应用种特异性PCR技术快速鉴定辣椒实蝇

【目的】辣椒实蝇 Bactrocera latifrons (Hendel)为我国重要的检疫性有害生物,其寄主范围广泛,危害严重。由于传统鉴定方法受到饲养周期、饲养条件、虫态等因素的限制,使得果蔬进出口贸易通关速度、疫情快速鉴定受到较大的影响,因此迫切需要开发关于实蝇的快速鉴定识别的技术。【方法】本研究基于mtDNA COI序列设计了一对能够准确鉴定辣椒实蝇的种特异性引物FL680和RL1057,选用辣椒实蝇作为阳性对照,选用番石榴实蝇B. correcta (Bezzi)、桔小实蝇 B. dorsalis (Hendel)和颜带实蝇 B. cilifer (Hendel)等20种实蝇作为阴性对照,进行PCR扩增并将PCR产物进行电泳检测。【结果】仅目标种辣椒实蝇能够扩增出清晰且单一的约378 bp的条带,其余实蝇种类均未出现条带。将本实验建立的种特异性PCR（SS-PCR）鉴定方法应用于实际检疫工作中并得到了验证,表明该方法具有强的种特异性。【结论】本文提出辣椒实蝇快速鉴定识别技术可应用于实蝇的疫情监测和口岸的检疫检测工作。     

橘小实蝇快速检疫鉴定方法

采用形态学观察与PCR技术相结合的方法,针对台湾水果中截获的可疑橘小实蝇Bactroceradorsalis(Hendel)幼虫和蛹进行快速鉴定。采用异硫氰酸胍方法快速提取昆虫基因组DNA,并根据特异性引物,采用PCR技术从截获的可疑橘小实蝇幼虫和蛹样本中均扩增得到224 bp的特异性条带,经测序比较发现,扩增产物序列与橘小实蝇目的基因序列完全相同,由此证明可疑样本为橘小实蝇的幼虫和蛹。该方法解决了橘小实蝇幼虫和蛹等未成熟虫态的快速检疫难题,大大缩短了检测周期,值得口岸检验检疫借鉴应用。     

二种大实蝇的PCR-RFLP快速鉴定方法

应用PCR-RFLP技术,对我国部分地区发生分布的蜜柑大实蝇和橘大实蝇开展了分子生物学鉴定方法研究。结果表明,利用4组引物对目标实蝇的COⅡ和ITS1基因进行PCR扩增,并借助MnlⅠ,MseⅠ,AseⅠ,DraⅠ和SspⅠ等5种限制性内切酶对扩增产物进行酶切,能从多个途径把2种大实蝇区分开。所建立的方法不受目标实蝇食物源、地理来源和标本保存条件的影响,对不同虫态和不同性别的个体均适用,可在生产和检疫实践中对蜜柑大实蝇和橘大实蝇进行快速鉴定。     

CO1在侧耳属物种快速鉴定中的应用

以侧耳属Pleurotus15个种的15个菌株为材料,根据GenBank上侧耳属细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ基因（cytochrome c oxidase subunit 1 gene,CO1）序列信息,设计引物CO332F、CO332R,进行第一轮PCR扩增,结果显示所有菌株都能得到单一条带,根据条带大小,15个菌株可分为4组。随后针对每个种设计特异性引物,进行第二轮PCR扩增,结果显示每个菌株只有在自己特异的引物中出现目的条带。通过两轮扩增,根据扩增条带的大小和有无,即可对15个种进行快速鉴定。     

地中海实蝇及其近缘种基因芯片检测研究

本研究选择线粒体DNA (mtDNA) 细胞色素氧化酶Ⅰ基因（COⅠ）为分子标记基因,以双翅目实蝇科昆虫DNA序列为目标,建立了我国进境植物检疫害虫地中海实蝇Ceratitis capitata、芒果小条实蝇C. cosyra和纳塔尔小条实蝇C. rosa等生物芯片检测方法。地中海实蝇及其近缘种检测芯片由检测探针（实蝇科通用探针1条,小条实蝇属通用探针1条,地中海实蝇、芒果小条实蝇和纳塔尔小条实蝇近缘种探针2条和种特异探针4条）、质控探针（定位点探针、阳性质控、阴性质控和空白对照探针各1条）组成。芯片检测结果表明,检测探针特异性强,能实现上述3种实蝇的种类快速区分和准确鉴定; 检测方法稳定性好,地中海实蝇不同虫态（卵、幼虫、蛹和成虫）和不同地理种群检测结果完全一致。地中海实蝇生物芯片检测技术将为我国进口果蔬中检疫性实蝇快速筛查和种类鉴定提供检测方法,同时,还可应用到其他属的实蝇以及相关害虫的检疫中,为有害生物的快速鉴定提供了新方法。     

