草莓ζ-胡萝卜素脱氢酶基因ZDS的克隆及特征分析

用RT-PCR和RACE技术从草莓(Fragaria ananassa Duchesne)果实中克隆到ζ-胡萝卜素脱氢酶基因ZDS,命名为FaZDS,其cDNA全长2148 bp,具有1个1710 bp的完整开放阅读框(ORF),编码569个氨基酸。序列分析表明,FaZDS编码的氨基酸序列与其它植物的ZDS蛋白有很高的相似性。系统进化树分析表明,草莓与苹果的ZDS蛋白亲缘关系较近。原核表达结果表明FaZDS基因在大肠杆菌中能高效表达。用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析表明,FaZDS基因在草莓的花、叶片和果实中均有表达,表达量为花红果粉红果白果青果叶。     

油菜蔗糖转化酶基因的电子克隆和生物信息学分析

运用电子克隆技术获得油菜中一个蔗糖转化酶基因eDNA序列,同时根据此段序列设计引物以油菜eDNA为模板进行扩增。经测序得到证实。采用生物信息学方法,对该基因编码蛋白从氨基酸组成、基本理化性质、跨膜结构域、信号肽导肽、疏水性／亲水性、二级结构、亚细胞定位等方面进行了预测和分析。结果表明：该基因eDNA序列长度为2150bp,包含一个1779bp开放阅读框,编码592个氨基酸;该编码蛋白含有蔗糖转化酶的多个典型的保守结构域。同源比对分析显示,该基因编码的氨基酸序列与拟南芥等植物的蔗糖转化酶基因具有高度的相似性,进一步确定该蛋白为蔗糖蛋白酶。研究结果为该基因进一步的实验克隆,表达分析,功能鉴定奠定基础。     

手掌参内质网膜转运通道蛋白基因GcSec61β的克隆与表达

从高原耐寒珍稀植物手掌参(Gymnadenia conopsea)中克隆了一个编码107个氨基酸、长为621bp的全长cDNA序列。序列分析表明,它与真核生物内质网(ER)转运蛋白通道亚基Sec61β基因具有高度的相似性,命名为GcSec61β。进化分析的结果表明GcSec61β与拟南芥和水稻等Sec61β基因的遗传关系最近。经半定量RT-PCR检测得知,GcSec61β基因在手掌参幼芽和叶中均有表达,其表达量受低温诱导。GcSec61β基因的原核表达具有明显增加细菌耐低温特性。     

草莓ξ-胡萝卜素脱氢酶基因ZDS的克隆及特征分析

用RT-PCR和RACE技术从草莓(Fragaria ananassa Duchesne)果实中克隆到ξ-胡萝卜素脱氧酶基因ZDS,命名为FaZDS,其cDNA全长2148 bp,具有1个1710 bp的完整开放阅读框(ORF),编码569个氨基酸.序列分析表明,FaZDS编码的氨基酸序列与其它植物的ZDS蛋白有很高的相似性.系统进化树分析表明,草莓与苹果的ZDS蛋白亲缘关系较近.原核表达结果表明FaZDS基因在大肠杆菌中能高效表达.用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析表明,FaZDS基因在草每的花、叶片和果实中均有表达,表达量为花＞红果＞粉红果＞白果＞青果＞叶.     

桃PpNAC72的克隆及表达分析

旨在从桃树‘津柳早红’中克隆PpNAC72,并分析其在不同发育时期的表达情况,初步探究该基因在桃生长中的功能。采用RT-PCR技术从桃果实中克隆得到PpNAC72序列,并对其进行定量表达分析以及生物信息学分析。结果显示,桃PpNAC72(GenBank:MH627940)开放阅读框序列为1 050 bp,编码349个氨基酸,其等电点为8.34,有1个NAM结构域,具有典型的NAC家族结构特征。氨基酸同源性分析表明,PpNAC72与已报道的其他植物NAC蛋白具有较高的相似性,其中,与甜樱桃的NAC蛋白同源性最高。荧光定量PCR结果表明,PpNAC72在桃树各器官中均有不同程度的表达,果实中表达量最高;在不同时期的表达量也有明显变化,在桃果实生长中后期表达量最高。PpNAC72作为转录因子可能参与桃的成熟。     

