ZNF230/荧光蛋白融合基因表达载体的构建及其在Cos细胞中的表达与定位

为了用绿色荧光蛋白标记观察人类无精症相关基因ZNF230在Cos7细胞中的蛋白质表达及定位,用PCR方法扩增得到突变的人和小鼠mt ZNF230和mt znf230基因,使其3′端的终止密码TGA突变为TGG,并装入T 载体,双酶切后通过定向克隆将其与真核表达载体pEGFP N1的绿色荧光蛋白(greenfluorescenceprotein,GFP)基因融合,构建了ZNF230—荧光蛋白融合基因表达载体。然后经真核表达质粒-脂质体介导,导入Cos7细胞系。荧光显微镜观察显示:在空白载体pEGFP N1转染的Cos细胞中荧光布满整个细胞,而在转染阳性载体pEGFP ZNF230和pEGFP znf230的Cos细胞中荧光主要聚集在细胞核中。表明转染的Cos细胞系能高效表达人ZNF230和小鼠znf230蛋白,ZNF230基因表达的蛋白定位于细胞核内。     

ZNF230/荧光蛋白融合基因表达载体的构建及其在Cos细胞中的表达与定位

为了用绿色荧光蛋白标记观察人类无精症相关基因ZNF230在Cos7细胞中的蛋白质表达及定位,用PCR方法扩增得到突变的人和小鼠mt-ZNF230和mt-znf230基因,使其3′端的终止密码TGA突变为TGG,并装入T-载体,双酶切后通过定向克隆将其与真核表达载体pEGFP-N1的绿色荧光蛋白（green fluorescence protein,GFP）基因融合,构建了ZNF230—荧光蛋白融合基因表达载体。然后经真核表达质粒－脂质体介导,导入Cos7细胞系。荧光显微镜观察显示：在空白载体pEGFP-N1转染的Cos细胞中荧光布满整个细胞,而在转染阳性载体pEGFP-ZNF230的Cos细胞中荧光主要聚集在细胞核中。表明转染的Cos细胞系能高效表达人ZNF230和小鼠znf230蛋白,ZNF基因表达的蛋白定位于细胞核内。Abstract: To use green fluorescent protein as a marker to studythe localization of the fusion protein, the mutant full length cDNAs of human ZNF230 and mouse znf230 with their stop codon TGA changed to TGG were obtained by PCR amplification., and then cloned into pGEM-Teasy vector. After the double enzyme cutting, the mutated human and mouse ZNF230(znf230) were inserted into mammalian expression plasmid pEGFP-N1.Thus we constructed the plasmid with fusion gene of ZNF230 and green fluorescent protein(GFP).Then the Cos cell was transfected with the fused gene by liposome. Fluorescence microscopy showed that green fluorescence protein expressed over the whole cell when transfected with vector pEGFP-N1.While after the transfection with pEGFP-ZNF230, the fluorescence located mainly on the nuclei of the cells. We demonstrated that the transfected Cos cell line can express human ZNF230 and mouse znf230 with high efficiency.When transfected with the constructed recombinant pEGFP-ZNF230 vector, the ZNF230 protein localizes mainly on the nucleus.     

小鼠脂联素与绿色荧光蛋白融合基因表达载体的构建及在COS-7细胞中的表达

以绿色荧光蛋白(GFP)基因(gfp)为报告基因,构建小鼠脂联素(mADPN)基因(mAd)与gfp的融合基因mAd/gfp表达载体pCI-neo-apoEHCR-hAATp-mAd-gfp,脂质体法转染体外培养的COS-7细胞,荧光显微镜观察GFP在细胞中的表达可间接反映mADPN的表达,并通过RT-PCR在核酸水平进一步确证mAd的表达.荧光显微镜观察及RT-PCR结果均证明mADPN在COS-7细胞中获得了高效表达,表明mADPN重组表达载体pCI-neo-apoEHCR-hAATp-mAd可以在真核细胞COS-7中高效表达mADPN,为进一步探讨mAd在小鼠体内的表达提供了可行性依据.     