基于基因组特异性SSR序列的实蝇PCR鉴定方法

【目的】实蝇科昆虫是全球范围内重要的检疫性害虫,其幼虫取食寄主果实,引起果实腐烂、变质,造成巨大经济损失。由于口岸截获多为实蝇卵、幼虫、蛹等非成虫虫态,需饲养至成虫才能根据形态准确鉴定,因此快速可靠的分子鉴定技术体系亟需完善。【方法】利用公开发表的实蝇基因组序列,通过生物信息学方法从4种检疫性实蝇即地中海实蝇Ceratitis capitata、瓜实蝇Bactrocera cucurbitae、橘小实蝇Bactrocera dorsalis、昆士兰实蝇Bactrocera tryoni中挖掘物种特异性的简单重复序列(Simple sequence repeats,SSR),针对各物种设计含有其特异性简单重复序列的引物,提取实蝇样品基因组DNA,采用常规PCR方法优化并筛选各物种特异性引物。【结果】在4种实蝇基因组中共发现20条物种特异性的SSR,基于这些序列设计的3对特异性引物能有效区分地中海实蝇、瓜实蝇和橘小实蝇,扩增片段大小分别为1 251、1 307、823 bp,而在其他物种中检测不到条带。【结论】基因组水平的序列分析发现了物种特异性的SSR,通过筛选获得物种特异性的PCR引物,可应用于3种实蝇的分子鉴定,为口岸检疫人员快速鉴定区分非成虫状态的实蝇提供了实用性技术。     

热带小奥德蘑的序列特异性扩增标记开发

[目的]为了快速、准确地对热带小奥德蘑JZB2115055进行鉴定和保护,该研究开发了该菌的序列特异性扩增(SCAR)标记。[方法]采用26个ISSR引物对19个小奥德蘑属菌株进行PCR扩增,以引物P826扩增时,JZB2115055在700 bp～1 000 bp之间出现了一条特异条带,获得此条带的DNA序列并设计特异性引物对P826-1-2XF/R。[结果]以19个小奥德蘑DNA为模板,P826-1-2XF/R为引物在JZB2115055中能够特异性地扩增出2条条带,长度分别为431 bp、537 bp;该引物在2～19号菌株中扩增不出目的条带或者扩增条带在2 000～5 000 bp之间。[结论]开发了热带小奥德蘑JZB2115055的SCAR标记,能够在该菌中特异性地扩增出431 bp和537 bp大小的条带,而其他18株菌株不能扩增出特异条带,此标记能够快速、准确地进行该菌的鉴定和保护。     

利用28S rDNA种特异引物鉴定新菠萝灰粉蚧

【目的】新菠萝灰粉蚧Dysmicoccus neobrevipes Beardsley是近年来口岸中经常截获的检疫性有害生物,其与近似种形态差异小,极易随进境果蔬及种苗传播蔓延,但却难以快速准确鉴定。【方法】以新菠萝灰粉蚧为靶标,进境水果中常截获的其他6种粉蚧为对照,利用扩增粉蚧的28SrDNA通用引物扩增7种粉蚧基因部分序列,同时应用Primer Premier 5软件设计新菠萝灰粉蚧28S rDNA种特异引物1对(D.neo-28SF/R)。【结果】获得了新菠萝灰粉蚧及其他6种粉蚧的28SrDNA基因部分序列;种特异引物(D.neo-28SF/R)能稳定扩增出片段大小为235 bp条带,且该引物只对新菠萝灰粉蚧具有扩增能力,对其他6种粉蚧不具有扩增效果;对不同寄主来源新菠萝灰粉蚧亦具有同样的扩增效能。【结论】利用基于28S rDNA种特异性PCR方法,建立了新菠萝灰粉蚁快速分子检测技术。该技术方法完全可用于新菠萝灰粉蚧的准确识别,对有效阻截其进一步扩张蔓延具有重要实践意义。     

