铜胁迫对不同抗性种群海州香薷酸性转化酶基因启动子甲基化的影响

采用亚硫酸氢盐测序技术,检测了Cu胁迫对海州香薷（Elsholtzia haichowensis Sun） Cu抗性和非抗性种群酸性转化酶基因启动子甲基化的影响。结果表明,海州香薷液泡转化酶基因（vINV）和细胞壁转化酶基因（cwINV）的启动子在CG位点分别表现出超甲基化和低甲基化的现象。酸性转化酶基因启动子CHG和CHH位点的甲基化状态受Cu胁迫影响较大。Cu胁迫下,vINV和cwINV启动子分别有1个CHG和6个CHH位点的甲基化状态在Cu抗性种群和非抗性种群之间表现出较大差异。抗Cu种群中这些甲基化差异位点对Cu胁迫不敏感,但在非抗性种群中这些位点的甲基化水平在Cu胁迫后出现大幅上升或下降。有些甲基化差异位点位于或者临近预测的启动子顺式作用元件区域,可能参与Cu胁迫下酸性转化酶基因的表达调控。     

海州香薷(Elsholtzia haichowensis Sun)细胞壁转化酶基因启动子(EhcwINVP)的克隆及活性分析

以海州香薷基因组DNA为模板,通过hiTAIL-PCR和walking技术扩增得到其细胞壁转化酶基因启动子(Ehcw INVP)片段,长度为1727 bp。生物信息学分析结果表明,该启动子片段中含有多个对脱落酸、赤霉素、细胞分裂素等激素以及对干旱、低温、重金属铜等逆境胁迫响应相关的顺式作用元件。将通过克隆得到的Ehcw INVP序列替换p CAMBIA1301载体上驱动GUS报告基因表达的Ca MV35S启动子序列,构建Ehcw INVP融合GUS的植物表达载体Ehcw INVP::GUS。转基因拟南芥植株的组织化学分析结果表明,海州香薷细胞壁转化酶基因启动子序列具有驱动GUS基因表达的功能,且在10μmol/L铜胁迫下,转基因拟南芥植株叶和根中的GUS活性分别约是对照组的1.7倍和1.5倍。     

铜胁迫下海州香薷根中铜诱导蛋白的鉴定

以铜耐性植物海州香薷为材料,在水培条件下对其幼苗进行不同浓度的CuSO4处理,通过铜结合蛋白分析和双向电泳(2D-AGE)分析,研究铜胁迫条件下海州香薷根中铜诱导蛋白的结合方式及表达情况.结果表明(1)100μmol/L CuSO4处理海州香薷幼苗6 d,可使其根中蛋白巯基的含量显著升高.(2)将其蛋白提取液通过SephadexG-50后,发现洗脱液中铜诱导物的增加与铜分布显著相关,表明铜诱导蛋白可能为铜结合蛋白.(3)通过2D-PAGE和质谱分析发现,铜胁迫下类抗性蛋白、S-腺苷甲硫氨酸合成酶和脂肪酸羟化酶的表达升高,而抗坏血酸过氧化物酶和半胱氨酸合成酶表达则降低.     

海州香薷Actin基因片段克隆及表达分析

通过克隆海州香薷Actin基因片段并分析其组织表达,为研究海州香薷重金属抗性相关基因的表达调控奠定基础。根据Gen Bank中其他植物Actin基因保守序列设计兼并引物,以海州香薷根总RNA为模板,利用RT-PCR技术分离得到Actin基因片段。序列分析结果表明,海州香薷Actin基因片段长576 bp,编码192个氨基酸,与其他植物同源基因的氨基酸序列相似性为84%-97%,所克隆的序列为Actin基因的同源片段,将其命名为Eh ACT,在Gen Bank中提交序列,获得登录号AGT37260。半定量RT-PCR分析结果表明,Eh ACT在海州香薷的根、茎和叶中表达相对稳定,初步表明其可作为研究海州香薷基因表达的内参基因。     

