大鼠Bdnf基因慢病毒载体的构建及其在骨髓间质干细胞中的表达

骨髓间质干细胞(MSCs)是目前基因工程正在探讨应用的靶细胞,为构建带有脑源性神经营养因子(Bdnf)基因慢病毒载体并使其在大鼠骨髓间质干细胞中表达,采用RT-PCR技术获得大鼠Bdnf基因编码区(CDS)片段,限制性内切酶酶切和基因重组构建慢病毒载体质粒PNL-BDNF-IRES2-EGFP,在脂质体介导下与包装质粒HELPER,包膜质粒VSVG共转染293T细胞包装生产慢病毒。所获慢病毒感染大鼠MSCs(rMSCs)后,PCR和免疫细胞化学法检测在rMSCs中Bdnf基因的插入和表达。结果显示所获的Bdnf基因经测序后与GenBank报道序列完全一致。重组慢病毒载体质粒PNL-BDNF-IRES2-EGFP经鉴定正确。三质粒共转染293T细胞成功,收集、浓缩病毒后测定其滴度为6.7×10~7TU/mL,PCR证实Bdnf基因插入病毒基因组。感染rMSCs后RT-PCR、免疫细胞化学染色及Western检测各组细胞均有BDNF蛋白表达,其中试验组BDNF-rMSCs更大量表达BDNF,与其余2组(Mock-rMSCs、rMSCs)比较差异具有统计学意义。构建带有Bdnf基因慢病毒载体并在大鼠骨髓间质干细胞中成功表达,为今后基因修饰干细胞的移植后长期观察研究奠定了基础。     

LMP-1单链抗体基因修饰人外周血单个核细胞的构建及鉴定

目的:构建携带抗-1型潜伏膜蛋白(anti-LMP-1)的单链抗体序列的过表达载体并包装慢病毒,构建及鉴定LMP-1单链抗体基因修饰的人外周血单个核细胞(PBMCs)。方法:根据Gen Bank中LMP-1单链抗体、CD28及CD3ζ序列设计引物并合成,从已有pVitro-IgG-1载体钓取IgG-1-Fc段,并分别插入慢病毒表达载体,获得p CDH-anti-LMP-1-IgG-Fc-CD28-CD3ζ(CAR)及pCDH-CD28-CD3ζ(对照VEC)并测序鉴定,测序成功后采用三质粒包装系统(核心质粒pCDH、包装质粒pSPAX2和pMD2.G)分别包装慢病毒CAR及VEC;浓缩慢病毒并离心感染PBMCs,经荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,并利用流式细胞术检测GFP+比率以鉴定目的蛋白的表达。结果:构建了过表达LMP-1单链抗体基因的质粒并成功包装慢病毒,浓缩慢病毒感染PBMCs后GFP+细胞数可达42.5%(VEC-PBMCs)及51.0%(CAR-PBMCs)。结论:为进一步研究anti-LMP-1修饰的PBMCs对LMP-1阳性肿瘤细胞的靶向杀伤奠定了实验基础。     

大鼠Bdnf基因慢病毒载体的构建及其在骨髓间质干细胞中的表达

骨髓间质干细胞（MSCs）是目前基因工程正在探讨应用的靶细胞,为构建带有脑源性神经营养因子（Bdnf）基因慢病毒载体并使其在大鼠骨髓间质干细胞中表达,采用RT-PCR技术获得大鼠Bdnf基因编码区（CDS）片段,限制性内切酶酶切和基因重组构建慢病毒载体质粒PNL-BDNF-IRES₂-EGFP,在脂质体介导下与包装质粒HELPER,包膜质粒VSVG共转染293T细胞包装生产慢病毒。所获慢病毒感染大鼠MSCs（rMSCs）后,PCR和免疫细胞化学法检测在rMSCs中Bdnf基因的插入和表达。结果显示所获的Bdnf基因经测序后与GenBank报道序列完全一致。重组慢病毒载体质粒PNL-BDNF-IRES2-EGFP经鉴定正确。三质粒共转染293T细胞成功,收集、浓缩病毒后测定其滴度为6.7×10⁷TU/mL, PCR证实Bdnf基因插入病毒基因组。感染rMSCs后RT-PCR、免疫细胞化学染色及Western检测各组细胞均有BDNF蛋白表达,其中试验组BDNF-rMSCs更大量表达BDNF,与其余2组(Mock-rMSCs、rMSCs)比较差异具有统计学意义。构建带有Bdnf基因慢病毒载体并在大鼠骨髓间质干细胞中成功表达,为今后基因修饰干细胞的移植后长期观察研究奠定了基础。     