酵母SUC2基因上游顺序对其表达的影响

从SUC2基因上游约—900bp向起始密码进行系列缺失。将带有这种缺失上游区的SUC2基因插入多拷贝质粒,并转化进不产蔗糖酶的酵母细胞。测定了这些缺失株表达蔗糖酶的数量。结果表明:在葡萄糖阻遏条件下,SUC2上游区缺失从-636bp到-179bp的不同细胞,糖基化蔗糖酶的表达量逐渐升高。和野生型相比,SUC2上游区缺失到-223bp和-179bp的细胞糖基化蔗糖酶量增加100倍以上。在葡萄糖去阻遏条件下,SUC2上游缺失从-395bp到-179bp的不同细胞,糖基化蔗糖酶的表达量只显示微弱的去阻遏效应。缺失末端达-89bp和-41bp的细胞只表达很少的糖基化蔗糖酶,但是非糖基化蔗糖酶的表达量明显增加。     

枸杞果糖激酶基因LbFRK7的克隆及表达分析

该研究以‘宁杞1号’枸杞果实为材料,基于转录组测序TR28373|c0_g1序列,利用RT-PCR技术,克隆出枸杞果糖激酶基因LbFRK7的全长序列为1 060bp,其中,ORF开放阅读框为1 044bp,编码有348个氨基酸,蛋白质分子量为37.44kD,理论等电点5.05;LbFRK7编码的氨基酸序列包含有pfkB碳水化合物激酶家族高度保守的3个特异性区域,2个底物识别位点,4个ATP结合位点;LbFRK7与烟草和辣椒的FRP7基因序列相似性较高,达到90%;利用实时荧光定量技术分析发现,不同组织中LbFRK7基因均有表达,且果实中的表达量最高,根中最低;随着果实的发育,果实中LbFRK7基因的表达量呈先升后降的变化趋势,并于开花后15d达到最高。在果实发育前期,LbFRK7基因的表达量与果糖含量的变化趋势相同,但在果实发育中期和后期,LbFRK7基因的表达量与果糖含量的变化趋势相反。相关分析结果显示,LbFRK7表达量与果糖和蔗糖含量的相关系数分别为-0.326和-0.339,但均未达到显著水平。研究表明,LbFRK7基因在枸杞果实发育过程中对果糖转化起到一定作用,特别是在果实成熟过程中对果糖含量的升高具有重要的作用。该研究结果为进一步探讨枸杞LbFRK7的功能及果糖代谢奠定了基础。     

油菜矮秆突变WRKY转录因子cDNA克隆及表达分析

以甘蓝型油菜为材料,利用已建立的抑制性消减文库(SSH),采用RACE技术克隆到1个植物WRKY转录因子相关基因,命名为BnD11,其cDNA全长1034 bp,含有810 bp的完整开放阅读框,编码269个氨基酸。该基因编码的氨基酸序列与拟南芥WRKY40氨基酸序列相似性为79%,与拟南芥中编码WRKY-DNA结合蛋白40基因的氨基酸序列相似性达78%,与其它多种植物的WRKY转录因子的氨基酸序列也有较高的相似性。半定量RT-PCR对BnD11进行组织特异性表达分析显示:在正常生长条件下,BnD11在野生型和矮秆油菜的各个组织中均有表达,但在矮秆突变的根、茎、茎尖的相对表达量明显高于野生型。研究表明,BnD11功能区段具有很高的保守性,可能参与了油菜的茎秆发育。     

阜豆GmABC基因的克隆及表达分析

利用RACE技术从大豆品种‘阜豆11号’中克隆到1个ABC转运蛋白基因,该基因cDNA全长为4 693bp,其中开放读码框4 341bp,编码1 447个氨基酸,分子量162.5kD,具有高度保守的ATP结合位点,命名为GmABC。蛋白序列比对结果显示,该基因编码蛋白属于PDR(pleiotropic drug resistance)多向耐药性蛋白家族成员。系统进化树分析显示,GmABC与苜蓿PDR亲缘关系最近,相似性达84%。基因表达分析显示,GmABC受镉诱导表达,当Cd2+浓度达到100mg.L-1时,其表达量最高。研究表明,GmABC可能对阜豆镉胁迫抗性发挥重要作用。     