铜胁迫条件下AMF对海州香薷光合色素含量、抗氧化能力和膜脂过氧化的影响

以盆栽海州香薷为研究对象,模拟Cu胁迫条件下,接种丛枝菌根真菌(AMF)对海州香薷叶片光合色素含量、抗氧化酶活性、抗氧化剂含量、膜脂过氧化程度的影响。结果表明:(1)与对照相比,Cu胁迫使海州香薷叶片叶绿素a(Chl a)、叶绿素b(Chl b)、总叶绿素(Chl(a+b))、类胡萝卜素(Car)含量以及叶绿素a/b(Chl a/b)均显著降低,抗氧化酶活性和抗氧化剂含量也显著下降,质膜相对透性(MRP)和丙二醛(MDA)含量显著增大。(2)与Cu胁迫相比,Cu胁迫下接种AMF可使海州香薷叶片叶绿素含量显著增加;超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性显著提高;还原型谷胱甘肽(GSH)、抗坏血酸(As A)含量显著增加;MDA含量、MRP显著下降。总之,接种AMF可提高Cu胁迫下海州香薷叶片光合色素含量和抗氧化能力,降低膜脂过氧化水平,从而缓解Cu胁迫对植株造成的伤害,增强海州香薷对Cu胁迫的适应性,提高了植株的生物量。     

接种土壤微生物对铜胁迫下海州香薷生长及光合生理的影响

采用框栽试验方法,模拟Cu胁迫条件下,探讨接种土壤微生物对海州香薷(Elsholtzia splendens)生长和光合生理的影响。结果表明:(1)在Cu胁迫下,海州香薷株数、株高、基径、生物量、茎重比均显著低于对照;与Cu胁迫相比,接种土壤微生物能显著缓解Cu胁迫对海州香薷生长的抑制作用,使植株的株数、株高、生物量、茎重比显著提高。Cu胁迫下,接种土壤微生物均降低了植株体内不同器官Cu含量,茎和叶Cu的累积量显著减少,但对其它器官的Cu含量影响不显著。(2)秋季,各处理的海州香薷的净光合速率(Pn)日变化均呈"单峰"曲线,接种土壤微生物显著提高了Cu胁迫下海州香薷的日均Pn、日均蒸腾速率(Tr),而日均气孔导度(Gs)、日均胞间CO2浓度(Ci)显著降低。(3)Cu胁迫下,接种土壤微生物显著提高了植株的最大净光合速率(Pnmax)、光饱和点(LSP)、表观量子效率(AQY)、最大羧化速率(Vcmax)、最大电子传递速率(Jmax)、磷酸丙糖利用率(TPU),且使光补偿点(LCP)显著降低。表明接种土壤微生物通过提高光能利用率、利用弱光和碳同化能力来增强光合作用能力及有机物的积累,缓解Cu胁迫对海州香薷的毒害。因此,接种土壤微生物可促进Cu胁迫下海州香薷的生长,在重金属污染土壤的植物修复中具有较好的应用潜力。     

苹果液泡酸性转化酶基因片段的克隆及序列分析

在分析植物可溶性转化酶基因的保守区序列基础上,设计了一对PCR引物,以苹果(辽伏)基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出长约743bp的DNA片段,克隆入pUCm—T载体,测序结果表明,所获得的片段推测为苹果酸性转化酶基因的片段,该基因片段长度为743bp,是开放阅读框的一部分,无内含子。其序列已在GenBank中登记(登记号为AF433644)。在Gen-Bank中进行同源性检索,结果表明该成员编码的氨基酸与植物可溶性酸性转化酶的氨基酸同源性较高,与温州蜜柑(GenBank AF014925)、胡萝卜(X67163)、甜菜(GenBank X81796)和绿豆(GenBank D10265)液泡酸性转化酶基因编码蛋白质的氨基酸分别具有80％、80％、78％和77％的同源性。而与定位于细胞壁的酸性转化酶(不溶性)同源性较低,由此可推测出研究获得的苹果转化酶基因可能定于液泡。该基因片段的获得对于深入研究苹果蔗糖代谢以及果实发育和品质形成具有重要的意义。     