大鼠Bdnf基因慢病毒载体的构建及其在骨髓间质干细胞中的表达

骨髓间质干细胞（MSCs）是目前基因工程正在探讨应用的靶细胞,为构建带有脑源性神经营养因子（Bdnf）基因慢病毒载体并使其在大鼠骨髓间质干细胞中表达,采用RT-PCR技术获得大鼠Bdnf基因编码区（CDS）片段,限制性内切酶酶切和基因重组构建慢病毒载体质粒PNL-BDNF-IRES₂-EGFP,在脂质体介导下与包装质粒HELPER,包膜质粒VSVG共转染293T细胞包装生产慢病毒。所获慢病毒感染大鼠MSCs（rMSCs）后,PCR和免疫细胞化学法检测在rMSCs中Bdnf基因的插入和表达。结果显示所获的Bdnf基因经测序后与GenBank报道序列完全一致。重组慢病毒载体质粒PNL-BDNF-IRES2-EGFP经鉴定正确。三质粒共转染293T细胞成功,收集、浓缩病毒后测定其滴度为6.7×10⁷TU/mL, PCR证实Bdnf基因插入病毒基因组。感染rMSCs后RT-PCR、免疫细胞化学染色及Western检测各组细胞均有BDNF蛋白表达,其中试验组BDNF-rMSCs更大量表达BDNF,与其余2组(Mock-rMSCs、rMSCs)比较差异具有统计学意义。构建带有Bdnf基因慢病毒载体并在大鼠骨髓间质干细胞中成功表达,为今后基因修饰干细胞的移植后长期观察研究奠定了基础。     

建立携带左旋天门冬酰胺酶的红细胞特异性表达系统

目的:建立基因修饰红细胞输送左旋天门冬酰胺酶(L-ASNase)的体系。方法:采用2A联体技术将L-ASNase和红色单体荧光蛋白基因分别置于红细胞特异性基因调控元件或非组织特异性短延长因子1α启动子控制下,构建慢病毒载体,分别包装成组织特异性重组慢病毒或非组织特异性重组慢病毒,测定病毒滴度,并分别感染靶细胞,用六氧苄基鸟嘌呤/卡莫司汀联合筛选以富集感染的小鼠红白血病阳性细胞;用六亚甲基二乙酰胺诱导富集的阳性细胞向红细胞分化,流式细胞术检测红色单体荧光蛋白报告基因的表达,荧光显微术观察基因表达产物在细胞中的定位,免疫印迹分析L-ASNase的表达水平,评估在红细胞分化过程中组织特异性重组慢病毒的表达优势。结果:经限制性内切酶谱分析和序列测定,构建的重组慢病毒载体结构正确;免疫荧光结果显示在非组织特异性慢病毒感染的HeLa细胞中,L-ASNase主要表达在细胞质,单体红色荧光蛋白主要表达在细胞核内,提示2A序列通过自裂解使同一读框中的2个基因获得了表达;用50μmol/L六氧苄基鸟嘌呤-50μmol/L卡莫司汀联合筛选,可有效富集感染的小鼠红白血病阳性细胞;经六亚甲基二乙酰胺诱导,第7 d的MEL细胞中表达的重组L-ASNase浓度达0.3 U/mg总蛋白。结论:红细胞特异性慢病毒载体可以在小鼠红白血病细胞向红细胞分化过程中使携带基因的表达逐步增高,优于非组织特异性慢病毒载体。本研究为基因修饰造血干细胞、并通过体外细胞分化的方法大量产生携带L-ASNase的红细胞治疗恶性血液病奠定了临床前的实验基础。     

