过表达NADH激酶基因对酿酒酵母乙醇发酵的影响

甘油是酿酒酵母乙醇代谢途径中的主要副产物,降低甘油生成,可以提高乙醇的产率和原料的利用率。以工业酒精酵母单倍体S1(MATa)为研究对象,构建了一个4.5 kb左右的基因敲除突变盒gpd2Δ::PGK1PT-POS5-HyBR,利用醋酸锂转化法转入S1,得到重组菌S3(gpd2Δ::PGK1PT-POS5-HyBR),使得工业酒精酵母在敲除GPD2的同时整合过表达了NADH激酶基因POS5。结果表明,在150 g/L的葡萄糖摇瓶发酵实验中,重组菌S3在不影响菌株生理特性的条件下,乙醇得率(g ethanol/g glucose)比原始菌株S1提高了8%,甘油得率(g glycerol/g glucose)降低了33.64%。本研究证明过表达NADH激酶基因可降低乙醇发酵中副产物甘油的生成并提高乙醇得率。     

gTME构建共发酵木糖和葡萄糖的重组酿酒酵母

利用全转录工程（gTME）方法将全局转录因子spt15随机突变并克隆表达, 构建突变库。将突变基因连接到表达载体 pYX212上, 醋酸锂法转化入不利用木糖的酿酒酵母YPH499中, 经特定的培养基初筛获得高效利用木糖并共发酵木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组菌株。对获得的重组菌株进行了初步研究, 该菌株能够很好的利用木糖并共发酵木糖和葡萄糖。在30oC, 200 r/min, 发酵96 h时, 50 g/L木糖和葡萄糖的利用率为94.0%和98.9%, 乙醇产率为32.4%和31.6%, 原始菌株乙醇产率为44.3%; 当木糖和葡萄糖以质量比1:1混合发酵时, 木糖和葡萄糖利用率分别为91.7%和85.9%, 乙醇产率为26%。木糖醇的含量极低。     

gTME构建共发酵木糖和葡萄糖的重组酿酒酵母

利用全转录工程（gTME）方法将全局转录因子spt15随机突变并克隆表达, 构建突变库。将突变基因连接到表达载体 pYX212上, 醋酸锂法转化入不利用木糖的酿酒酵母YPH499中, 经特定的培养基初筛获得高效利用木糖并共发酵木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组菌株。对获得的重组菌株进行了初步研究, 该菌株能够很好的利用木糖并共发酵木糖和葡萄糖。在30oC, 200 r/min, 发酵96 h时, 50 g/L木糖和葡萄糖的利用率为94.0%和98.9%, 乙醇产率为32.4%和31.6%, 原始菌株乙醇产率为44.3%; 当木糖和葡萄糖以质量比1:1混合发酵时, 木糖和葡萄糖利用率分别为91.7%和85.9%, 乙醇产率为26%。木糖醇的含量极低。     

酿酒酵母Mbp1缺陷型菌株的构建及其乙醇发酵特性

【目的】研究酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工业菌株Mbp1基因的功能,探讨Mbp1基因对酿酒酵母乙醇发酵性能的影响。【方法】以酿酒酵母MF1015为出发菌株,用PCR方法构建Mbp1基因敲除组件Loxp-KanMX-Loxp,将敲除组件转化两种配型的酿酒酵母单倍体,通过单倍体复倍获得敲除Mbp1基因的二倍体突变菌株,研究突变菌株形态变化及乙醇发酵特性。【结果】敲除Mbp1基因后突变菌株生长曲线无显著变化,出芽率降低,细胞体积增大19.2%,对饥饿更敏感,较早出现假菌丝。甘蔗糖蜜在静置条件下发酵,突变菌株的乙醇产量明显低于野生型;在130 r/min的条件下发酵,突变菌株和野生型发酵液中的乙醇产量基本相同。【结论】Mbp1基因缺失使酿酒酵母的乙醇发酵能力下降并影响细胞的形态分化。     