SLP-2荧光表达载体的构建及其在乳腺癌细胞MCF-7中的表达与定位

人的SLP-2基因是一个新的肿瘤相关基因,它在多个癌组织里高表达,如食管鳞状细胞癌组织和肺癌组织。其中在乳腺癌组织的高表达和病人的存活率负相关,这说明该基因很可能在乳腺癌的发生中发挥重要作用。为了研究SLP-2基因在肿瘤里的功能,将人类SLP-2基因全长编码区定向连入pEGFP—C3质粒,使SLP-2蛋白可以与绿色荧光蛋白在乳腺癌细胞MCF-7内融合表达。而且细胞荧光实验发现SLP-2蛋白主要定位在MCF-7细胞的胞质内,这为进一步研究SLP-2基因在乳腺癌中的功能奠定了实验基础。     

SDF-1α基因与绿色荧光蛋白融合载体的构建及亚细胞定位

目的构建SDF-1α基因与绿色荧光蛋白的融合蛋白表达载体,进而观察SDF-1α基因编码蛋白在细胞内的定位情况。方法用EcoRI内切酶从pMD-T18一SDF-1α重组载体中酶切分离SDF-1α基因的完整ORF,构建pEGFP-C1-SDF-1α的融合表达载体,脂质体转染COS-7细胞,并在荧光显微镜下观察表达的融合蛋白。结果SDF-1α基因在COS-7细胞中高效表达,激光共聚焦的结果显示,SDF-1α基因定位在细胞质内。结论成功构建了pEGFP-C1-SDF-1α的融合表达载体,SDF-1α基因主要在细胞质中表达。     

慢病毒载体的构建及其介导的绿色荧光蛋白在胰岛β细胞中的表达

目的 获得能够在大鼠胰岛β细胞中高效表达的慢病毒载体。方法 以PCR的方法扩增绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）片段,并将其通过穿梭质粒装入pLenti6／V5表达质粒,然后用脂质体转染试剂将plenti6／V5 GFP、pLP1、pLP2以及pLP／VSVG转染入293FT细胞,获得的病毒用人纤维瘤细胞系的HTl080细胞进行滴定。然后用一定滴度的慢病毒转导大鼠胰岛β细胞系INS-1,观察转导效率。结果 通过限制性内切酶和琼脂糖凝胶电泳方法,观察到所克隆入pLenti6／V5表达质粒的GFP片段大小正好与PCR扩增出的片段一致。经测序验证,序列与NCBI网站上GFP序列完全一致。转染结果显示,经293FT细胞所产生的慢病毒,转导效率达到80％以上。而在1×10^6／ml病毒颗粒的情况下,AAV—GFP病毒几乎不能转导β细胞。结论 与同一滴度的AAV—GFP病毒相比,胰岛β细胞的转导效率有非常显著的差异。即慢病毒载体表达系统在对胰岛β细胞转导的能力上,明显优于重组腺辅病毒表达系统。表明慢病毒载体在糖尿病基因治疗中,特别是对胰岛β细胞的转基因工作中,有着良好的应用前景。     

Mpl与绿色荧光蛋白融合基因的真核载体构建及表达

目的:探索Mpl与绿色荧光蛋白GFP基因共同转粢哺乳动物细胞NIH3T3的方法.方法:采用PCR方法将GFP基因与Mpl基因构建融合荧光蛋白的真核表达载体,用脂质体介导转染NIH3T3细胞和筛选稳定细胞系,使用荧光显微镜方法和Westernblotting检测转染效果.结果:利用PCR方法有效扩增了Mpl基因,构建了融合荧光蛋白的真核表达载体,序列分析表明所构建的含Mpl基因的质粒与设计相同,使用荧光显微镜方法和Western blotting检测Mpl融合绿色荧光蛋白表达载体成功转染NIH3T3细胞.结论:成功构建了Mpl荧光表达载体,融合基因可以在NIH3T3细胞中稳定表达,为进一步研究Mpl的生物学活性及其与hNUDC蛋白相互作用提供了重要的理论依据.     