过表达CXCL12基因的脂肪来源间充质干细胞的构建及其对内皮祖细胞趋化作用的实验研究

目的:本研究旨在构建携带间质细胞衍生因子1a(Stromal cell derived factor-1a,CXCL12/SDF-1a)基因慢病毒载体,探索CXCL12慢病毒转染脂肪间充质干细胞(ADSCs)及CXCL12的表达,并观察其对内皮祖细胞的趋化作用。方法:利用PCR的方法从基因库调取并扩增CXCL12基因,克隆到穿梭质粒p Len O-GTP的表达框中,将重组p Len O-GTP载体质粒和慢病毒包装质粒共转染293T细胞,收获并测定病毒滴度,以最适MOI值转染ADSCs,通过western-blot方法测定转染的ADSCs表达的CXCL12,将过表达CXCL12的脂肪干细胞移植到裸鼠背部,3天后流式细胞术鉴定外周血中的血管内皮祖细胞(EPC)的数量变化。结果:CXCL12基因PCR产物电泳与测序结果均正确。重组p Len O-GTP-CXCL12质粒酶切后产物电泳结果正确,含有CXCL12基因的穿梭质粒构建正确。穿梭质粒与慢病毒包装质粒共同感染293T细胞收获CXCL12慢病毒。测得病毒滴度为1.4×109TU/ml。重组慢病毒感染ADSCs的最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)值为50。western-blot检测结果慢病毒感染的ADSCs高表达CXCL12/SDF-1a,过表达CXCL12基因组裸鼠外周血EPC明显高于其余两组。结论:重组CXCL12慢病毒载体构建成功,包装得到高浓度病毒液,感染人ADSCs能稳定过表CXCL12蛋白,并可趋化骨髓内EPC进入外周血,为临床获取应用EPC提供了一种新的方法,为进一步研究过表达CXCL12的ADSCs,促进移植脂肪成活及血管化奠定基础。     

cxcr2基因修饰小鼠骨髓间充质干细胞的构建与鉴定

目的构建小鼠CXC型趋化因子受体2(CXCR2)基因cxcr2过表达的骨髓间充质干细胞(Bone marrow mes-enchymal stem cell,BMSC)并进行鉴定。方法全骨髓贴壁法分离培养小鼠BMSC,采用流式细胞术检测干细胞抗原1(stem cell antigen-1,SCA-1)、CD44、CD43、CD45、IA/IE表达率,并诱导成骨分化。以含有小鼠cxcr2的质粒为模版进行PCR扩增,将获得的cxcr2克隆到慢病毒载体,命名为p Lenti-cxcr2-GZ;将其与慢病毒包装质粒共转染HEK-293T细胞,收获慢病毒后,通过离心法感染BMSC,经过1μg/mL zeocin压力选择建立了稳定表达CXCR2的小鼠BMSC(CXCR2-BMSC)。采用流式细胞术和RT-PCR分别检测其CXCR2蛋白和m RNA表达水平,Transwell趋化实验检测其迁移能力。结果 90%以上的第3代BMSC表达CD44、SCA-1,几乎不表达IA/IE、CD34、CD45,且成功诱导成骨分化。菌液PCR、质粒双酶切后,琼脂糖凝胶电泳鉴定结果得到特异、大小正确的条带及测序鉴定正确,表明成功构建了p Lenti-cxcr2-GZ表达质粒。流式细胞术和RT-PCR结果显示,CXCR2-BMSC的CXCR2蛋白和m RNA表达水平均明显高于对照组BMSC,差异有统计学意义(P<0.001)。Transwell结果显示,CXCR2-BMSC迁移能力高于对照组BMSC,差异有统计学意义(P<0.01)。结论利用慢病毒系统成功构建了稳定表达CXCR2的BM-SC,cxcr2基因修饰BMSC后可明显增加BMSC的迁移能力。     

