沙眼衣原体CT058蛋白在感染细胞中的定位分析

分析沙眼衣原体CT058蛋白在感染细胞中的定位.克隆表达CT058蛋白;纯化的CT058融合蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体;间接免疫荧光法对CT058蛋白在沙眼衣原体感染细胞中的定位进行分析;Western blot检测CT058蛋白在原体和网状体中的表达情况.间接免疫荧光染色实验显示CT058蛋白位于包涵体内;鼠抗GST-CT058抗体与GST-CT058融合蛋白吸附后特异性染色消失,而与GST-CT232融合蛋白吸附后仍然可见GST-CT058抗体的包涵体染色特征;Western blot证实CT058蛋白在纯化的原体和网状体上均有表达.CT058蛋白定位于沙眼衣原体感染细胞的包涵体内.     

假定蛋白CT440在沙眼衣原体感染细胞中的定位研究

包涵体膜蛋白在沙眼衣原体致病过程中发挥重要的作用.为确定假定蛋白CT440在沙眼衣原体感染细胞中的定位及特征,本研究采用PCR方法从D型沙眼衣原体的基因组中扩增Ct440基因,克隆入pGEX-6p原核表达载体构建pGEX-6p/Ct440原核表达重组体,重组体转化到XL1-blue大肠杆菌,IPTG诱导表达融合蛋白GST-CT440.纯化后的CT440融合蛋白免疫小鼠制备抗体,间接免疫荧光(IFA)和Western blot测定抗体的特异性.特异性抗体用于分析CT440蛋白在衣原体感染细胞内的定位、表达时相特征及其对衣原体感染的影响.结果表明,CT440蛋白定位于沙眼衣原体包涵体膜上,为沙眼衣原体包涵体膜蛋白;该蛋白在衣原体感染12h后开始表达,直至持续到整个感染周期;转基因在胞浆表达的CT440融合蛋白不影响其后的衣原体感染.本实验为深入研究衣原体与宿主细胞间的相互作用,阐明衣原体致病机制提供了重要的实验依据.     

沙眼衣原体CT-249基因编码蛋白为一包涵体膜蛋白

使用融合蛋白GST-CT249的抗体对假想蛋白CT249的特性进行研究。使用PCR方法从L2型沙眼衣原体的基因组中扩增编码CT249蛋白的开放读码区基因,限制性内切酶BamHⅠ和NotⅠ消化、T4连接酶连接导入pGEX-6p2载体,进一步把重组质粒pGEX-6p2-CT249转化到XL1-blue细菌,并诱导表达融合蛋白GST-CT249。在融合蛋白GST-CT249免疫小鼠制备抗体后,应用直接免疫荧光技术对衣原体感染细胞内的CT249基因表达的内源性蛋白进行初步定位。成功克隆出沙眼衣原体基因CT249,全长为351bp,并表达了融合蛋白GST-CT249,分子量为38.2kDa。制备了融合蛋白GST-CT249的抗体并初步定位假想蛋白CT249于沙眼衣原体包涵体膜蛋白上。总之,使用融合蛋白GST-CT249的抗体,鉴定假想蛋白CT249为一种新的沙眼衣原体包涵体膜蛋白。该发现将为进一步深入研究衣原体与宿主细胞间某些机制提供了有用的途径。     

CT358蛋白在沙眼衣原体感染细胞中的定位及特性分析

确定沙眼衣原体CT358蛋白在衣原体感染细胞中的位置并初步鉴定其生物学功能．采用PCR方法从D型沙眼衣原体的基因组中扩增CT358基因,并克隆入pGEX和pDSRedC1表达载体中．将重组质粒pGEX-CT358转化到XL1-blue宿主菌,并诱导表达融合蛋白GST-CT358．纯化后的CT358融合蛋白免疫小鼠制备抗体,应用间接免疫荧光技术对CT358蛋白在衣原体感染细胞内的定位及表达模式进行分析．同时,pDSRedC1-CT358重组质粒瞬时转染HeLa细胞,观察CT358蛋白对衣原体感染的影响．实验结果证明CT358蛋白为沙眼衣原体包涵体膜蛋白．该蛋白质在衣原体感染12 h后就表达定位于包涵体膜上,直至持续到整个感染周期,转基因在胞浆表达的CT358融合蛋白不影响其后的衣原体感染．该研究为深入研究衣原体与宿主细胞间相互作用提供了新的线索,并可为衣原体性的治疗、预防提供新方向．     

