产绿原酸内生菌的分离及其绿原酸合成途径关键基因的克隆和功能研究

【目的】分离产绿原酸的内生菌并对其绿原酸合成途径的一种关键酶基因进行克隆和功能研究。【方法】采用表面消毒法从金银花中分离内生菌,以高效液相色谱(HPLC)和液相色谱-质谱联用(LC-MS)筛选确定产绿原酸的内生菌,克隆、表达该内生菌的组氨酸解氨基酶(HAL)并进行酶活测定。【结果】从金银花根中分离到一株产绿原酸的内生细菌RP1,同时在该内生菌发酵液中检测到了绿原酸代谢的中间物肉桂酸。对RP1的分子鉴定表明该内生菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。对RP1的HAL基因进行克隆和原核表达,酶活测定表明该酶具有HAL和PAL (苯丙氨酸解氨基酶)双功能,其PAL活性产生的肉桂酸与LC-MS检测的结果一致。【结论】推测该内生菌可能利用其HAL的苯丙氨酸解氨基活性将苯丙氨酸的催化产物肉桂酸导入苯丙烷途径,从而产生绿原酸。     

东亚飞蝗细胞色素P450基因的克隆及表达分析

本文克隆了东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis(Meyen)细胞色素P450(cytochrome P450)基因全长,表达重组蛋白,并对其可溶性进行了分析。通过提取东亚飞蝗总的RNA,反转录成cDNA,设计特异性引物,PCR克隆东亚飞蝗细胞色素P450基因,将测序正确的目的片段克隆至原核表达载体pET-28a中,在大肠埃希菌Escherichia coli Rosetta中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测重组蛋白表达结果。结果表明:东亚飞蝗细胞色素P450基因开放阅读框全长为1 551 bp,编码516个氨基酸,与GenBank中已登录的东亚飞蝗细胞色素P450基因(HM153426)的同源性为99%,重组质粒pET-28a-P450在E.coli Rosetta中获得高效表达,重组蛋白相对分子质量(Mr)约为53 000,主要以包涵体的形式存在。     

何首乌中Ⅲ型聚酮合酶基因FmPKS2的原核表达及鉴定

目的：对传统中药何首乌中Ⅲ型聚酮合酶基因FmPKS2进行原核表达并鉴定重组蛋白酶活性,为研究该酶基因在何首乌有效成分代谢合成及其调控中的功能奠定基础。方法：根据何首乌FmPKS2（GenBank登录号：GQ984139）基因序列,通过PCR扩增其全长的编码区,克隆至原核表达载体PET-28a,构建重组质粒PET-FmPKS2,将其转化原核表达菌株E.coli BL21（DE3）,并用IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白可溶性,通过Ni-NTA亲和树脂纯化可溶性蛋白后以丙二酰-COA和香豆酰-COA为底物进行催化反应,TLC鉴定反应产物。结果：经过诱导,重组菌表达分子量为42KD左右的融合蛋白,其中可溶性重组蛋白最优表达条件为IPTG浓度0.5 mmol/L,诱导时间6h,温度25℃。纯化后的可溶性重组蛋白催化丙二酰-COA和香豆酰-COA得到的产物经TLC鉴定为二苯乙烯类化合物白藜芦醇。结论：成功实现FmPKS2的原核表达且融合蛋白以可溶形式存在,催化反应证明FmPKS2融合蛋白具有二苯乙烯合酶的活性。     

北柴胡细胞色素P450酶基因的克隆及其植物过量表达载体的构建

目的:克隆北柴胡中可能参与柴胡皂苷生物合成的细胞色素P450酶基因,构建其过量表达载体,为通过转基因验证其功能奠定基础。方法:在454高通量测序获得5'和3'端部分cDNA序列的基础上,利用LD-PCR方法获得全长cDNA,根据全长cDNA序列设计含有酶切位点的PCR引物,利用高保真酶,以RNA反转录产物为模板PCR扩增细胞色素P450酶基因的开放读框,扩增产物与pEASY-T1 Simple载体连接,转化大肠杆菌DH5α;重组质粒pT1-P450经菌液PCR和酶切方法验证后测序,采用NCBI在线Blastx、DNAman和MEGA4软件对序列进行生物信息学分析,随后将pT1-P450的酶切产物插入双元载体pCAMBIA-SUPER 1300,菌液PCR和酶切验证重组质粒p1300-P450。结果:扩增到了北柴胡细胞色素P450酶基因BcCYP87E,构建了这一基因的过量表达载体。结论:细胞色素P450酶基因的克隆和转基因载体的构建,为后续开展转基因研究,验证其生物功能奠定了基础。     