过表达Nanog基因的小鼠骨髓间质干细胞对NF-κB表达的影响

核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB) 的激活被认为与中枢神经系统变性疾病的进展有关。新近报告Nanog能抑制NF-κB的表达,为验证这一发现,通过限制性内切酶酶切和基因重组的方法,构建携带Nanog基因的重组慢病毒表达载体质粒pNL-Nanog-IRES2-EGFP,经PCR检测以及测序鉴定后,在脂质体介导下与包装质粒HELPER、包膜质粒VSVG共转染293T细胞包装生产慢病毒。所获慢病毒感染小鼠骨髓间充质干细胞 (mMSCs) 后,Western blotting法检测在mMSCs中Nanog 基因的表达,PCR、Western blotting和免疫细胞化学法检测NF-κB基因的表达。结果显示所克隆的Nanog基因测序结果与GenBank报道序列完全一致。构建的慢病毒载体质粒PNL-Nanog-IRES2-EGFP经Sal I和BamH I双酶切后电泳鉴定正确。所获慢病毒感染mMSCs后荧光激发mMSCs可见绿色荧光,Western blotting检测显示Nanog-mMSCs 组表达Nanog,其他两组基本不表达。RT-PCR和Western blotting检测显示Nanog-mMSCs组的NF-κB表达较空载体-mMSCs组及mMSCs组低,有显著性差异。构建携带Nanog基因慢病毒载体并在小鼠骨髓间质干细胞中成功表达,Nanog基因的表达可抑制NF-κB表达,这结果为神经变性疾病的治疗提供了新思路。     

携带人卵泡刺激素受体的慢病毒载体疫苗的构建及其免疫效应检测

制备携带卵泡刺激素受体的慢病毒载体疫苗,并研究其对小鼠的免疫效应。将卵泡刺激素受体胞外区(fshr366)基因克隆到慢病毒载体上,采用脂质体转染法将重组质粒转染至293T细胞中,包装并产生含有目的基因的病毒颗粒;分别利用RT-PCR和Western blot检测感染病毒颗粒的293T细胞中fshr366在m RNA水平及蛋白水平的表达情况;用携带fshr366的病毒颗粒单次腹腔免疫BALB/c小鼠,分别在免疫0、14、21和28 d对小鼠眼眶采血,ELISA法检测免疫小鼠血清的特异性并测定抗体滴度。酶切和测序结果表明fshr366基因片段成功构建到慢病毒载体上。将包装产生的携带fshr366的慢病毒颗粒感染293T细胞后,RT-PCR和Western blot检测结果表明细胞在转录水平和蛋白水平均表达fshr基因。ELISA结果显示携带fshr366的慢病毒颗粒单次腹腔免疫小鼠后,免疫14 d就激起了机体的体液免疫反应,抗体滴度达到1∶1 600。成功制备了携带卵泡刺激素受体的慢病毒载体疫苗,其可以在小鼠体内激发FSHR抗原特异的早期持续性免疫反应。     

CXCR4慢病毒载体的构建及其在人脐带血间充质干细胞的表达

目的：构建趋化因子CXC亚族CXCR4的慢病毒表达载体并观察其转染人脐带间充质干细胞后的表达。方法：用逆转录PCR方法获取CXCR4基因编码区片段,将构建的慢病毒载体质粒pLVTHM-EGFP-CXCR4与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2．G共转染293T细胞,包装生产慢病毒。用相同滴度的慢病毒转导等量间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell,MSCs）,后采用Real time PCR检测CXCR4 mRNA、Western Blot方法检测蛋白质的表达。结果：PCR、酶切和测序结果表明成功的构建了CXCR4基因重组慢病毒载体。同时用该慢病毒载体转染MSCs后可有效地增加MSCs中CXCR4的表达。结论：成功构建了CXCR4的慢病毒表达载体并能在MSCs中表达,为进一步研究其在干细胞移植中的应用奠定基础。’     