酿酒酵母adh2和ald6双基因缺失突变株的构建

酿酒酵母乙醇合成代谢过程中, 阻断或削弱乙醛至乙酸代谢流不但能增强乙醇合成流, 同时还能降低发酵乙酸含量。本研究以乙醇脱氢酶Ⅱ(adh2)基因缺陷型酿酒酵母YS2-Dadh2为出发菌株, 应用长侧翼同源两步PCR(LFH-PCR)策略构建乙醛脱氢酶Ⅵ(ald6)基因敲除组件, 转化酿酒酵母YS2-Dadh2敲除ald6基因, 之后转入表达质粒pSH65到阳性克隆中, 半乳糖诱导表达Cre重组酶切除Kanr基因筛选标记, 最后, 传代丢失质粒pSH65获得单倍体ald6基因缺失突变株。利用同样的敲除组件和技术再次敲除其等位基因, 最终获得双基因缺失突变株YS2-△adh2-Dald6。发酵实验表明与出发菌株YS2相比, 突变株乙酸合成量降低18%, 乙醇最高产量提高12.5%。     

敲除MIG1和SNF1基因对酿酒酵母共利用葡萄糖和木糖的影响

Mig1和Snf1是酿酒酵母葡萄糖阻遏效应的两个关键调控因子。为了提高酿酒酵母工程菌同时利用葡萄糖和木糖的能力,分别对MIG1和SNF1基因进行了单敲除和双敲除,并通过摇瓶发酵实验和RNA-Seq转录组分析,初步揭示了Mig1和Snf1可能影响葡萄糖和木糖共利用表达差异基因的层级调控机制。研究结果表明,MIG1单敲除对混合糖的共利用影响不大;SNF1单敲除会加快混合糖中木糖的利用而且葡萄糖和木糖可以被同时利用,这可能归因于SNF1单敲除会解除对一些氮分解代谢阻遏基因表达的抑制,从而促进了细胞对氮源营养的利用;进一步敲除MIG1,会解除更多氮分解代谢阻遏基因表达的抑制,以及一些碳中心代谢途径基因表达上调。虽然MIG1和SNF1双敲除菌株利用葡萄糖加快而利用木糖变慢,但是葡萄糖和木糖可以被同时利用,进而加快乙醇的积累。综上所述,MIG1和SNF1的敲除导致氮分解阻遏基因表达上调,有助于促进葡萄糖和木糖的共利用;解析Mig1和Snf1对氮分解阻遏基因的层级调控作用,为进一步提高葡萄糖和木糖的共利用提供新的靶点。     

spt15突变基因对酿酒酵母木糖利用的影响

利用基因工程手段得到重组菌YPH499-3中的spt15有效突变基因,通过表达载体pYX212转化入酿酒酵母原始菌株YPH499中,重新获得酿酒酵母重组菌株。对其性状进行研究,结果表明该菌株能有效利用木糖并共发酵木糖和葡萄糖。在30oC、200r/min,发酵72h时,50g/L木糖的利用率为82.0%,乙醇产率为28.4%;当木糖和葡萄糖以质量比1:1混合发酵时,木糖和葡萄糖的利用率分别为80.4%和100%,乙醇产率为31.4%;同时发现木糖醇的含量极低。从而验证了有效突变基因spt15-10对酿酒酵母共发酵木糖和葡萄糖产酒精的影响。     

木糖异构酶在酿酒酵母表面表达及对木糖代谢影响的初步研究

利用α-型酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表面展示系统的载体,将来源于嗜热细菌Thermus thermophilus的木糖异构酶基因xylA,插入到酿酒酵母蔗糖酶信号肽序列与α-凝集素的C端编码序列之间,形成融合表达框,构建重组质粒pSY-xy222,转化酿酒酵母H158。含重组质粒的菌株H158-SXI木糖异构酶活性测定表明,细胞壁上酶活测定值为1.53 U,木糖异构酶在酿酒酵母细胞壁上得到活性表达。木糖葡萄糖共发酵结果显示,重组菌株木糖利用率较出发菌株提高了17.8%。     

ack基因敲除对Thermoanaerobacterium calidifontis Rx1发酵代谢的影响

为提高嗜热厌氧菌T.calidifontis Rx1的乙醇产率,通过同源重组的方式敲除Rx1乙酸生成途径的乙酸激酶(ack)基因,得到了代谢工程菌Δack突变株。分别以葡萄糖、纤维二糖、木糖和玉米芯酸水解液为底物,研究突变菌株的底物利用、细胞生长和发酵产物的变化情况。结果表明,与野生菌株相比,突变菌株的干重都有所降低,但是乳酸或乙醇的得率显著提高;当以纤维二糖为底物时,突变菌株的乙醇产量达3.60g/L,得率为0.55g/g,远高于突变菌株对其它底物的产量;以玉米芯水解液为底物时,突变菌株的乳酸产量高于野生菌株,而且野生菌乳酸、乙醇的产量都高于以木糖为底物时的产量。     