沙眼衣原体CT135蛋白的表达与抗体制备

目的:在原核表达系统中表达沙眼衣原体CT135蛋白,并制备抗体,建立CT135蛋白免疫检测方法。方法:将沙眼衣原体CT135基因(1083 bp)克隆入带有His标签的pET-32a(+)载体中,通过NdeⅠ/XhoⅠ双酶切构建CT135全长的重组质粒WT,CT135基因N端逐渐缩短的重组质粒MT1、MT2、MT3,以及CT135基因C端逐渐缩短的重组质粒MT4、MT5、MT6,在大肠杆菌BL21(DE3)中重组表达;用Ni2+-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白,然后腹腔注射5周龄BALB/c雌鼠制备抗血清。结果:Western印迹使用高灵敏的二抗通过红外扫描系统检测到所有质粒可表达重组蛋白,但考马斯亮蓝染色结果显示只有MT6可高表达重组蛋白。制备纯化了MT6重组蛋白,通过腹腔注射免疫法制备了小鼠抗MT6血清。结论:大肠杆菌表达系统中,沙眼衣原体CT135蛋白的N端片段(1～374 bp)可以获得高表达。小鼠抗MT6血清的制备为后期检测沙眼衣原体CT135蛋白的表达奠定了基础。     

IFA筛选经EMS诱导的沙眼衣原体突变株

目的:用甲基磺酸乙酯(Ethylmethylsulfone,EMS)诱导D型沙眼衣原体突变,利用间接免疫荧光法筛选出突变菌株,为研究不同衣原体基因的功能提供实验依据。方法:将D型沙眼衣原体标准株接种Mc Coy细胞,加入EMS诱导突变,收集存活菌株,利用空斑实验进行衣原体的分离和纯化,并用不同衣原体蛋白单克隆抗体做间接免疫荧光实验筛选突变株。结果:用间接免疫荧光筛选经EMS作用的沙眼衣原体,筛选出三株包涵体形态偏小的菌株(56#、58#、95#),一株圆形包涵体的突变株(61#)和一株D413N表达阴性的突变菌株(83#)。结论:用EMS作为诱导剂诱导D型沙眼衣原体突变,并成功筛选出三种突变株。为寻找衣原体功能基因与衣原体表型之间的联系奠定了实验基础。     

沙眼衣原体包涵体膜蛋白的研究进展

沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)是一种专性细胞内寄生的革兰阴性病原体,在宿主细胞内增殖形成包涵体,通过包涵体与宿主细胞发生相互作用。包涵体膜蛋白(inclusion membrane proteins,Inc蛋白)是一类定位于衣原体包涵体膜上的含独特双叶片状疏水性基序结构的衣原体蛋白。Inc蛋白广泛存在于衣原体属各个种内,每种衣原体既有各自独特的Inc蛋白,又有其关键Inc蛋白同系物,基于生物信息学方法,预测Ct有59个Inc蛋白。Inc蛋白在衣原体与宿主细胞相互作用过程中发挥重要作用。在过去的十年内,鉴定Inc蛋白并对其功能进行研究受到了重视,但对于Inc蛋白的功能仍知之甚少。衣原体基因操控技术的应用,推动了Inc蛋白等衣原体单个蛋白的功能研究。现就Ct Inc蛋白的鉴定及其功能研究进展作一概述。     