美洲斑潜蝇SS PCR检测技术研究

【背景】美洲斑潜蝇是一种严重威胁瓜果蔬菜、烟草、棉花等经济作物和花卉生产的入侵性害虫。由于潜叶蝇类害虫体型较小、生活方式隐蔽、形态相似,本文针对其难以快速准确地进行形态鉴别的问题,以美洲斑潜蝇为研究对象,以菜田常见的4种潜叶蝇类害虫为参照,采用种特异性PCR方法（species specific PCR, SS PCR）,研究其快速分子检测鉴定技术。【方法】调用GenBank中一段936 bp的美洲斑潜蝇线粒体DNA（mtDNA）细胞色素氧化酶亚基Ⅰ基因（CO[KG-*2]Ⅰ）的序列（GenBank登录号为EU219613）,并根据此基因片段的碱基序列设计引物1对,其扩增片段大小为294 bp。【结果】种特异性检验结果显示,该引物只对美洲斑潜蝇的CO[KG-*2]Ⅰ基因具有扩增能力,对其他种类如南美斑潜蝇、三叶斑潜蝇、葱斑潜蝇、豌豆潜叶蝇等没有扩增能力。该引物不仅对成虫具有良好的扩增效果,对蛹、幼虫以及单粒卵也具有同样的扩增效果,其最低检出阈值为1/3840头成虫。【结论与意义】SS PCR技术体系可用于美洲斑潜蝇的鉴定识别与检测监测,对阻止其进一步扩散蔓延具有重要意义。     

利用PCR技术鉴定河豚鱼的探索

目的:利用聚合酶链反应(PCR)技术,建立鱼类制品中河豚鱼成分的分子生物学鉴定方法,弥补河豚鱼形态学鉴定的缺陷。方法:通过阅读文献,确定河豚鱼鉴定的靶基因并筛选特异性引物,提取河豚鱼DNA,优化PCR反应条件,扩增河豚鱼特异性DNA片段,并通过DNA电泳显示特异性扩增的DNA条带。结果:选择细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)作为河豚鱼成分鉴定的靶基因,PCR最佳反应条件是退火温度68℃,镁离子浓度2.0 mmol/L,DNA模板加入量0.07～0.1μg。河豚鱼特异性引物具有较好的特异性,与市场上常见的鲤鱼、草鱼等水产品无交叉反应。结论:所建立的PCR方法可以有效鉴定鱼类制品中河豚鱼成分。     

酒酒球菌的快速特异性PCR鉴定

以Oenococcus oeni苹果酸-乳酸酶基因(mleA)为目标基因,设计了1对特异性引物PmleaL/PmleaR进行酒酒球菌的快速鉴定研究。结果表明,直接以O.oeni的菌落为模板,通过引物对PmleaL/PmleaR的PCR扩增,可得到mleA基因的特异性条带;用此特异性引物进行供试乳酸菌的PCR鉴定,所有O.oeni菌系均得到特异性条带,而供试的其它种类乳酸菌未扩增出目标带。PmleaL/PmleaR可用于O.oeni的快速PCR鉴定。     

瓜果上主要实蝇类害虫PCR-RFLP分子鉴定技术的建立及应用

[目的]建立一种针对实蝇幼虫快速鉴定的技术方法,并应用该技术以明确我国瓜果上主要实蝇类害虫的优势种.[方法]以我国瓜果蔬菜上危害最为严重的瓜实蝇Bactrocera cucurbitae(Coquillett)、南亚果实蝇Bactrocera tau Walker和橘小实蝇Bactrocera dorsalis(Hendel)为对象,基于3种实蝇种间存在线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ因子(mtCOⅠ)基因的序列差异,利用3种限制性内切酶SapⅠ、BsmⅠ和Sac Ⅰ酶切识别这些差异序列的特异性酶切位点,根据酶切后mtCOⅠ基因片段大小不同,对3种实蝇进行快速的鉴定识别,并进一步应用此技术对来自我国7省11市的7种瓜菜和2种水果上的21份实蝇幼虫样本进行鉴定.[结果]通过单独或组合酶切的方式建立了一套针对瓜实蝇、南亚果实蝇和橘小实蝇的PCR-RFLP快速分子鉴定技术,并将此方法应用于田间监测.田间鉴定结果表明,湖北、湖南、浙江等地区危害瓜菜的实蝇主要是南亚果实蝇,广东、广西、海南等地区瓜菜上的实蝇种类主要是瓜实蝇,且瓜实蝇和南亚果实蝇存在寄主重叠现象,云南危害火龙果和芒果等水果上的实蝇主要是橘小实蝇.[结论]本研究建立的瓜实蝇、南亚果实蝇和橘小实蝇的识别鉴定方法,因不受虫体、虫态的影响,且具有低成本、高效、快速、重复性好的特点,适用于田间瓜果上实蝇样本的快速诊断检测.依据田间鉴定结果,预测近年来瓜实蝇可能有逐渐向北扩散的趋势.     