枸杞液泡膜H~+-转运焦磷酸酶基因LbVP1克隆及表达分析

液泡膜H~+-转运焦磷酸酶在调节植物生长发育和逆境胁迫应答中发挥重要作用。本研究在已构建的枸杞本地数据库中先进行VP基因电子克隆,然后结合RT-PCR方法克隆到一个枸杞液泡膜H~+-转运焦磷酸酶编码基因LbVP1,并对其序列结构、时空表达模式进行了初步分析。LbVP1开放阅读框全长2301 bp,编码766氨基酸残基。多序列比对显示该基因与拟南芥AVP基因相似性达87.9%,序列结构生物信息学预测和亚细胞定位实验表明,该基因具有液泡膜H~+-转运焦磷酸酶的保守结构域和跨膜区,可能在液泡膜发挥作用。荧光定量PCR结果显示,LbVP1在花、叶和不同发育阶段果实中存在时空表达差异,干旱胁迫处理下叶片和果实中该基因表达量与对照存在(极)显著差异(P0.01,P 0.05)。研究结果将为阐明该基因在枸杞抗旱分子调控机制中的作用提供基础理论依据。     

长叶红砂液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因的克隆及表达特性

为研究长叶红砂(Reaumuria trigyna)离子转运分子机制,利用RT-PCR和RACE技术,克隆到其液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因(NHX1)的全长cDNA片段,命名为RtNHX1(NCBI序列号为KR919802)。结果表明:RtNHX1的cDNA片段全长2 622bp,开放阅读框1 662bp,5′非编码区509bp,3′非编码区451bp,编码553个氨基酸,推测分子量为60.91kD。该蛋白含有12个跨膜结构域,为疏水蛋白,与其他植物液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白NHX1的亲缘关系较近。实时荧光定量PCR对其在NaCl胁迫下的表达检测显示,不同时间和不同浓度NaCl胁迫下,RtNHX1表达量变化均呈先升高后降低趋势,在100mmol/L NaCl胁迫6h和200mmol/L NaCl胁迫后达到最高,表达量分别超过或约是对照的3倍,一定程度反应出RtNHX1参与长叶红砂的盐胁迫应答,是该植物离子转运体系的重要元件。     

不同海拔下烤烟碳氮代谢相关酶基因的表达差异分析

为探讨贵州乌蒙烟区不同海拔的烤烟特色形成的分子机理,本文利用实时荧光定量PCR技术对的烤烟碳氮代谢相关酶基因的表达进行检测。结果表明,液泡转化酶(VIN)基因在烤烟移栽后50 d的中海拔表达较强,移栽后60 d高海拔表达比较活跃,烤烟成熟期低海拔表达略强。蔗糖合成酶(SS)和蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因在烤烟旺长期高海拔表达较强,烤烟成熟期低海拔表达较强,中海拔表达较弱。在4个取样时期,海拔越高,蔗糖磷酸化酶(SPP)基因表达越强,高海拔地区烟叶的颗粒结合型淀粉合成酶(GBSSI)基因表达均最强。淀粉分支酶(SBE)基因在烤烟移栽后50、60和70 d高海拔下表达较强,在移栽后80 d低海拔下表达相对较强。从同一时期不同海拔的结果分析,烤烟硝酸还原酶(NR)基因表达强度随海拔降低而逐渐增强。谷氨酰胺合成酶(GS1-3和GS1-5)基因表达在4个取样时期表现为低海拔强于中、高海拔的。     

小麦TaNAC5基因克隆及表达分析

NAC转录因子在植物对非生物逆境胁迫的应答过程中发挥着重要作用。该研究利用RACE技术从小麦中克隆了1个NAC基因TaNAC5(HQ650113.1)。序列分析显示,TaNAC5基因开放阅读框(ORF)924bp,编码307个氨基酸。多序列比对和进化树分析显示,TaNAC5基因所编码的蛋白具有NAC家族蛋白的保守结构域,与玉米ZmNAC5有较近的亲缘关系。实时荧光定量PCR分析显示,TaNAC5基因的表达显著受渗透胁迫、低温胁迫、乙烯和双氧水诱导,而受高盐胁迫和ABA抑制。研究表明,TaNAC5参与非生物逆境胁迫及相关信号分子的应答。     