冰片提取物对沙眼衣原体感染HeLa细胞CT703及CT259表达的影响

目的:探究冰片提取物对沙眼衣原体感染后的He La细胞模型CT703和CT259表达的影响。方法:将成功建立的40例感染L2血清型沙眼衣原体的人宫颈癌上皮(He La)细胞模型随机分成A、B两组,分别添加冰片提取物和等剂量生理盐水。观察感染后He La细胞模型的包涵体数目及大小、RNA抽提结果完整性以及CT70与CT259的表达变化。结果:染色后的40例受沙眼衣原体感染的He La细胞模型体内均发现包涵体,在同一时间点B组细胞内包涵体比A组大,且数目比A组多(P0.05);两组提取的总RNA的OD值均在1.8~2.0之间,通过RNA凝胶电泳结果可清楚发现28S、18S及5S条带;同一时间点CT259和CT703扩增产物的平均灰度值比较,A组感染后He La细胞模型样本基因表达量低于B组,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:冰片提取物能够有效降低经沙眼衣原体感染的He La细胞模型中CT703与CT259基因表达量。     

衣原体的检查法

<正>衣原体的分类和主要疾病 现在衣原体是按包涵体的形态,对磺胺类药物的敏感性以及DNA杂交成功率等分为沙眼群和鹦鹉热群。人的疾患,可以大致区分为自然宿主本来就是人的沙眼衣原体引起的各种疾病,和鸟类是其自然宿主偶尔人罹患的鹦鹉热衣原体,除人以外其他哺乳类,鸟类也有分布,并且可以引起各     

沙眼衣原体基因CT703在HeLa细胞中的表达

本文旨在探讨沙眼衣原体( Chlamydia trachomatis, Ct) L2 血清型感染HeLa细胞后, 在急性感染和持续感染状态下基因CT703 mRNA 表达水平的变化。透射电子显微镜下确定Ct 急性感染和持续感染模型的建立; 吉姆萨染色显示, 细胞内包涵体体积增大且出现异常增大的网状体, 反转录-聚合酶链反应( RT-PCR) 检测显示, 持续感染状态下Ct 基因CT703 mRNA表达水平显著低于急性感染状态, 推测这可能是Ct 在细胞内持续感染的形成机制之一。     

鹦鹉热衣原体B细胞表位的表达及抗原鉴定

利用噬菌体PⅢ蛋白为载体对鹦鹉热衣原体单抗17筛选得到的B细胞抗原表位进行了研究,利用改构后的原核表达载体pQE30,构建含有B细胞表位基因的重组表达质粒,表达的蛋白经ELISA及Western Blot实验证实能够与单抗C17发生特异反应,蛋白免疫动物后得到了抗鹦鹉热衣原体的抗体,验证了所筛选表位的真实性。     

沙眼衣原体包涵体膜蛋白CT225与宿主波形蛋白存在相互作用

【背景】衣原体独特的发育周期是在包涵体内完成的,大约7%–10%的基因编码包涵体膜蛋白,由此可见包涵体膜蛋白可能在其发育和致病过程中发挥重要作用。然而,其具体功能仍有待深入研究。【目的】筛选包涵体膜蛋白CT225的互作分子,以期进一步了解其可能的生物学功能。【方法】首先表达融合蛋白GST-CT225,用亲和层析法从HeLa细胞裂解液中筛选CT225的互作分子,所得蛋白进行质谱分析。确定候选蛋白,然后通过免疫共沉淀方法(Co-Immunoprecipitation,CO-IP)、谷胱甘肽巯基转移酶(Glutathione S-Transferase,GST)下拉/沉降实验和亚细胞定位等方法进行验证。【结果】参考质谱分析得分,通过实验初步验证得出波形蛋白(Vimentin,VIM)为与CT225相互作用的蛋白。【结论】CT225与HeLa细胞的波形蛋白Vimentin互相作用,提示其功能可能与维持细胞骨架完整性、膜运输和脂质转运等有关。     