FXR1基因与增强型绿色荧光蛋白融合载体的构建及表达

目的:构建携带人脆性X相关基因1(Fragile X related gene 1,FXR1)与增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent pro-tein,EGFP)的融合表达载体并进行表达,为研究FXR1基因在脆性X综合征中的作用机制奠定基础.方法:以重组质粒pYESTrp3/FXR1为模板,PCR扩增FXR1基因,将扩增片段双酶切后连接到质粒pEGFP-N1中,形成重组表达载体pEGFP-N1/FXR1,并用脂质体法转染人胚肾细胞,荧光显微镜下观察GFP在细胞内的表达及Western Blotting检测FXR1的表达情况.结果:成功构建融合表达载体pEGFP-N1/FXR1,在人胚肾细胞实现表达,检测到融合蛋白EGFP/FXR1.结论:本实验成功构建EFGP和FXR1重组共表达载体并可在真核细胞中表达,为进一步研究FXR1在脆性X综合征中的作用机理奠定基础.     

His-FemA融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

目的 构建His标签的金黄色葡萄球菌甲氧西林耐药相关蛋白FemA的融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌中表达,为进一步研究femA基因的生物学功能和临床应用奠定基础.方法 根据GenBank中金黄色葡萄球菌femA基因序列,利用Primer Premier 5.0设计PCR引物,并在引物的5'加入BamHI及SalI酶切位点;以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模版,PCR扩增出femA基因片段.将目的DNA片段及质粒pQE30分别进行双酶切、连接并转化大肠埃希菌DH5α;阳性克隆以PCR、双酶切及测序进行鉴定.将鉴定正确的pQE30-femA重组质粒转化大肠埃希菌JM109,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达His-femA融合蛋白;采用SDS-PAGE及Western blot分析对表达蛋白进行验证.结果 经PCR、双酶切签定及序列测定,证实重组质粒pQE30-femA构建成功;重组质粒pQE30-femA转化大肠埃希菌JM109经IPTG诱导后,SDS-PAGE和Western blot分析显示表达出53 kD目的蛋白;经Bandscan软件分析,目的蛋白质在4h的表达量占细胞总蛋白的27.5％.结论 成功构建了His-FemA原核表达载体(pQE30-femA),并在大肠埃希菌中高效表达.     

In-Fusion 技术构建Ⅰ型钠通道与绿色荧光蛋白融合表达及其突变载体

目的：构建Ⅰ型钠通道(Nav1.1)与绿色荧光蛋白（GFP）融合表达载体及其突变载体。方法：利用In-Fusion 技术将SCN1A 基 因亚克隆到绿色荧光蛋白真核细胞融合表达载体（pAcGFP1-C In-Fusion Ready Linear Vector）。PCR 扩增SCN1A 基因（与线性载 体对应两端有15 个相同碱基）,In-Fusion 技术进行融合即得到pCMV-GFP-C-SCN1A。将其转染HEK293T 细胞,Western blot 检 测Nav1.1 的表达。定点诱变试剂盒对其进行定点诱变。结果：1.成功构建Nav1.1 与GFP 融合表达载体pCMV-GFP-C-SCN1A;2. DNA 测序表明：在预期位点已经发生突变,SCN1A 基因第190 位色氨酸密码子(TGG)突变为终止密码子(TGA)。结论：Nav1.1 与 GFP 融合表达载体及其突变载体的构建成功,为进一步研究该突变位点导致Nav1.1 功能的改变奠定了基础。     

凝血因子Ⅶ基因表达载体的构建及其在BHK细胞中的表达

凝血因子Ⅶ是凝血块形成的起始关键分子之一,它对外源性凝血途径的启动具有重要的作用.为表达具有促凝活性的重组人凝血因子Ⅶ,通过PCR的方法从质粒pUC-FⅦ中扩增人凝血因子ⅦcDNA,并将其定向克隆入真核表达载体pIRESneo中,构建重组表达载体pIRES-FⅦ,测序正确后用脂质体介导的方法转染BHK-21细胞,经G418加压筛选、细胞有限稀释等方法获得克隆细胞株,收集无血清培养上清,进行SDS-PAGE、Westem blot和活性鉴定.结果成功构建了重组表达载体pIRES-FⅦ,实现了其在BHK-21细胞中的表达,且表达产物具有促凝活性.重组人凝血因子Ⅶ在哺乳动物细胞中的成功表达,为整体止血剂的研究奠定了基础.     