马铃薯甲虫热激蛋白基因Ld-HSP60的克隆、序列分析及温度胁迫下的表达

【目的】马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata是一种世界性检疫害虫,对温度胁迫具有极强的适应性,为进一步明确其对温度胁迫适应性的分子机制,研究了热激蛋白HSP60在马铃薯甲虫温度胁迫应答过程中的作用。【方法】采用RT-PCR及RACE技术克隆马铃薯甲虫热激蛋白HSP60基因的cDNA全长序列;利用生物信息学软件分析该基因及其编码蛋白质的序列特性;运用实时荧光定量PCR技术分析该基因在温度胁迫下的表达模式。【结果】克隆得到马铃薯甲虫热激蛋白HSP60基因,命名为Ld-HSP60(Gen Bank登录号:KC556801),其cDNA全长2 234 bp,开放阅读框(ORF)长1 731 bp,编码576个氨基酸,相对分子量约为61.27 kD,理论等电点为5.51,5'端非翻译区(UTR)长101 bp,3'UTR长402 bp。氨基酸序列中含有HSP60家族典型的特征序列。实时荧光定量PCR结果表明,低温胁迫(-10和0℃)下未检测到马铃薯甲虫雌雄成虫中Ld-HSP60的诱导表达;高温胁迫(38和44℃)诱导马铃薯甲虫雄成虫Ld-HSP60上调表达,随着胁迫温度的升高LdHSP60表达量呈现先升高后降低的趋势,38℃高温胁迫下表达量最高,胁迫时间越长Ld-HSP60表达量也越高。【结论】相比其他热激蛋白,HSP60对温度敏感性较低,推测HSP60可能在马铃薯甲虫雄成虫抵御高温胁迫中发挥作用。     

丹参SmPI1和SmPI2基因克隆及胁迫表达研究

该研究从药用植物丹参中克隆了SmPI1和SmPI2蛋白酶抑制剂基因,采用生物信息学和实时荧光定量PCR方法对其序列及表达模式进行了分析。序列分析结果表明,丹参SmPI1和SmPI2基因分别含有一个长度为222bp和216bp的开放阅读框,编码73和71个氨基酸;2个编码蛋白都无跨膜结构域和信号肽,预测都定位于细胞质中;SmPI1和SmPI2蛋白与川桑、可可、苜蓿等植物的蛋白酶抑制剂基因相似性较高,分别为58%、52%、53%和54%、56%、51%。实时荧光定量PCR结果表明,SmPI1和SmPI2基因受茉莉酸甲酯(MeJA)和甘蓝黑腐病黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.Campestris,XC)显著诱导,说明丹参SmPI1和SmPI2基因可强烈响应这两类胁迫,可能参与丹参中两类胁迫分子途径相关的抗性反应。     

盐胁迫下盐穗木甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的表达与亚细胞定位分析

为研究盐胁迫下植物甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的作用机制,该研究利用RACE技术,从藜科盐生植物盐穗木中克隆获得1 381bp GAPDH基因(HcGAPDH)全长cDNA序列,其开放阅读框(ORF)编码314氨基酸。序列分析表明,HcGAPDH属于胞质GAPDH家族成员。实时定量PCR结果显示,HcGAPDH的转录水平受盐胁迫和ABA上调。通过荧光共聚焦显微技术,检测到绿色荧光蛋白标记的HcGAPDH在正常情况下定位于细胞质中,盐胁迫可促使其从细胞质转移至细胞核中,此过程与细胞内碳水化合物代谢的信号途径不具有相关性。研究表明,HcGAPDH通过细胞质和细胞核之间的信号传导在植物盐胁迫中发挥一定作用,为进一步揭示盐穗木耐盐分子机制奠定了一定基础。     

铜胁迫下两种海州香薷的膜脂过氧化水平及抗氧化能力比较

研究了不同浓度铜处理下2种来源海洲香薷(矿区:湖北赤马山铜矿;正常土壤:湖北红安)膜脂过氧化水平和抗氧化能力的情况。结果表明,在相同浓度的铜处理下,非矿区种的丙二醛(MDA)含量明显高于矿区种,显示非矿区种体内膜脂过氧化水平较高,受到较严重的过氧化伤害;非矿区种体内抗坏血酸(AsA)和还原型谷胱甘肽(GSH)含量以及总抗氧化能力(T-AOC)均低于矿区种。矿区海洲香薷更能耐受铜胁迫,已经形成了抗性生态型,且小分子抗氧化物质在抗性水平提高上起重要作用。     