大肠杆菌乙醇工程菌mglB基因的敲除对混合糖发酵木糖利用效率的影响

为明晰葡萄糖非PTS转运系统相关基因对木糖利用效率的影响,探讨葡萄糖PTS和非PTS转运系统是否对木糖利用存在协同影响,以大肠杆菌工程菌SZ470和SZ470P为出发菌株,通过RED同源重组技术敲除葡萄糖转运基因mglB,构建mglB单缺陷菌SZ470M和ptsG/mglB双缺陷菌SZ470PM。比较四株菌的混合糖(3%葡萄糖+2%木糖)发酵情况以及木糖转运代谢相关基因的转录水平。实验结果表明,SZ470M相较于出发菌株SZ470,其发酵性能无明显变化;SZ470PM的木糖消耗速度为0.37 g/L,乙醇产量为23.25 g/L,转化率为82.6%,相比于出发菌株SZ470P分别提高了32%,9.8%和5.8%。基因转录水平的分析也表明菌株SZ470P和SZ470PM的木糖转运与代谢基因的转录水平上调。综上,ptsG和mglB基因的双敲除对木糖利用效率的提高有协同影响,为促进木质纤维素作为发酵原料时木糖的高效利用提供理论依据。     

一种基因工程改造的NADH高亲和力木糖还原酶突变基因可促进酿酒酵母发酵木糖生成乙醇

在导入表达毕赤酵母(Pichia stipitis)木糖还原酶(xylose reductase,XR)和木糖醇脱氢酶(xylitol dehydrogenase,XDH)基因的重组酿酒酵母中,木糖还原酶活性主要依赖辅酶NADPH,木糖醇脱氢酶活性依赖辅酶 NAD+,两者的辅助因子不同导致细胞内电子氧化还原的不平衡,是造成木糖醇积累,影响木糖代谢和乙醇产量的主要原因之一.将经过基因工程改造获得的NADH高亲和力的木糖还原酶突变基因m1,与毕赤酵母木糖醇脱氢酶(PsXDH)基因xyl2共转染酿酒酵母AH109,以转染毕赤酵母木糖还原酶(PsXR)基因xyl1和xyl2重组质粒的酵母细胞为对照菌株,在SC/-Leu/-Trp营养缺陷型培养基中进行筛选,获得的阳性转化子分别命名为AH-M-XDH和AH-XR-XDH.重组酵母在限制氧通气条件下对木糖和葡萄糖进行共发酵摇瓶培养,HPLC检测发酵底物的消耗和代谢产物的产出情况.结果显示,与对照菌株AH-XR-XDH相比,AH-M-XDH的木糖利用率明显提高,乙醇得率增加了16%,木糖醇产生下降了41.4%.结果证实,通过基因工程改造的木糖代谢关键酶,可用于酿酒酵母发酵木糖生产乙醇,其能通过改善酿酒酵母细胞内氧化还原失衡的问题,提高木糖利用率和乙醇产率.     

酿酒酵母蔗糖关键代谢途径suc2基因的敲除及其蔗糖代谢特性的变化分析

蔗糖基生物质是热带和亚热带地区重要的生物质材料,因而在微生物发酵和微生物代谢原料中具有重要的地位。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)具有以蔗糖为原料进行代谢的能力,在酿酒酵母的基因组中蔗糖水解酶基因共有6个结构基因。本研究以酿酒酵母INVSC1为出发菌株,首先利用基因敲除技术构建suc2基因缺失菌株,然后将suc2基因回补,从而研究suc2基因对酿酒酵母蔗糖关键代谢途径及蔗糖代谢特性的影响。以蔗糖为碳源的发酵培养基中,在静置条件下发酵,suc2基因缺失菌株失去了利用蔗糖代谢的能力,回补菌株则恢复了对蔗糖的代谢;而且回补菌株对蔗糖的利用率及乙醇产量均比出发菌株有所提高。suc2基因是酿酒酵母蔗糖代谢的关键基因,对蔗糖的代谢具有决定性作用,可以作为蔗糖代谢途径改造的一个关键点。     