伪品乌梢蛇PCR鉴别和蛇种溯源调查

目的利用基因序列同源性分析的方法对伪品乌梢蛇蛇种溯源调查。方法 (1)用PCR的方法对供试品进行鉴别;(2)利用通用引物扩增乌梢蛇对照药材和供试品COⅠ基因,将PCR产物进行测序,测序结果在NCBI进行BLAST序列同源性比对分析。结果 (1)在与对照药材凝胶电泳图谱300～400 bp处,无DNA条带,200～300 bp处有DNA条带;(2)基因序列同源性比对结果显示,对照药材为乌梢蛇,两个供试品均为灰鼠蛇。结论用PCR方法鉴别乌梢蛇是一种准确、客观的方法。利用COⅠ基因通用引物扩增的PCR产物进行测序和序列同源性比对,可以对蛇种进行溯源调查。     

基于16S rDNA基因的谷斑皮蠹PCR检测技术

【目的】谷斑皮蠹是一种重要的检疫性害虫,在新疆周边多个国家分布,口岸检疫人员多次从进境货物中截获谷斑皮蠹,该虫对新疆的农业生产极具威胁。【方法】以谷斑皮蠹的16S rDNA基因为靶序列,用昆虫通用引物对4种供试皮蠹进行PCR扩增,将扩增产物进行克隆和测序,用生物软件设计检测谷斑皮蠹的特异性引物与探针。【结果】设计的特异性引物(TG-SNP-F/TG-SNP-R)及所建立的常规PCR方法能有效检测出谷斑皮蠹,其扩增产物的片段大小为250 bp,灵敏度为3 ng·μL~(-1)。设计的特异性引物(TG-F/TG-R)和探针(TG-probe),以及所建立的实时荧光PCR方法,对谷斑皮蠹的检测特异性强,灵敏度达0.8 fg·μL~(-1)。【结论】建立的常规PCR方法和实时荧光PCR检测方法能够对谷斑皮蠹进行准确鉴定,为口岸检疫人员检测进境货物中携带的谷斑皮蠹提供技术支持。     

实蝇类害虫分子鉴定研究进展

随着国际贸易活动的日趋频繁及其复杂化,实蝇类害虫的传播扩散机率越来越大,直接威胁农业生产安全,成为影响果蔬等进出口贸易的重要检疫问题之一。因此,实蝇的准确识别与快速鉴定受到了世界各国的高度重视。本文主要对目前已经被用于实蝇鉴定的分子生物学技术的原理、优缺点及其研究进展进行概述;同时,根据BOLD Systems现有的数据,汇总了截至2014年10月22日实蝇DNA条形码的种类、已公布研究的记录数及涉及的实蝇种类。结果表明:目前应用于实蝇鉴定的DNA条形码有COⅠ-5P、COⅠ-3P、COⅡ、COⅢ、CYTB、atp6、28S等7种;其中以COⅠ标记为主,已公布的记录数为4540,是其他5种DNA标记的113.5倍,COⅠ-5P标记研究的实蝇科种类有315种,COⅠ-3P标记的有116种;目前研究较多的为果实蝇属、寡鬃实蝇属、腊实蝇属。本文对今后选用分子生物学技术鉴定实蝇种属具有重要的理论意义。     

北京泛菌的生长特性及快速鉴定方法研究

[目的]研究分析了杏鲍菇软腐病病原菌北京泛菌的生长特性以及病原菌的快速鉴定方法,从而为杏鲍菇软腐病的防控打下基础。[方法]测定了北京泛菌在不同温度、不同种类抗生素、不同浓度的杀菌剂二氧化氯的生长情况,以及采用特异性引物进行PCR鉴定病原菌。[结果]北京泛菌生长的最适温度28℃,对硫酸链霉素、羧苄青霉素等7类抗生素敏感,在含有50 mg/L的杀菌剂二氧化氯的培养基中不能生长,引物对hrp LF/R、wzx CF/R、tua GF/R和lps DF/R在北京泛菌能够扩增出目的条带。[结论]明确了北京泛菌的生长特性,50 mg/L的杀菌剂能够有效杀灭病原菌,并开发了4对特异性引物用于病原菌的快速、准确鉴定,为杏鲍菇软腐病的防控打下基础。     