枸杞液泡膜H^+-转运焦磷酸酶基因LbVP1克隆及表达分析北大核心CSCD

液泡膜H^+-转运焦磷酸酶在调节植物生长发育和逆境胁迫应答中发挥重要作用。本研究在已构建的枸杞本地数据库中先进行VP基因电子克隆,然后结合RT-PCR方法克隆到一个枸杞液泡膜H^+-转运焦磷酸酶编码基因LbVP1,并对其序列结构、时空表达模式进行了初步分析。LbVP1开放阅读框全长2301 bp,编码766氨基酸残基。多序列比对显示该基因与拟南芥AVP基因相似性达87.9%,序列结构生物信息学预测和亚细胞定位实验表明,该基因具有液泡膜H^+-转运焦磷酸酶的保守结构域和跨膜区,可能在液泡膜发挥作用。荧光定量PCR结果显示,LbVP1在花、叶和不同发育阶段果实中存在时空表达差异,干旱胁迫处理下叶片和果实中该基因表达量与对照存在(极)显著差异(P<0.01,P <0.05)。研究结果将为阐明该基因在枸杞抗旱分子调控机制中的作用提供基础理论依据。     

应用实时荧光定量PCR技术分析玉米水分胁迫诱导基因的表达模式

应用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)技术,研究了玉米中10个水分胁迫诱导基因的相对表达量及表达模式。结果表明,在花丝中,除基因Mads和Grp外,其他8个基因均随干旱胁迫程度加重,相对表达强度增加;在幼穗中,除基因Mads外,其他9个基因均随干旱胁迫程度加重,相对表达强度增加。应用实时荧光定量PCR和宏阵列技术的研究表明,在水分胁迫条件下,基因Arf3、Mads、Trx和F15相对表达量较高,可能在玉米应答水分胁迫过程起更重要的作用。     

实时荧光定量PCR技术及其在昆虫学研究中的应用

实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction, FQ-PCR)是一种利用荧光信号实时监测体外DNA分子PCR复制过程中每个循环的扩增产物,从而实现对DNA模板进行定量分析的技术,具有准确、快速、灵敏、特异等优点,在动植物基因工程、动植物检疫、微生物鉴定与分类、食品安全检测和医学等领域中得到广泛应用。本文对实时荧光定量PCR技术的原理、优缺点及近年来新的荧光探针的原理、类型进行了评述,并对实时荧光定量PCR技术在昆虫学研究中的应用进行了综述。     

小麦TaMAPK2基因的克隆及表达分析

该研究从小麦中克隆了1个MAPK基因TaMAPK2。序列分析表明,TaMAPK2基因的ORF为1 110bp,编码369个氨基酸。序列比对分析表明,该基因所编码的蛋白与粗山羊草、水稻、谷子等MAPK蛋白具有较高的一致性,分别为99%、94%、94%。进化树分析表明,TaMAPK2与水稻OsMAPK2的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析表明,该基因的表达显著受渗透胁迫、低温胁迫、高盐胁迫、乙烯和双氧水诱导,受ABA抑制。研究表明,TaMAPK2可能参与非生物逆境胁迫及相关信号分子应答。     

转基因大豆、玉米、油菜和水稻品系特异性检测质粒标准分子的快速构建及应用

本文采用重叠延伸PCR技术快速构建了转基因大豆GTS40-3-2、玉米NK603、油菜RT73和水稻TT51-1的4种品系作物的质粒标准分子.经快速PCR鉴定及测序分析验证后,将构建的阳性质粒标准分子应用于实时荧光定量PCR标准曲线的构建,并建立其相应的荧光定量PCR检测体系,同时对该体系的扩增效率、精确度、灵敏度等指标进行了评估. 结果显示,建立的实时荧光定量PCR检测体系中,目标序列的扩增效率均在97.434%~101.479%正常范围内（R2≥0.995）,定量极限为20 copies,表明我们已成功构建了这4种转基因作物的品系质粒标准分子,并能有效应用于实时荧光定量PCR标准曲线的构建.