衣原体蛋白的亚细胞定位

沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,CT)是一种严格细胞内寄生、有独特发育周期的原核细胞型微生物.CT在宿主细胞浆内增殖,形成光镜可见的典型细胞内包涵体,包涵体为CT在宿主细胞内的生长繁殖提供屏障保护,同时也是CT与宿主细胞进行物质交换和信息传递的门户,CT不仅可从宿主细胞摄取营养物质,还可分泌效应蛋白进入宿主细胞质调节宿主细胞功能.CT基因组DNA序列和功能注释完成后,衣原体蛋白的亚细胞定位、结构和功能的研究已成为衣原体研究领域的热点之一[1-3].在CT与宿主细胞相互作用过程中,Inc蛋白、分泌蛋白等衣原体蛋白可能发挥着重要作用,鉴于蛋白质的亚细胞定位情况往往与其功能密切相关,衣原体蛋白在感染细胞中的定位认识成为其功能研究中的重要环节.     

青海藏区B型沙眼衣原体的分离培养与鉴定

【目的】对青海藏区沙眼患者标本进行沙眼衣原体分离培养与鉴定。【方法】分别采集患者的单眼结膜和结膜囊拭子标本至1 mL样本保护培养基中。取50μL样本采用离心法感染BGM细胞,37°C培养72 h,连续传代3次,相差显微镜观察衣原体包涵体。对临床样本和分离株分别进行主要外膜蛋白基因ompA序列分析。【结果】共采集了45例活动性沙眼患者的115份临床样本,其中54份样本为ompA PCR阳性,15份样本为沙眼衣原体培养阳性。ompA分析发现,青海藏区沙眼衣原体有3个不同的同源ompA变异株,均为基因B型,都包含有一个泌尿生殖道型沙眼衣原体特有密码子。分离株QH111L和QH111R分别来自编号111患者的左眼和右眼样本,它们ompA基因的可变区有一个非同义碱基差异。该碱基变异仅存在于111号患者的左眼样本中,说明QH111L可能是新出现的ompA突变体。【结论】青海藏区的眼型沙眼衣原体流行株为基因B型,至少存在3个不同的ompA变异株。从青海藏区分离培养了15株眼型沙眼衣原体,发现同一患者的左右眼样本中的沙眼衣原体有不同ompA。本研究为研制沙眼疫苗和诊断试剂奠定了基础,也将有助于理解沙眼的进化和传播。     

沙眼衣原体真核表达质粒pcDNA4/CT703的构建及其表达

目的：构建含沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis, Ct）基因CT703的真核重组表达质粒pcDNA4/CT703,并检测其在HeLa细胞中的表达.方法：利用RT-PCR扩增CT703基因,然后将其亚克隆到真核表达载体pcDNA4,PCR、双酶切和测序检测重组质粒.将正确的重组质粒瞬时转染HeLa细胞,免疫荧光和Western Blot实验检测重组质粒目的蛋白表达. 结果：经PCR、双酶切和测序鉴定后,成功构建了真核重组表达质粒pcDNA4/CT703,将其转染HeLa细胞后,免疫荧光和Western Blot实验能检测到目的蛋白的表达.结论：成功构建了重组质粒pcDNA4/CT703,并能在HeLa细胞中表达,为进一步研究CT703的功能奠定了基础.     