基于木糖异构酶途径的木糖发酵酿酒酵母菌株构建研究进展

通过异源表达木糖代谢途径,构建能高效发酵木糖产乙醇的工业酿酒酵母菌株,对木质纤维素燃料乙醇的开发具有重要意义。与氧化还原途径相比,木糖异构化途径的表达不会因辅酶不平衡而造成中间产物木糖醇的累积,因此被视为是理想的木糖代谢途径。在木糖异构途径的表达过程中,选择工业酿酒酵母作为出发菌株进行木糖异构酶途径的表达具有突出优势。同时,提高木糖异构酶基因xyl A的表达效率对木糖异构菌株的构建至关重要。另外,在对XI菌株进行代谢工程改造时,GRE3的敲除、木糖转运的提升、木糖代谢途径的定向改造等均能有效改善菌株发酵木糖产乙醇的能力。除此之外,进化工程也是提升XI菌株木糖发酵效率的重要方法之一。而在相关机理阐释和改造策略的制定过程中,组学技术已显示出强大的功能。综述了近年来木糖异构酶途径在酿酒酵母中的表达研究进展,同时还对相关研究存在的问题进行了分析。     

大肠杆菌工程菌ptsG基因敲除及其缺陷株混合糖同型乙醇发酵

为实现可同时利用木糖和葡萄糖进行生产发酵,以产乙醇的大肠杆菌工程菌SZ470为出发菌株(△pflB,△frdABCD,△ackA,△ldhA),采用同源重组技术,敲除葡萄糖转运基因ptsG,以构建不受葡萄糖抑制效应影响的菌株SZ470P.SZ470P在5％混合糖(2.5％木糖和2.5％葡萄糖)培养基中能同时利用葡萄糖和木糖进行发酵,葡萄糖消耗量是13 g/L,为对照菌株SZ470的一半;木糖消耗量是20 g/L,是SZ470的3.8倍;乙醇的最高产量为15.01 g/L,转化率为89.13％,比SZ470提高了14.32％.结果表明,工程菌SZ470P可同时利用葡萄糖和木糖发酵生产高产量的乙醇.     

酿酒酵母工业菌株中XI木糖代谢途径的建立

根据代谢工程原理,采取多拷贝整合策略,利用整合载体pYMIKP,将来自嗜热细菌Thermusthermophilus的木糖异构酶(XI)基因xylA和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)自身的木酮糖激酶(XK)基因XKS1,插入酿酒酵母工业菌株NAN-27的染色体中,得到工程菌株NAN-114。酶活测定结果显示,NAN-114中XI和XK的活性均高于出发菌株NAN-27,表明外源蛋白在酿酒酵母工业菌株中得到活性表达。对木糖、葡萄糖共发酵摇瓶实验结果表明,工程菌NAN-114消耗木糖4.6g/L,产生乙醇6.9g/L,较出发菌株分别提高了43.8%和9.5%。首次在酿酒酵母工业菌株中建立了XI路径的木糖代谢途径。     

混合糖发酵重组酿酒酵母的菌株构建和菊芋秸秆同步糖化发酵研究

【目的】构建可用于纤维素乙醇高效生产的混合糖发酵重组酿酒酵母菌株,并利用菊芋秸秆为原料进行乙醇发酵。【方法】筛选在木糖中生长较好的酿酒酵母YB-2625作为宿主菌,构建木糖共代谢菌株YB-2625 CCX。进一步通过r DNA位点多拷贝整合的方式,以YB-2625 CCX为出发菌株构建木糖脱氢酶过表达菌株,并筛选得到优势菌株YB-73。采用同步糖化发酵策略研究YB-73的菊芋秸秆发酵性能。【结果】YB-73菌株以90 g/L葡萄糖和30 g/L木糖为碳源进行混合糖发酵,乙醇产量比出发菌株YB-2625 CCX提高了13.9%,副产物木糖醇产率由0.89 g/g降低至0.31 g/g,下降了64.6%。利用重组菌YB-73对菊芋秸秆进行同步糖化发酵,48 h最高乙醇浓度达到6.10%(体积比)。【结论】通过转入木糖代谢途径以及r DNA位点多拷贝整合过表达木糖脱氢酶基因可有效提高菌株木糖发酵性能,并用于菊芋秸秆的纤维素乙醇生产。这是首次报道利用重组酿酒酵母进行菊芋秸秆原料的纤维素乙醇发酵。     

