变区基因为３５１ｂｐ,编码１１７个氨基酸。将重链变区基因克隆至ｐＳＶ_２△ＨｇｐｔＨｕγ_３质粒,经一系列克隆、筛选,得一插入方向正确的表达人－鼠嵌合重链抗体的载体－ｐＳＶ_２△Ｈｇｐｔ２Ｆ７ＶＨＨｕγ_３。用电穿孔方法将该质粒导入鼠源骨髓瘤细胞Ｊ５５８Ｌ,用霉酚酸进行初步筛选,最终用兔抗人免疫球蛋白ＩｇＧＦｃ片段的抗体筛选得七株阳性克隆,免疫印迹法结果表明在与人ＩｇＧ相同位置上有一阳性条带。     

人鼠嵌合抗体重链基因转染小鼠骨髓瘤细胞的初步研究

本文介绍了通过人鼠嵌合抗体重链基因转染小鼠骨髓瘤J558L的研究,叫详尽地阐述了用原生质体融合发将重组的人鼠嵌合抗体重链基因转染到J558L骨髓瘤细胞中,并用ELSA法检测转染子的过程和方法,同时简要地说明了影响转染率的一些因素。     

乙肝病毒表面抗原抗体可变区基因的克隆及人－鼠嵌合抗体重链基因的表达

本文采用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术,从鼠抗乙肝病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）单克隆细胞中克隆到了该抗体重、轻链可变区（Ⅴ区）基因,并分别将其与人的恒定区基因Ｃγ３,Ｃｋ相拼接,构建人－鼠嵌合抗体基因。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ分析结果证实嵌合抗体重链基因在Ｅ．ｃｏｌｉ中得到了表达。间接ＥＬＩＳＡ法免疫测定的结果表明该表达产物具有与乙肝表面抗原结合的能力。     

HSV-IgM人-鼠嵌合抗体制备及稳定细胞株构建工艺开发

为实现体外大规模制备单纯疱疹病毒HSV-IgM(HSV1,HSV2)人鼠嵌合抗体,本研究通过RNA连接酶介导的cDNA末端快速扩增(RNA ligase-mediated rapid amplification of cDNA ends,RLM-RACE)技术获取其对应杂交瘤细胞基因序列,构建嵌合抗体至真核表达载体,在CHO-S细胞中稳定表达所需目的蛋白。同时优化稳定细胞株筛选工艺,对细胞池构建阶段和单克隆筛选阶段的加压条件进行摸索与探究,最后目的抗体采用蛋白L亲和纯化法进行纯化并进行生物活性检测;最终成功制备899 kDa和909 kDa的稳定高表达重组IgM抗体(HSV1,HSV2)细胞株。结果表明,最适筛选压力为20P200M(一轮加压)和50P1000M(二轮加压);使用加压培养基进行单克隆筛选抗体表达量较高,HSV1-IgM和HSV2-IgM单克隆最终表达量分别为1620 mg/L和623 mg/L。本研究为HSV1和HSV2的IgM系列重组抗体质控品开发以及体外高表达分泌IgM亚型抗体提供理论与实践基础。     

抗HEV嵌合抗体的构建及在CHO细胞中的表达

通过RT-PCR方法从分泌戊型肝炎(戊肝)病毒中和性鼠源单克隆抗体(单抗)8C11的杂交瘤细胞中克隆出抗体基因的重链可变区(VH)、轻链可变区(VK)序列,并分别克隆到含有人gamma 1重链和kappa轻链恒定区序列的pcDNA3.1/Hygro和pcDNA3.1( )质粒中,共转染中华仓鼠卵巢癌细胞(CHO)细胞.RT-PCR结果表明,转染的CHO细胞转录了嵌合重链及轻链基因,间接ELISA及Western blot结果表明:翻译出的两种多肽在细胞内正确组装成嵌合抗体分子,并可分泌至细胞外,表达的嵌合抗体保留了原鼠单抗的抗原结合特异性及对8H3结合抗原的增强作用.8C11嵌合抗体的成功表达可降低鼠源性,为探讨戊肝抗体治疗的可能性奠定了基础.     

含F／2A序列的抗P185^erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体的构建

目的构建含F／2A序列的抗P185^erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体,观察其在293T细胞中的表达。方法用具有自我剪切能力的弗林蛋白酶（Furin）／口蹄疫病毒2A多肽（F/2A）连接人鼠嵌合抗体的重链和轻链,形成一个开放阅读框（ORF）,插入慢病毒表达载体pWPI,构建重组抗P185神睨全长人鼠嵌合抗体表达载体pWPI／H-F2A—L。以已构建的慢病毒表达载体pWPI／H-IRES-L为对照质粒。应用磷酸钙沉淀法将慢病毒载体3质粒系统共转染入293T细胞进行包装,测定病毒滴度。再感染293T细胞,荧光显微镜下观察GFP的表达和转染效率,RT—PER、ELISA方法分别检测嵌合抗体mRNA和蛋白的表达。结果经测序鉴定,pWPI／H—F2A—L与预期设计一致;pWPI／H—F2A—L组的病毒滴度为4．3×10^5TU／ml,而pWPI／H—IRES—L组的病毒滴度为3．5×10^5TU／ml;两组重组慢病毒的转染效率分别为87．68％和79．08％;两组重组慢病毒感染293T细胞后,都有嵌合重链和嵌合轻链的表达,由F／2A介导的嵌合抗体的表达水平要高于由IRES介导的嵌合抗体。结论成功构建了含F／2A序列的抗P185^erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体,为今后抗P185^erbB2工程抗体的研究奠定了基础。     