小鼠resistin基因慢病毒表达载体构建及在KMB17细胞中的表达

[目的]构建携带小鼠resistin基因的慢病毒表达载体,并高效转导靶细胞。[方法]从小鼠脂肪组织提取总RNA,经PCR扩增、酶切、连接、转化后构建重组质粒;通过293T细胞包装为重组慢病毒颗粒,然后感染KMB17细胞,检测小鼠resistin基因在靶细胞中的表达。[结果]PCR扩增到预期的342 bp大小的resistin基因目的片段;构建的重组质粒经酶切得到了342 bp大小的目的片段,测序鉴定为小鼠resistin基因序列;重组慢病毒包装可观察到很强的绿色荧光,说明具有较高的质粒转染效率;重组慢病毒感染KMB17后可检测到小鼠resistin基因转录水平和蛋白水平的表达,证明resistin基因得到有效转导并可在靶细胞中高水平表达。[结论]成功构建了携带小鼠resistin基因的慢病毒表达载体并可在KMB17靶细胞中获得高效表达。     

大鼠CXCR4基因RNAi慢病毒载体的构建及其在骨髓间质干细胞中的表达

为深入研究CXCR4在骨髓间质干细胞(MSCs)体内迁移中的作用, 构建CXCR4基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体并实现其在大鼠MSCs (rMSCs)中表达。根据大鼠CXCR4 mRNA序列, 设计并合成包含各靶序列的互补DNA链,插入pSUPER载体的H1 RNA启动子后面, 产生pRiCXCR4, 将其中的CXCR4 shRNA表达结构酶切插入慢病毒载体质粒pNL-EGFP, 产生pNL-RiCXCR4-EGFP。在脂质体介导下与包装质粒pHELPER和包膜质粒pVSVG共转染293T细胞, 包装生产慢病毒,测定慢病毒功能滴度。慢病毒转导rMSCs后, 用Real-time RT-PCR、Western blotting和流式细胞术检测RNAi组(CXCR4a、CXCR4b和CXCR4c)、空载体组(Mock)和对照组(Control)中CXCR4表达情况。结果显示, 酶切和测序证实pRiCXCR4质粒构建正确, 产生能同时表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和CXCR4 shRNA的慢病毒载体质粒pNL-RiCXCR4-EGFP, 未浓缩和浓缩慢病毒悬液的功能滴度分别为6.4×104TU/mL和6.9×106TU/mL。慢病毒转导rMSCs 48 h后, 与空载体组和空白组相比, 3个RNAi组均不同程度抑制CXCR4表达, CXCR4b-MSC组在mRNA水平抑制了95.6%, 抑制作用最明显。大鼠CXCR4基因RNAi慢病毒载体构建成功, 为深入研究CXCR4在rMSCs向损伤组织定向迁移的作用奠定了基础。     

小鼠Smad6基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

构建小鼠Smad6基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体,有效沉默骨髓树突状细胞（BMDC）的Smad6基因表达,为构建骨髓致耐受DC用于哮喘等自身免疫疾病的研究。设计小鼠Smad6 shRNA序列,合成、退火,得到双链DNA,与经酶切后的Psih1-H1-copGFP shRNA Vector载体连接产生LV-shSmad6慢病毒载体,并测序鉴定。转染293TN细胞,包装产生慢病毒,测定滴度。感染小鼠骨髓树突细胞,检测Smad6基因的表达状况成功构建Smad6 shRNA的慢病毒载体LV-shSmad6。包装慢病毒,并显著抑制Smad6 mRNA水平及蛋白水平的表达。成功构建出小鼠Smad6基因shR-NA慢病毒载体,为后期研究Smad6基因在哮喘发病机制及新治疗方法提供了稳定的转染细胞载体。     