甜菊醇糖苷生物合成途径关键酶基因KA13H的克隆及序列分析

本研究利用RT-PCR方法从甜叶菊叶片中分离了一个与甜菊醇糖苷生物合成密切相关的基因KA13H,对该基因的ORF、编码产物结构、同源性比对及次级结构等进行了生物信息学预测分析,同时初步分析该基因的组织表达和原核表达。经DNAMAN6.0软件分析,该基因编码一条分子量为54.476kD的由476个氨基酸残基组成的多肽,含有典型的细胞色素P450的血红素结合位点FXXGXXXCXG,TMPRED程序预测其C-端含有一个明显的跨膜区MIQVLTPILLFLIFFVFWKVY,是一个典型的细胞色素P450基因。推断的KA13H编码产物与其它生物合成相关细胞色素P450同源比对和系统发生分析表明,该蛋白与苜蓿(Medicago truncatula)CYP716A12和云杉(Sitka spruce)CYP720B1的一致性较高,分别为51%和46%,推测KA13H可能与CYP716A12和CYP720B1具有类似的功能。KA13H次级结构分析结果表明,KA13H与CYP74A2的一致性仅为15%,但是它们却有着类似的次级结构,都含有6个基质识别位点(SRSs)。半定量RT-PCR分析表明:KA13H在根、茎、叶和花中呈组成型表达,叶和花中的表达丰度较高;将该基因融合到原核表达载体pGEX-4T-1中,在原核中得到了成功表达。根据本研究结果,我们推测KA13H可能在甜菊醇糖苷生物合成过程中发挥着重要作用,该基因的克隆和表达分析为进一步深入了解甜菊醇的生物合成过程中相关酶和基因的功能奠定了基础。     

丹参香豆酸-3-羟化酶基因(SmC3H)的生物信息学及其组织表达模式分析

通过分析丹参转录组数据库(SRX021907)得到一条香豆酸-3-羟化酶(C3H)基因,blast比对发现该基因为丹参C3H(EU358957.1),该基因c DNA全长1 704 bp,包括1个1 503 bp的开放阅读框,编码508个氨基酸。生物信息学分析表明,其编码蛋白的分子量为57.21 k D,等电点为8.53,含琢-螺旋,延伸链和无规则卷曲,具有1个细胞色素P450蛋白(CYP450)特异的保守结构域。聚类分析表明其与芝麻的亲缘关系最近。组织特异性表达分析结果表明,该基因在茎中的表达量最丰富,其次是叶和花,根中最低。     

柠条锦鸡儿香豆酸-3-羟化酶基因克隆及其功能初步研究

香豆酸-3-羟化酶(Coumarate 3-Hydroxylase,C3H)是木质素生物合成途径中的关键酶之一.以柠条锦鸡儿为材料,利用RACE技术克隆了C3H基因.对柠条锦鸡儿C3H基因的gDNA和cDNA全长分析显示该基因具有3个外显子,2个内含子,编码框长度为1530bp,编码509个氨基酸.预测该基因编码蛋白的等电点位7.67,分子量约57.61 kDa.氨基酸序列分析显示具有一个保守的P450结构域.系统进化分析表明该蛋白与大豆C3H具有最高的同源性,将该基因命名为CkC3H,GeneBank登录号为HQ829858.构建了35S启动子驱动的CkC3H基因植物表达载体,互补拟南芥C3H(CYP98A3)基因突变体ref8,转基因植物表型得以部分恢复.这些结果说明柠条锦鸡儿CkC3H与拟南芥C3H至少具有部分相同的功能.     