猴/人嵌合免疫缺陷病毒应用的研究进展

猴/人类免疫缺陷病毒(SHIV)自20世纪80年代末开始构建,并被广泛应用于人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)疫苗的攻毒实验和抗HIV中和抗体的活性评价.随着研究的深入,SHIV构建涉及的HIV-1病毒亚型也越来越多,如HIV-1 B、HIV-1 C、HIV-1 E等;同时,对SHIV致病性、细胞嗜性和应用的研究也有长足的进步,促进了HIV疫苗研究,并为HIV致病性研究提供了宝贵经验.     

不同信号肽对人鼠嵌合CMV-IgM分泌表达的影响

为了实现在体外制备巨细胞病毒-免疫球蛋白M(CMV-IgM)和探讨不同信号肽对CMV-IgM表达的影响,通过RLM-RACE技术钓取杂交瘤细胞基因序列,构建人鼠嵌合CMV-IgM表达载体,并通过PCR方法将5种不同的分泌型信号肽(SigA–SigE)代替CMV-IgM自身信号肽(SigF),利用中国仓鼠卵巢细胞(CHO)作为宿主细胞进行体外表达。对纯化后的CMV-IgM进行SDS-PAGE、SEC-HPLC和酶联免疫吸附试验(ELISA)确定其蛋白表达水平与免疫反应性,最终成功制备出910 kDa的重组蛋白,且研究表明,5种信号肽(SigA–SigE)的人鼠嵌合CMV-IgM表达量较CMV 6#细胞株自身信号肽SigF相比,分别提高了6.72、5.19、1.44、1.85、1.98倍。这将对人鼠嵌合CMV-IgM的开发提供理论基础,且为提高CMV-IgM表达量的研究工作提供了新思路。     

人-鼠嵌合Fab片段的温度诱导表达

构建了具有λPRPL启动子高效表达人鼠嵌合Fab片段的温度诱导表达型载体pHZ01。并在大肠杆菌中表达了三种嵌合Fab片段：抗前列腺特异抗原(PSA)的嵌合Fab．抗溶菌酶(HEL)的嵌合Fab和抗破伤风类毒素(TT)的嵌合Fab．三种表达的可溶 性嵌合Fab都具有特异结合抗原的能力,嵌合Fab的CHI和CK区均为人源的。较之鼠源 Fab具有更好的应用前景。     

人-鼠嵌合Fab片段的温度诱导表达

构建了具有λＰＲＰＬ启动子高效表达人鼠嵌合Ｆａｂ片段的温度诱导表达型载体ｐＨＺ０１,并在大肠杆功中表达了三种嵌合Ｆａｂ片段：抗前列腺特异抗原（ＰＳＡ）的嵌合Ｆａｂ,抗溶菌酶（ＨＥＬ）的嵌合Ｆａｂ和抗破伤风类毒素（ＴＴ）的嵌合Ｆａｂ,三种表达的可溶性嵌合Ｆａｂ都具有特异结合抗原的能力,嵌合Ｆａｂ的ＣＨ１和ＣＫ区均为人源的,较之鼠源Ｆａｂ具有更好的应用前景。     

嵌合抗体轻链基因在家蚕细胞中的重组与表达

用家蚕修饰型核多角体病毒为载体,在家蚕细胞获得人鼠嵌合的抗人小细胞肺癌抗体轻链基因的表达。ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证明了抗体轻链基因已组建家蚕病毒基因组中。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ和ＥＬＩＳＡ和分析都检测到在重组病毒感染的家蚕细胞中产生了人鼠嵌合的抗体轻链。     

抗人活化血小板单抗SZ—51嵌合抗体的构建及表达

ＳＺ－５１是一种抗人活化血小板单克隆抗体,并显示了很好的导向血栓显像与导向溶栓了减少该单抗的免疫原性以及能获得高效表达的ＤＺ－５１“人源化”单抗,我们构建了真核表达载体α－Ｌｙｓ１７－５１ＶＫ／Ｈｕ,α－Ｌｙｓ３０－５１ＶＨ／Ｈｕ。应用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ分别将重,轻链表达载体导入骨髓瘤细胞ＳＰ２／０中,并在相应的选择性培养基中进行耐药克隆筛选,经过体外长期培养和二次单克隆化,获得了一株高效表达重