一个新的忽地笑O-甲基转移酶基因的克隆与原核表达

采用RACE技术克隆得到一个新的忽地笑O-甲基转移酶（OMT）基因,命名为LaOMT。LaOMT的cDNA序列为1379 bp,开放阅读框1077 bp,预测编码蛋白包含358个氨基酸。序列比对分析发现, LaOMT编码的蛋白序列具有依赖于S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）的高度保守的结构域,与葡萄、大豆等其他植物OMTs蛋白的相似性为50%左右。将LaOMT基因连接到原核表达载体pET28a上,转化大肠杆菌Rosetta （DE3）的SDS-PAGE电泳结果显示,重组蛋白受异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,分子量大小约为45 kDa,与已报导的其他植物的OMTs蛋白大小基本一致。此外,半定量RT-PCR分析结果表明, LaOMT在忽地笑的叶、鳞茎、根和花中均有表达,其中花中的表达量最低。     

冬枣过氧化氢酶基因的克隆及表达分析

从冬枣半红期和全红期果实的SSH文库中筛选得到与桃树CAT1基因相似性高达88%的基因片段。根据该基因片段设计特异性引物,通过5′和3′-RACE扩增,拼接得到1 586bp序列,该序列包含了1 479bp的完整开放阅读框,编码492个氨基酸,具有CAT基因家族的保守功能域,命名为ZjCAT,GenBank登录号为JN831452。氨基酸序列分析表明,ZjCAT与桃树、陆地棉等多种植物的过氧化氢酶有很高的相似性,并属于类型Ⅲ过氧化氢酶。实时PCR分析结果显示,ZjCAT基因在冬枣不同组织和果实成熟期差异性表达,其中在冬枣半红期果实中表达量最高。表明ZjCAT基因在冬枣果实成熟衰老过程中可能具有重要的调控作用。     

巴西橡胶树赤霉素信号转导途径HbRGA1结构和功能分析

DELLA蛋白是赤霉素激素信号负调控因子,具有抑制植物生长发育的作用。解析其家族成员结构与功能将有助于揭示橡胶树DELLA蛋白家族成员调控橡胶树生长发育的机制。本研究从橡胶树热研73397叶片中克隆HbRGA1的cDNA全长序列。该基因长为2136 bp,含1839 bp的ORF,编码613个氨基酸。HbRGA1蛋白序列包含DELLA和GRAS保守结构域,与杨树、木薯和橡胶树DELLA基因相似性高达82.5%。qRT-PCR分析发现HbRGA1在橡胶树叶片中表达量高,在树皮和胶乳中表达量极低。叶片中HbRGA1表达量受喷施赤霉素和脱落酸等诱导显著上调。本研究表明HbRGA1与橡胶树赤霉素等激素信号密切相关,为深入研究其在橡胶树生长发育中的结构和功能打下良好基础。     

甜瓜乙烯受体基因Cm-ETR1 cDNA的克隆及表达特性分析

乙烯感知和信号转导的初始成分是乙烯受体,为探明甜瓜乙烯受体基因Cm-ETR1在甜瓜果实成熟过程中的作用,以甜瓜品种河套蜜瓜为材料,根据GenBank中登录的甜瓜乙烯受体基因Cm-ETR1的cDNA序列(登录号为AF054806),设计合成特异性引物,采用RT-PCR技术克隆得到Cm-ETR1基因全长cDNA序列,提交到GenBank中(登录号为EF495185)。序列分析表明,序列长度为2 256 bp,编码区为2 223 bp,编码740个氨基酸,与已报道的cantalupenis甜瓜ETR1基因的cDNA序列完全一致。Cm-ETR1蛋白的系统进化树分析结果表明,该乙烯受体蛋白在各物种间高度保守,与黄瓜乙烯受体蛋白相似性最高,一致性为99%,与龙眼乙烯受体蛋白相似性最低,一致性为86%。定量PCR分析结果显示,随着甜瓜果实内源乙烯合成量和成熟程度的增加,Cm-ETR1基因的表达量同步增加,在果实乙烯跃变期,Cm-ETR1的表达量也达到最高值,内源乙烯合成量与Cm-ETR1基因表达量间呈显著正相关,表明Cm-ETR1基因在甜瓜果实成熟过程中可能具有重要的作用。     