肺炎链球菌TCSs中WalR的克隆表达、保守性及抗原表位分析

通过构建PET28a-WalR表达载体并在大肠杆菌BL21中表达WalR重组蛋白,以评价其对C57小鼠的免疫原性;并分析其在不同血清型肺炎链球菌中的保守性和B细胞的抗原表位。以肺炎链球菌D39血清型WalR基因为模板,构建重组质粒PET28a-WalR并转入BL21诱导表达目的蛋白质。采用Clustal X 2.1软件对WalR蛋白在不同血清型S.pn中的保守性进行分析;利用DNASTAR软件对其B细胞抗原表位进行分析。结果显示,成功构建PET28a-Wal R重组表达载体,经IPTG诱导后有大量高纯度的目的蛋白质,但其主要以包涵体形式存在;Wal R蛋白在不同血清型肺炎链球菌中高达99.4%,其B细胞抗原表位可能位于9-16、35-42、95-111、113-135、150-161、200-218等氨基酸序列位点。成功获得大量以包涵体形式表达的肺炎链球菌Wal R重组蛋白,并对其保守性和抗原表位进行了系统分析。     

结核分枝杆菌膜蛋白的异源表达与纯化研究进展

膜蛋白是一类与生物膜相互作用、具有重要功能和独特结构的蛋白质。异源表达纯化一直是了解膜蛋白结构和功能的重要瓶颈。结核分枝杆菌作为典型的胞内致病菌,其膜蛋白的研究具有很好的代表性以及重要意义。目前用于表达膜蛋白的有大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞等表达系统,但结核菌膜蛋白的表达宿主还往往局限于大肠杆菌。异源表达需要综合考虑蛋白的来源、疏水性、跨膜区等特性。低温、加入共表达因子以及改变培养条件有助于结核菌膜蛋白的可溶性表达。另外,包涵体复性也是获得结核菌目的膜蛋白的重要途径。随着新的表达系统,新的促可溶表达策略,新的包涵体复性手段,新的纯化方法的应用,将有更多的膜蛋白异源表达纯化成功,为蛋白质功能研究奠定基础。     

沙眼衣原体多形态膜蛋白D基因序列分析及其B细胞抗原表位预测

分析沙眼衣原体多形态膜蛋白D(PmpD)的基因序列并预测PmpD蛋白的B细胞抗原表位。在GenBank中检索沙眼衣原体不同血清型的PmpD基因序列,进行序列比对分析。以L2血清型PmpD基因序列为材料,采用Karplus-Schulz、Chou-Fasman和Gamier-Robson方案预测蛋白质的二级结构和柔性区;按Jamesonv-Wolf方案预测抗原指数,运用Kyte-Doolittle方案预测PmpD氨基酸的亲水性,利用Emini方案预测蛋白质的表面可及性。检索到20个沙眼衣原体不同菌株的PmpD基因序列,分析发现其核苷酸序列非常保守,一致性高达99.14%~100%;对预测结果综合分析,推测最有可能的B细胞表位位于PmpD N端的67~74、132~140、335~340、851~861、972~988及1091~1097。多参数方案综合预测PmpD蛋白的B细胞抗原表位,为进一步实验鉴定PmpD抗原表位及其多表位疫苗设计和研究奠定基础。     

重组人载脂蛋白AI米兰变体在大肠杆菌中的高效表达*

通过大肠杆菌表达系统来生产重组人载脂蛋白AI_M(proapolipoprote in AI_M,proapoAI_M)。整个proapo AI_M基因被分成两个片断,通过RT-PCR的方法合成。在对该基因的上游部分进行改造后,插入到表达载体pBV220中进行表达。蛋白的表达量达到45%左右,蛋白的表达形式为包涵体。包涵体通过疏水柱进行柱上复性,复性后的蛋白具有良好的生物活性。     

重组人载脂蛋白AI米兰变体在大肠杆菌中的高效表达

通过大肠杆菌表达系统来生产重组人载脂蛋白AIM(proapolipoprote in AIM,proapoAIM)。整个proapo AIM基因被分成两个片断,通过RT-PCR的方法合成。在对该基因的上游部分进行改造后,插入到表达载体pBV220中进行表达。蛋白的表达量达到45%左右,蛋白的表达形式为包涵体。包涵体通过疏水柱进行柱上复性,复性后的蛋白具有良好的生物活性。