入侵害虫梣粉虱的种特异性SS-COⅠ检测技术

【目的】梣粉虱是新近入侵中国大陆的一种危险性果树和园林植物害虫,针对其体型微小,与近缘种粉虱形态相仿,很难快速准确区分的问题,以田间常见的11种/隐种粉虱为参考,采用基于mt DNA细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(mitochondrial DNA cytochrome c oxidase subunitⅠ,mt DNA COⅠ)基因的物种特异性(species-specific COⅠ,SS-COⅠ)PCR法,研究梣粉虱快速分子检测鉴定技术。【方法】利用mt DNA COⅠ基因通用型引物对LCO-1490/HCO-2198获得梣粉虱和其他常见粉虱的COⅠ基因序列,根据测序结果设计梣粉虱特异性SS-COⅠ引物1对(SPZWCF1/SPZWCR1),之后确定其对目的片段的扩增长度,并对该引物对的物种特异性和检测灵敏性进行检验。【结果】引物对SPZWCF1/SPZWCR1扩增片段的长度为426 bp。物种特异性检验结果显示,该对引物只对梣粉虱的mt DNA COⅠ基因具有扩增效果,对我国常见的其他种类的粉虱包括5种烟粉虱隐种(AsiaⅠ、AsiaⅡ1、AsiaⅡ3、MED、MEAM1隐种)以及桑粉虱、螺旋粉虱、黑刺粉虱、柑橘粉虱、双钩巢粉虱和温室粉虱等不具有交叉反应和扩增能力。灵敏性检验结果显示,该对引物不仅对不同性别、不同采集地的成虫具有良好的扩增效能,对2~4龄若虫以及单粒卵和初孵若虫亦具有同样的扩增效力,其最低检测阈值为75.1 pg·μL-1(相当于1/10240头雌性成虫)。【结论】该技术体系可用于梣粉虱的快速准确鉴定及其检测和监测,对有效阻截其进一步传播扩散具有重要作用。     

16S rRNA PCR鉴定脆弱类杆菌

目的:应用16SrRNA序列设计PCR引物鉴别脆弱类杆菌。方法:通过脆弱类杆菌16SrRNA序列特异性位点设计引物,对4株脆弱类杆菌及大肠杆菌、乳酸杆菌、嗜热链球菌等进行PCR扩增。应用琼脂糖电泳法对PCR扩增产物进行特异性检测。结果:脆弱类杆菌在176bp左右出现特异性条带,而其他细菌均未出现特异性条带。结论:通过16SrRNA序列中特异位点设计引物进行PCR,可特异性鉴定脆弱类杆菌。     

应用多重PCR鉴定微生物肥料常用芽孢杆菌

[目的]枯草群芽孢杆菌中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliq-wefaciens)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)和短小芽孢杆菌(B.pumilus)是微生物肥料中常用菌种,用传统方法鉴定费时费力,有必要建立检测和鉴定这些芽孢杆菌的种特异性PCR方法.[方法]利用已登录的gyrA、rpoA和16s rRNA基因序列分别设计和筛选上述菌种的特异引物并建立多重PCR反应体系.[结果]以基因组DNA为模板,扩增芽孢杆菌、类芽孢杆菌和短芽孢杆菌3属15种的标准菌株(共33株),4个目标种分别产生了大小不同的唯一的产物,除个别种与短小芽孢杆菌引物有交叉反应外,其余参考菌株均为阴性.从23株枯草群菌株的基因组DNA扩增发现,PCR鉴定与常规鉴定结果一致.[结论]本文建立的多重PCR方法具有较好的特异性,可快速准确鉴定枯草群的4个种,在微生物肥料检测方面有良好的实用前景.     

基于虫菌双重PCR快速鉴别冬虫夏草

为了快速准确的鉴别冬虫夏草(Chinese cordyceps)及其混淆品,基于冬虫夏草虫体部分含有寄主昆虫和寄生菌基因组DNA,以寄主昆虫细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因及冬虫夏草菌rDNA ITS区设计特异引物(CC-2F/CC-2R,DCF4/R4),通过对双重特异性聚合酶链式反应(PCR)进行优化,结果成功从冬虫夏草虫体部分扩增出220 bp和146 bp 2条特异性条带,而其混淆品无目标条带或部分条带缺失。不同模板稀释倍数考察结果表明该方法灵敏度较高,对冬虫夏草样品检测具有稳定的特异性,且能够快速鉴别冬虫夏草真伪,为冬虫夏草产品质量评价的提升提供了支持。