凝血因子VII基因表达载体的构建及其在BHK细胞中的表达

凝血因子Ⅶ是凝血块形成的起始关键分子之一,它对外源性凝血途径的启动具有重要的作用。为表达具有促凝活性的重组人凝血因子Ⅶ,通过PCR的方法从质粒pUC-FⅦ中扩增人凝血因子ⅦcDNA,并将其定向克隆入真核表达载体pIRESneo中,构建重组表达载体pIRES-FⅦ,测序正确后用脂质体介导的方法转染BHK-21细胞,经G418加压筛选、细胞有限稀释等方法获得克隆细胞株,收集无皿清培养上清,进行SDS-PAGE、Western blot和活性鉴定。结果成功构建了重组表达载体pIRES-FⅦ,实现了其在BHK-21细胞中的表达,且表达产物具有促凝活性。重组人凝血因子Ⅶ在哺乳动物细胞中的成功表达,为整体止血剂的研究奠定了基础。     

绿色荧光蛋白标记的表达载体pHis-EGFP的构建

为对重组蛋白的表达进行直观检测并简化蛋白纯化的步骤,构建了能在大肠杆菌中表达融合蛋白的通用表达载体pHis-EGFP。该载体含有源自表达载体pET-32a的T7启动子、终止子和源自质粒pUC18的ColE1复制子与绿色荧光蛋白报告基因。应用该载体成功地表达并纯化了酵母GGDP(geranylgeranyldiphosphate,GGDP)合酶融合蛋白,结果表明所构建的载体是一个实用的表达载体,并建立了离子交换层析和亲和层析两步纯化融合蛋白的方法。     

抗菌肽CM4与绿色荧光蛋白融合基因的真核载体构建及表达

目的：构建绿色荧光蛋白（GFP）与抗菌肽CM4融合基因的真核表达载体。方法：采用递归PCR（rPCR）将GFP基因与CM4基因通过一段核苷酸片段连接成GFP-CM4融合基因,构建真核表达载体pcDNA3-GFP-CM4,用脂质体介导转染人K562白血病细胞,用MTT检测其活性。结果：融合基因可在K562细胞中表达,抗菌肽CM4的表达可抑制K562细胞的生长。结论：为全面了解抗菌肽的生物学活性及其在基因治疗中的可能作用提供了重要的理论依据。     

板栗疫病菌绿色荧光与红色荧光蛋白共定位载体的构建

低毒病毒-板栗疫病菌组合是研究病毒与宿主相互作用的一个优秀的模式系统.我们构建了含绿色荧光蛋白基因gfp的载体pCPXHY2GFP与含红色荧光蛋白基因rfp的载体pCPXG418RFP,并用于转化野生型菌株EP155,获得了以潮霉素为筛选标记、表达绿色荧光蛋白的转化株pCPXHY2GFP/EP155和以G418为筛选标记、表达红色荧光蛋白的转化株pCPXG418RFP/EP155.将载体pCPXG418RFP转化pCPXHY2GFP/EP155,获得的转化株能观察到绿色荧光蛋白与红色荧光蛋白共定位的现象.板栗疫病菌绿色荧光与红色荧光共定位载体pCPXHY2GFP与pCPXG418RFP的构建,为深入研究病毒与宿主相互作用的分子机制提供了强有力的研究材料.     