鸡细胞色素P450 1A5的原核表达与活性重组

旨在对鸡细胞色素P450 1A5(CYP1A5)蛋白进行体外功能研究,采用大肠杆菌系统进行CYP1A5的异源表达。以鸡的cDNA为模板,扩增出CYP1A5基因,将该基因的N端编码区进行修饰,并连接到pCW载体中构建His-CYP1A5,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达。经CO-差示光谱检测,所获得的His-CYP1A5具有典型的P450吸收峰。该蛋白与细胞色素P450还原酶(CPR)进行体外重组,构成的重组酶系表现出乙氧基试卤灵-O-脱乙基酶活性。结果表明,所采用的表达策略可以成功产生出具有催化活性的鸡细胞色素P450 1A5(CYP1A5)蛋白。     

利用杆状病毒Bac-to-Bac系统在Sf9细胞中表达真菌细胞色素P450nor

利用BactoBac杆状病毒载体表达系统将真菌细胞色素P450nor基因克隆至转移载体pFastBac1中, 得到重组质粒pFastBacP450nor, 再将其转化进入含穿梭载体Bacmid的受体菌DH10Bac中发生转座作用, 得到含P450nor基因的重组穿梭载体rBacmid pAcP450nor。分离提取重组Bacmid DNA, 并转染培养的昆虫细胞Sf9, 得到重组病毒rAcp450nor。经酶切和PCR 鉴定, 细胞色素P450nor基因正确地插入到病毒基因组的多角体蛋白基因启动子下, SDSPAGE分析证明：表达蛋白的分子量为43kD左右。Western blotting分析结果表明：有一条特定的杂交带存在, 且分子量相同（约43kD）。进一步证明了含有真菌细胞色素P450nor基因的重组表达载体和重组病毒构建成功,并在昆虫细胞Sf9中实现了高效表达, 经MTT法测定表达的细胞色素P450nor具有还原NO的生物学活性。     

荸荠肉桂酸4-羟基化酶基因的克隆及其在鲜切荸荠黄化过程中的表达分析

肉桂酸4-羟基化酶(cinnamic acid 4-hydroxylase,C4H)是苯丙烷代谢途径中的关键酶,在植物黄酮类物质合成代谢过程中发挥重要作用。鲜切荸荠贮藏过程中由于黄酮类物质积累而导致的黄化现象很可能离不开C4H的参与。本研究利用RACE技术在荸荠中克隆得到C4H基因cDNA全长,命名为Cw C4H(GenBank登录号:MG719237),该序列长度为1736 bp,编码一条由505个氨基酸组成的多肽,分子量为57.826 kD。Cw C4H包含细胞色素P450结构域,其二级结构以α-螺旋为主。多重比对结果表明,CwC4H具有该基因家族特有的保守结构域并与其它植物的C4H蛋白有很高的相似性。系统进化分析表明CwC4H与高粱C4H蛋白亲缘关系较近。荧光定量PCR分析表明,鲜切荸荠黄化过程中Cw C4H表达量快速上升,水杨酸处理抑制了鲜切荸荠的黄化和CwC4H的表达。     

新基因PRR11的克隆、原核表达及鉴定

克隆新基因PRR11的开放阅读框区,构建其原核表达载体,并进行表达检测及鉴定.以Hela细胞cDNA为模板,RT-PCR扩增PRR11基因,克隆入原核表达载体PET-28a中,酶切、测序鉴定确认获得PRR11基因的重组原核表达载体PET-28a-PRR11.然后把PET-28a-PRR11重组载体转化到BL21中,经IPTG诱导蛋白表达,提取细胞蛋白并采用SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹法检测目的蛋白的表达情况.结果表明成功扩增了PRR11基因,双酶切、测序鉴定证实目的基因成功克隆到原核表达载体PET-28a中,目的蛋白成功表达.成功构建的PRR11基因的原核表达载体,及PRR11的重组蛋白表达产物,为进一步研究PRR11的基因功能奠定了基础.     