Microdystrophin基因重组腺病毒的构建及转染mdx骨髓间充质干细胞的表达

构建含有人microdystrophin基因的重组腺病毒,来感染dystrophin基因敲除小鼠mdx的骨髓间充质干细胞(MSC)进行基因修饰,为同种异体基因修饰的干细胞移植治疗DMD疾病奠定基础。用NotⅠ酶切含microdystrophin基因的pBSK-MICRO质粒,获得microdystrophin基因。片段回收后定向插入腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV,获得重组质粒pShuttle-CMV-MICRO。PmeⅠ线性化重组质粒pShuttle-CMV-MICRO,去磷酸化后回收后与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共电转化BJ5183感受态细胞。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察293细胞病变及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。然后将病毒上清转染DMD模型鼠mdx小鼠的骨髓间充质干细胞,通过RT-PCR以及间接免疫荧光检测microdystrophin的转录及蛋白表达。成功构建了含有microdystrophin基因的重组腺病毒,病毒滴度为5·58×1012vp/mL。间接免疫荧光检测可见microdystrophin蛋白在mdx小鼠MSCs中高效表达。该重组腺病毒载体的构建及成功转染到mdxMSCs内表达为下一步用microdystrophin基因修饰的mdxMSCs进行同种异体移植治疗DMD疾病奠定了基础。     

体外传代对版纳微型猪骨髓间充质干细胞绿色荧光蛋白表达的影响

目的通过分离扩增版纳微型猪骨髓间充质干细胞(BMSCs)观察传代对慢病毒转染的绿色荧光蛋白(GFP)表达的影响。方法采集4月龄版纳微型猪的骨髓,在DMEM/F12培养液中分离间充质干细胞(MSCs),并根据其形态学、抗原标志表达和分化潜能给予鉴定。MSCs与GFP慢病毒载体共培养,荧光显微镜观察GFP的表达,流式细胞仪检测传代后MSCs GFP表达率的变化。标记后传代至1、2、3、4代细胞间比较用非参数检验。结果采用直接培养骨髓,可以分离到高表达CD13、CD29、CD90、CD105的MSCs,并可诱导分化为脂肪、骨和软骨细胞。MSCs与携带GFP的慢病毒载体共培养3天即可观察到GFP的表达,最佳转染复数(MOI)值为50,最佳共培养时间为6 d。传代后MSCs GFP表达率呈下降趋势[1代转染率(42.3±2.25)%、2代转染率(41.6±2.65)%、3代转染率(41.4±3.75)%和4代转染率(38.2±4.75)%],但传至4代GFP表达率的变化差异无统计学意义(P0.05)。结论采用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液可以从版纳微型猪骨髓中分离到MSCs,GFP慢病毒转染是标记MSCs的有效方法,连续传代4代不会显著影响GFP的表达。     

Netrin-1慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的:构建携带有Netrin-1基因的逆转录病毒载体,为研究Netrin-1在神经发育中的作用奠定基础。方法:PCR扩增Netrin-1基因片段后,将其克隆入慢病毒表达载体pLXSN;通过PCR、酶切、测序鉴定重组质粒。重组质粒转染PA317包装细胞后获得包装的病毒颗粒。病毒颗粒感染人脑胶质瘤细胞SW038-C2,经Western blot证明重组病毒在真核细胞内表达Netrin-1的情况。结果:经PCR扩增、酶切和测序验证,重组质粒构建正确,命名为pLX-NT。Western blot证明在感染细胞泳道有一特异性条带。结论:成功构建了能表达Netrin-1的慢病毒载体。     

小鼠RNA干扰RelA基因慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建小鼠Rel A基因的RNA干扰慢病毒载体,转染小鼠成骨样细胞并鉴定。方法:针对小鼠Rel A基因序列,设计特异性的sh RNA序列,应用基因重组技术插入慢病毒载体GV-248。得到的重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选得到阳性克隆并扩大培养。所得质粒进行测序分析确定载体构建成功。重组质粒载体及包装辅助质粒转染293T细胞,得到目的病毒并测定相应病毒滴度。慢病毒转染MC3T3-E1细胞后,Real-time PCR及Western blot检测MC3T3-E1细胞Rel A基因及成骨相关基因ALP、OCN、RANKL的表达。结果:成功构建小鼠Rel A基因的RNA干扰慢病毒载体,感染MC3T3-E1细胞后,Rel A基因的表达明显受到抑制,同时RANKL基因表达水平明显下降,ALP、OCN基因表达水平明显上升。结论:成功构建了小鼠Rel A基因的RNA干扰慢病毒载体。当小鼠成骨细胞Rel A基因表达被干扰,NF-κB通路被抑制后,小鼠成骨细胞成骨相关基因ALP、OCN的表达明显上升,成骨功能增强;同时RANKL的表达明显下降,其介导的破骨细胞骨吸收功能减弱。     