绿色荧光蛋白基因TuMv病毒表达载体的构建

本研究通过设计引物进行PCR扩增得到绿色荧光蛋白GFP基因,将PCR产物酶切以后与芜菁花叶病毒表达载体相连,得到的阳性克隆通过多对引物组合进行PCR验证及序列测定,说明GFP基因已经连接到该病毒表达载体中,而且没有发生碱基误配及错配。该GFP表达载体的构建为进一步利用TuMv的全长cDNA侵染性克隆进行外源基因的转化奠定了基础。     

绿色荧光蛋白在草鱼肾细胞中的表达

应用阳离子脂质体介导法,将含绿色荧光蛋白（GFP）基因的质粒pEGFP-N1转染到培养成单层的草鱼肾细胞（CIK）中,通过荧光倒置显微镜和特异性RT-PCR方法检测GFP的表达.在荧光倒置显微镜下可见CIK细胞的胞质和胞核均呈现绿色荧光,且细胞核的绿色荧光强度强于细胞质.转染细胞中的转录产物经RT-PCR扩增后,凝胶电泳鉴定出与GFP基因片段分子量大小一致的条带,经测序证明其为GFP基因序列.结果表明,GFP基因可以在草鱼CIK细胞内高效率成功表达,为构建以GFP为报告基因的真核重组质粒及研究草鱼出血病DNA疫苗奠定了重要的基础.     

含有绿色荧光蛋白基因的质粒载体的构建及其在水稻白叶枯细菌中的表达

本文用绿色荧光蛋白基因（green fluorescent protein）标记水稻白叶枯细菌,观察其在白叶枯细菌中的表达情况。光激发后,白叶枯细菌发出绿色荧光,表明gfp在白叶枯细菌中得到了高效表达。后续工作意在利用gfp所发出的绿色荧光,来追踪白叶枯细菌侵染水稻的路径,以及检测水稻在遭受白叶枯病害时的一些生理生态变化,进一步探讨水稻对白叶枯细菌的抗生机理,希望能够为水稻抗性品种的检测提供新的理论依据。文中重点介绍了对质粒pM2464的改造过程,经gfp标记后的水稻白叶枯细菌,在紫外或蓝光的激发下,发出绿色荧光,证明了用标记有gfp基因的白叶枯细菌来观察其侵染水稻过程的想法是可行的。     

绿色荧光蛋白与人肾脏NaDC3融合基因的构建及其在肾小管上皮细胞中的定位

本采用RT-PCR方法从人的正常肾组织中扩增出hNaDC3基因全长cDNA序列,采用基因重组技术将hNaDC3基因和绿色荧光蛋白基因融合,通过真核表达质粒—脂质体介导,导入LLC-PKl细胞系,激光共聚焦显微镜动态观察GFP—hNaDC3的定位情况。结果显示PKGFP-C3空白质粒转染的LLC—PKl细胞表达了GFP,GFP在胞内分布以核浆为主,呈均匀致密的细颗粒荧光,胞核染色强,核仁荧光稀少,界线清楚。而pKGFP-C3-hNaDC3转染细胞株的绿色荧光蛋白,转染后第1天混合分布于细胞浆和细胞膜,以粗颗粒荧光为主,两界限不清楚,胞浆中可见未染色的圆形空洞,未见胞核染色;第3天主要聚集于细胞膜,核周的胞浆中可见粗颗粒荧光物质,胞浆和胞膜界线清楚,胞核亦未见绿色荧光蛋白;第5天清晰聚集于细胞膜,细胞膜连接至网状。因此hNaDC3蛋白在细胞质中生成后,定位于细胞膜并稳定表达。     

绿色荧光蛋白基因在昆虫细胞中的克隆与表达

将绿色荧光蛋白(GFP)基因亚克隆到转移载体pVLneo的多角体蛋白基因(ocu)启动子下游,与杆状病素AcNPV DNA共转染昆虫细胞,通过同源重组和G418筛选,构建了整合有GFP基因的重组病毒。在昆虫细胞中表达的GFP,MW为30kDa,在荧光显微镜下呈现美丽的绿色,荧光光谱表明其激发波长395nm,发射波长509nm。Southern blot杂交证明,重组病毒的1kb EcoRI片段与GFP cDNA探针有很强的杂交信号,这是GFP基因在杆状病毒基因组中整合的直接证据。