大豆异黄酮合成途径相关基因差异表达分析

大豆异黄酮是一种应用广泛、具有医用和保健功能的活性物质。为揭示异黄酮合成途径相关基因表达差异,本研究采用实时定量PCR技术分析相关基因在不同大豆品种、发育时期及组织部位的表达。结果发现,苯丙氨酸解氨酶基因PAL、肉桂酸羟化酶基因C4H、香豆酸辅酶A连接酶基因4CL在高异黄酮品种中豆27 R2期叶片中的表达量显著高于低异黄酮品种楚秀;查尔酮合成酶基因CHS、异黄酮合成酶基因IFS在中豆27 R8期子粒中的表达量显著高于楚秀;细胞色素还原酶基因CPR在中豆27 R7期叶片与子粒的表达量与楚秀相比显著降低。这些差异表达的基因可能是形成大豆品种异黄酮含量高低的重要原因。     

产对香豆酸酿酒酵母工程菌株的构建与优化

对香豆酸是黄酮类、芪类等天然活性化合物的重要前体,在生物医药、食品等行业应用广泛。与传统植物提取和化学合成相比,微生物合成对香豆酸因其具有生产周期短、转化效率高等优势而得到广泛关注。为构建高产对香豆酸酵母工程菌株,以酿酒酵母为出发菌,通过敲除酪氨酸合成竞争路径基因ARO10和PDC5,突变芳香族氨基酸合成调控基因ARO4^K229L与ARO7^G141S、解除酪氨酸负反馈抑制、并整合酪氨酸解氨酶FjTAL,获得的工程菌C001对香豆酸产量为296.73 mg/L。为进一步提高对香豆酸合成前体积累,分别敲除8个与氨基酸、糖类等转运相关基因并强化糖异生途径,分析其对对香豆酸积累的影响。结果表明,敲除GAL2及过表达EcppsA,对香豆酸产量提高至475.11 mg/L。最后,分析了FjTAL蛋白锚定至酵母液泡对产物积累的影响,结果表明其定位液泡后对香豆酸产量明显提升,达到593.04mg/L。通过强化前体物供应,阻断竞争旁路途径,利用亚细胞定位等策略有效提高对香豆酸产量,为后续黄酮类及芪类化合物的合成提供高效平台菌株,具有重要的应用前景。     

香港海鸥菌OsmC蛋白的原核表达、纯化及活性研究

[目的]原核表达纯化香港海鸥菌OsmC蛋白,并检测其抗氧化功能。[方法]通过PCR法扩增香港海鸥菌OsmC基因,将目的片段进行双酶切后连接到pET28a,构建重组质粒pET28a-OsmC并转化大肠杆菌,诱导OsmC蛋白表达,亲和层析纯化目的蛋白并利用氧化铁二甲酚橙实验检测其过氧化物酶活性。[结果]克隆得到全长基因,大小为441bp,编码147个氨基酸。得到重组表达质粒pET28a-OsmC,表达并纯化获得重组OsmC蛋白,OsmC蛋白能够降解H2O2。[结论]Osm C蛋白具有过氧化物酶活性,为研究香港海鸥菌的抗氧化机制奠定了基础。     

鼠疫耶尔森氏菌VcrV基因在大肠杆菌中的高效表达

将测序后的鼠疫耶尔森氏菌（Yersinia pestis)LcrV基因重组质粒pGEM－T／ypV酶切,克隆于原核表达载体pBV220,构建成pBV/ypV表达质粒,转化大肠杆菌DH5α,进行PCR及酶切鉴定,筛选阳性克隆,进行温控诱导表达,SDS－PAGE检测表达产物,在相对分子质量38000处有－表达条带,经薄层扫描分析目的蛋白带占全菌蛋白的38．4％以上,主要以可溶形式存在。     

抗菌肽Cec4a的重组表达和抗菌活性研究*

目的:构建Cec4a的原核重组表达体系,通过诱导表达、酶切纯化获得重组蛋白,并检测产物的抗菌活性。方法:基于Cec4a的序列设计引物,克隆Cec4a基因的DNA片段。利用原核表达载体(pCold-SUMO)构建重组原核表达质粒,并将其转化到大肠杆菌C41(DE3)等感受态细胞,使用IPTG进行诱导表达。通过Ni-NTA亲和层析柱纯化,获得含有His-SUMO标签的重组Cec4a融合蛋白。在SUMO蛋白酶酶切后,再次使用Ni-NTA亲和层析纯化,得到目的蛋白,最后用鲍曼不动杆菌(ATCC19606)作为指示菌检测表达产物的抗菌活性。结果:成功构建pCold-SUMO-Cec4a原核表达质粒,测序分析其序列与预期结果一致。Cec4a融合蛋白表达量为42.8mg/L,纯化后的Cec4a重组蛋白对鲍曼不动杆菌的MIC为4 μg/mL。结论:通过原核表达,并经Ni-NTA亲和层析纯化,获得了具有抗菌活性的重组蛋白Cec4a,为研究Cec4a的生物活性、抗菌机制及应用奠定了基础。     