苋菜IRT1基因克隆、序列及表达分析

通过对镉超积累苋菜品种天星米铁转运蛋白基因( IRT1)的克隆、序列及表达分析,旨在为植物修复镉污染土壤奠定基础.依据同源克隆原理,通过RACE技术克隆苋菜IRT1基因及生物信息学方法分析基因序列结构和功能,Northern杂交研究基因表达.苋菜IRT1基因cDNA全长1135 bp,包含完整的阅读框,编码322个氨基酸.苋菜IRT1蛋白与已知铁转运蛋白相似性在53.70％-63.04％,具有铁转运蛋白典型的功能结构特征,即N端含有1个信号肽、氨基酸序列上具有完整的ZIP家族功能结构域( Pfam:Zip)和7个跨膜结构域(TMs).苋菜IRT1蛋白还具有1个COG0428超级家族(转运二价金属离子功能)、2个蛋白激酶C磷酸化位点和2个酪蛋白Ⅱ磷酸化位点.低铁胁迫时苋菜根中IRT1基因表达量增加,加镉处理没有改变IRT1基因表达量.因此,推断苋菜IRT1基因是ZIP家族的一员,具有转运二价金属离子功能,将基因在GenBank中注册,序列号为:GU363501,命名为AmIRT1.     

葡萄VvSUN基因的克隆及其控制果形功能初探

SUN基因是控制番茄果实形状的主效基因。该研究从NCBI中查找与番茄SUN相似性最高的葡萄序列,设计特异性引物,采用RT-PCR技术从‘天山’葡萄花穗中克隆出该序列,命名为VvSUN基因。序列分析表明,VvSUN基因开放阅读框长度为1 278bp,共编码425个氨基酸;预测蛋白质分子量为48.11kD,理论等电点为10.63。VvSUN蛋白不具有信号肽,为非跨膜蛋白,可能定位于细胞核和线粒体膜上,属于亲水性蛋白;二级结构分析表明α螺旋和无规则卷曲是VvSUN蛋白中主要的结构元件。VvSUN基因编码的氨基酸具有IQ保守结构域,与NCBI中其他7种植物IQD家族成员基因序列相似性在43%~53%;系统进化树分析表明,VvSUN基因与拟南芥IQD12基因亲缘关系最近;推测葡萄VvSUN蛋白质与番茄SUN蛋白质具有相似的功能。荧光定量PCR分析表明,VvSUN基因在两个葡萄品种中均在盛花期表达量最高,花后果实中的表达量均较低;GA3处理后果实果形指数显著增大,且幼果中VvSUN基因表达量明显上升。研究推测葡萄VvSUN基因可能参与果形拉长的调控。     

无芒隐子草CsPEAMT基因克隆及表达特性分析

以无芒隐子草(Cleistogenes songorica)干旱胁迫下的cDNA文库中磷酸乙醇胺N-甲基转移酶(phosphoethanolamine N-methyltransferase,PEAMT)基因的EST序列为基础,采用RACE方法克隆该基因编码区序列,该序列全长为2 104bp,开放读码框1 506bp,编码501个氨基酸。无芒隐子草PEAMT蛋白编码的氨基酸序列与多种植物的PEAMT氨基酸序列有较高相似性,其中与高粱SbPEAMT、玉米ZmPEAMT的蛋白序列相似性最高(93%),说明PEAMT基因在植物进化中非常保守。采用实时定量RT-PCR分析无芒隐子草幼苗在干旱过程中CsPEAMT基因的表达结果显示,干旱胁迫诱导CsPEAMT基因在根和叶中大量表达,且在干旱第8天时CsPEAMT基因在叶和根中表达量分别是未干旱对照的43.35倍和13.25倍,复水后CsPEAMT基因的表达量开始下调。研究表明CsPEAMT基因可能是无芒隐子草抗旱性相关的基因。     