定向进化Rho1提高酿酒酵母的乙醇耐受性和超高浓度乙醇发酵性能

燃料乙醇发酵过程中酿酒酵母细胞活性被高浓度乙醇严重抑制而导致发酵提前终止，生产强度严重降低，因此构建同时具有高耐受性、高发酵性能的菌株一直是发酵工业追求的目标。选取酿酒酵母细胞形态调节关键基因小GTP酶家族成员Rho1,构建易错PCR产物文库，以酿酒酵母S288c为出发菌株采取“富集-自然生长-复筛”的筛选策略，成功筛选得到两株乙醇胁迫耐受性与发酵性能均提高的突变株M2和M5。测序发现突变株过表达的Rho1序列出现了3～5个氨基酸的突变和大片段的缺失突变。以300 g/L起始葡萄糖进行乙醇发酵，72 h时，M2和M5的乙醇滴度比对照菌株分别提高了19.4%和22.3%,超高浓度乙醇发酵能力显著提高。本研究为利用蛋白定向进化方法改良酵母菌复杂表型提供了新的作用靶点。     

酿酒酵母SNF4基因敲除缺失菌株的构建

构建一株酿酒酵母SNF4基因缺失菌株并研究其对乙醇产量的影响。扩增带有SNF4基因上下游同源序列和Kanr筛选标记的SNF4基因敲除组件,转化到酿酒酵母YS2获得阳性克隆子,然后将质粒pSH65转到阳性克隆子中,半乳糖诱导pSH65表达Cre酶切除Kanr筛选标记,获得SNF4等位基因完全缺失菌株YS2-△SNF4。发酵实验结果表明,缺失菌株YS2-△SNF4乙醇产量较出发菌株提高了7.57％。利用Cre-LoxP系统,成功构建了SNF4等位基因完全缺失菌株并提高乙醇产生量。     

利用SPT3的定向进化提高工业酿酒酵母乙醇耐受性

利用对转录因子的定向进化可对多基因控制的性状进行有效的代谢工程改造。本研究对酿酒酵母负责胁迫相关基因转录的SAGA复合体成分SPT3编码基因进行易错PCR随机突变,并研究了SPT3的定向进化对酿酒酵母乙醇耐性的影响。将SPT3的易错PCR产物连接改造的pYES2.0表达载体并转化酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae4126,构建了突变体文库。通过筛选在高浓度乙醇中耐受性提高的突变株,获得了一株在10%(V/V)乙醇中生长较好的突变株M25。该突变株利用125g/L的葡萄糖进行乙醇发酵时,终点乙醇产量比对照菌株提高了11.7%。由此表明,SPT3是对酿酒酵母乙醇耐性进行代谢工程改造的一个重要的转录因子。     

可同化阿拉伯糖的木糖还原酿酒酵母菌株构建

[目的] 以秸秆等木质纤维素类生物质为原料生产液体生物燃料乙醇,目前生产成本高,大规模工业化生产尚有较大难度。构建能同化阿拉伯糖进行木糖还原生产木糖醇的重组酿酒酵母菌株,以实现原料中全糖利用、生产高附加值产品,实现产品多元化。[方法] 首先,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术依次向出发菌株中导入阿拉伯糖代谢途径和木糖还原酶基因,使菌株获得代谢阿拉伯糖和将木糖转化为木糖醇的能力;其次,通过适应性驯化的进化工程手段,提高重组菌株对阿拉伯糖的利用效率;最后,通过混合糖发酵验证重组菌株利用阿拉伯糖和还原木糖产木糖醇的能力。[结果] 通过导入植物乳杆菌的阿拉伯糖代谢途径,酿酒酵母菌株获得了较好的利用阿拉伯糖生长繁殖的能力;进一步导入假丝酵母的木糖还原酶基因后,重组菌株在葡萄糖作为辅助碳源条件下可高效还原木糖产木糖醇,但阿拉伯糖的利用能力下降。利用以阿拉伯糖为唯一碳源的培养基进行反复批次驯化,阿拉伯糖的利用能力得以恢复和提升,得到表型较好的重组菌株KAX3-2。该菌株在木糖（50 g/L）和阿拉伯糖（20 g/L）混合糖发酵条件下发酵72 h时,对阿拉伯糖和木糖利用率分别达到42.1%和65.9%,木糖醇的收率为64%。[结论] 本研究成功构建了一株能有效利用阿拉伯糖并能将木糖转化为木糖醇的重组酿酒酵母菌株KAX3-2,为后续构建、获得阿拉伯糖代谢能力更强、木糖醇积累效率更高菌株的工作奠定了基础。