家蚕浓核病毒中国株非结构蛋白1(NS1)的表达

利用PCR技术扩增出BmDNV-3 NS1基因,将目的基因与原核表达载体pET-30a进行连接,转化BL21 star菌并在该菌中表达,经Western blot鉴定表达的产物为BmDNV-3 NS1蛋白,纯化NS1蛋白并制备兔多克隆抗体.同时BmDNV-3 NS1基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBae-HTb-eGFP中,转化BmDH10BAC感受态细胞,提取的重组Bacmid通过脂质体包埋转染家蚕BmN细胞,再以收获的重组病毒感染家蚕幼虫.家蚕BmN细胞和幼虫感染重组病毒2d后均观察到绿色荧光,经SDS-PAGE分析真核表达的产物与预测的NS1-eGFP融合蛋白大小不一致,说明NS1-eGFP融合蛋白被昆虫内源性的蛋白酶降解.降解的产物用NS1蛋白抗体进行Western blot鉴定为BmDNV-3 NS1蛋白.     

川西獐牙菜SmDL7H基因原核表达及组织表达

该研究根据川西獐牙菜转录组信息获得7-脱氧马钱子酸羟化酶(SmDL7H)基因的全长cDNA序列,对该基因进行同源克隆、生物信息学分析,并构建原核表达载体、转化大肠杆菌、进行原核表达和组织特异性表达分析,以探讨川西獐牙菜裂环烯醚萜合成途径中关键酶7-脱氧马钱子酸羟化酶(SmDL7H)基因的功能,为研究裂环烯醚萜类化合物合成途径奠定基础。结果表明:(1)成功克隆了川西獐牙菜SmDL7 H基因(GenBank登录号为MH243070);SmDL7 H基因开放阅读框为1 554bp,编码517个氨基酸,相对分子质量为59.5kD,等电点9.02;生物信息学预测SmDL7 H基因编码蛋白无信号肽。(2)多序列比对及进化树分析显示,SmDL7 H编码的蛋白与滇龙胆、长春花、金银花等植物的DL7 H基因编码的蛋白具有较高相似性。(3)将SmDL7 H基因连接到pET-28a原核表达载体,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),用0.1mol/L IPTG于25℃诱导12h,原核表达分析发现在59.5kD处有目的蛋白出现,表明与之前预测的蛋白大小一致。(4)荧光定量PCR分析显示,SmDL7 H基因在川西獐牙菜叶、茎、花、根、愈伤组织中均有表达,其中在叶片中表达量最高,在根中表达量最低。     

蜜蜂NADPH-细胞色素P450还原酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学特性分析

10-羟基-2-癸烯酸（10-HDA）是蜂王浆中的主要脂肪酸成分,具有抗菌、抗癌、延缓衰老等多种生理活性,但目前关于10-HDA生物合成的分子机制还不清楚。通过克隆蜜蜂NADPH-细胞色素P450还原酶（EC 1.6.2.4,NADPH-cytochrome P450 reductase,CPR）,在大肠杆菌中异源表达,并对其酶学特性进行分析。结果表明重组菌经IPTG诱导后表达蛋白的分子量与预期一致,为86.29 kDa,Ni-NTA亲和纯化后测得其比活性为77.33（EU of CPR）/μg。酶学性质分析结果表明蜜蜂CPR酶最适温度与pH分别为40℃和8.0,并对一些金属离子及有机溶剂具有不同程度的耐受性。其对底物细胞色素C的动力学参数K_m和k_cat分别为76 μM和268/min。以上研究为探究CPR在10-HDA生物合成途径中的功能奠定理论基础。