苹果生长素输入载体MdAUX1的基因克隆及在拟南芥和烟草中的遗传转化

生长素的极性运输对调节植物生长发育起重要作用。生长素转运蛋白调控生长素的极性运输。本研究从‘嘎啦’(Malus×domestic‘Royal Gala’)苹果中克隆了生长素输入载体基因Md AUX1(基因序列号:MDP0000384437)。序列分析表明,该基因包含长为1 443 bp完整的开放阅读框,编码含有480个氨基酸的蛋白。氨基酸序列比对和系统进化树分析表明,AUX1在不同物种间具有高度的序列保守性,其中,苹果Md AUX1与欧洲甜樱桃Pa AUX1亲缘关系最近。半定量PCR分析显示,Md AUX1在苹果的茎中表达量较高。通过农杆菌介导的遗传转化获得转Md AUX1基因的拟南芥和烟草。转基因拟南芥根系表型观察结果显示,Md AUX1基因在拟南芥中异位表达后,会抑制主根伸长,促进侧根形成;在外源NAA处理下,转基因拟南芥对主根伸长的抑制作用得到部分恢复。在烟草中过量表达Md AUX1基因能够显著促进植株地上部分生长。以上结果说明苹果Md AUX1基因在调节植物生长发育中发挥重要作用。     

簸箕柳AP3同源基因SsMADS的克隆与特性分析

用cDNA末端快速扩增(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)方法从簸箕柳雄花序中克隆了一个AP3同源基因的cDNA,长826 bp,包括完整的编码区、5′-UTR和3′-UTR,并将其相应的基因命名为SsMADS。该基因由7个外显子和6个内含子组成,编码区长723 bp,编码241个氨基酸,其N-端具有典型的MADS保守结构域。序列分析表明,SsMADS编码的氨基酸序列与毛果杨(Populus trichocarp)AP3同源蛋白有95.7%相似性,与其他几种柳属植物的AP3同源蛋白相似性达96.1%～99.6%。实时定量RT-PCR表明,SsMADS在叶、茎和根中表达量极低,在花序中表达量较高,并且其表达量在花器官的早中期发育阶段逐步提高,说明该基因在簸箕柳花器官的发育中起作用。     

柑橘果糖激酶基因的克隆及表达

植物果糖激酶(FRK)在果糖磷酸化中起重要作用。通过PCR技术从温州蜜柑(Citrus　unshiu　Marc.)基因组中扩增得到编码果糖激酶基因的2个基因组DNA片段,分别命名为Cufrk1、Cufrk2,利用RT-PCR从果实中分离到了与Cufrk1外显子序列一致的cDNA序列,并通过RACE技术分离到这个基因的全长cDNA序列,命名为CuFRK1(GenBank号:　AY561840)。Cufrk1与Cufrk2编码氨基酸序列相似性为68%。CuFRK1　cDNA全长为1　459　bp,5'端和3'端的非翻译区分别为167　bp和239　bp,该序列含有一个完整的开放读码框,编码350个氨基酸,蛋白质分子量约为37.5　kD,等电点为5.03,含有2个果糖激酶糖特异结合域及3个ATP结合域,其氨基酸序列与其他植物中已分离的果糖激酶基因相似性在62%￣78%。Northern分析显示,CuFRK1(Cufrk1)与Cufrk2在柑橘幼叶、发育初期果实中表达量较高,在果皮和茎中不表达,在花瓣及成熟果实中表达模式有一定差异。酶活性分析表明,果实中的果糖激酶活性随果实的发育而降低,同时,果实中的果糖不断积累,在果实整个发育过程中果糖含量与果糖激酶活性呈极显著负相关。     

雪里蕻非特异脂质转运蛋白基因的克隆与分析

非特异脂质转运蛋白是植物生命活动中一类重要的活性蛋白,这类蛋白在植物的抗性和防御中行使着重要的功能。近年来研究发现这类蛋白还与植物的有性生殖密切相关。通过已得到的普通白菜的脂质转运蛋白基因BcMF15的核苷酸序列,在其基因全长两侧设计引物,从雪里蕻中克隆得到该类活性蛋白基因,命名为BjLTP (登陆号: EU082009)。该基因全长650bp,不含内含子。不同组织的表达特征分析发现,BjLTP在雪里蕻的花蕾、开放的花中特异表达,推测BjLTP可能与花粉的发育有关。蛋白质特征预测及蛋白序列结构分析发现BjLTP是一个跨膜蛋白,具有显著的疏水区。序列同源比对表明该基因与白花芥蓝、拟南芥等的脂质转运蛋白基因有很高的相似性,证明BjLTP是LTP家族的成员之一。