短发夹RNA慢病毒载体稳定抑制NLRP3表达的HepG2细胞的构建

目的:构建针对NLRP3基因的短发夹RNA(sh RNA)慢病毒表达载体,在Hep G2细胞中鉴定该载体对NLRP3的抑制效果。方法:设计针对NLRP3基因的sh RNA序列,将其插入慢病毒表达载体p WPT-U6-sh RNA-CMV-GFP中,将载体与包装质粒ps PAX2、p MD2.G共转染293T细胞,进行病毒包装;得到的病毒原液浓缩后系列稀释为9个浓度递减的病毒液,分别转染293T细胞后进行滴度测定;用获得的慢病毒液感染人肝癌细胞系Hep G2,获得稳定沉默NLRP3的细胞株;利用实时定量PCR和Western印迹检测稳定细胞株中NLRP3的沉默效应。结果:构建了具有沉默效应的慢病毒干扰载体;稀释法测定干扰病毒滴度为2×108TU/m L;实时定量PCR和Western印迹实验均证实慢病毒转染后,细胞株中NLRP3表达水平明显降低。结论:构建了人NLRP3基因特异性慢病毒干扰载体,获得NLRP3基因稳定干扰的Hep G2细胞株。     

Microdystrophin基因重组腺病毒的构建及转染mdx骨髓间充质干细胞的表达

构建含有人microdystrophin基因的重组腺病毒,来感染dystrophin基因敲除小鼠mdx的骨髓间充质干细胞(ＭＳＣ)进行基因修饰,为同种异体基因修饰的干细胞移植治疗ＤＭＤ疾病奠定基础。用NotⅠ酶切含microdystrophin基因的pBSK-MICRO质粒,获得microdystrophin基因。片段回收后定向插入腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV,获得重组质粒pShuttle-CMV-MICRO。PmeⅠ线性化重组质粒pShuttle-CMV-MICRO,去磷酸化后回收后与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共电转化BJ5183感受态细胞。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察293细胞病变及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。然后将病毒上清转染DMD模型鼠mdx小鼠的骨髓间充质干细胞,通过RT-PCR以及间接免疫荧光检测microdystrophin的转录及蛋白表达。成功构建了含有microdystrophin基因的重组腺病毒,病毒滴度为5.58×10¹²vp/mL。间接免疫荧光检测可见microdystrophin蛋白在mdx小鼠MSCs中高效表达。该重组腺病毒载体的构建及成功转染到mdx MSCs内表达为下一步用microdystrophin基因修饰的mdx MSCs进行同种异体移植治疗ＤＭＤ疾病奠定了基础。     

NGF基因重组慢病毒载体的构建及其在人脐带血间充质干细胞的表达

目的:构建神经生长因子(NGF)的慢病毒表达载体,并观察其转染人脐带间充质干细胞后的表达情况。方法:采用实时定量PCR(RT-PCR)方法获取NGF基因编码片段,并将构建的慢病毒载体质粒与包装质粒和包膜质粒共转染293T细胞,包装生产慢病毒。应用相同滴度的慢病毒转导等量间充质干细胞(MSCs),观察转染后细胞的生长形态及生长曲线,再采用RT-PCR、Western Blot方法检测NGF m RNA、蛋白质的表达水平。结果:经PCR、酶切和测序结果证明成功构建NGF基因重组慢病毒载体。同时NGF基因重组慢病毒载体能够成功转染人脐带间充质干细胞,转染率达95.35%,转染后干细胞在NGF m RNA及蛋白质的表达方面较对照组明显升高,同时经倒置显微镜观察及生长曲线实验证实转染后干细胞的生长与对照组相比无明显差异。结论:重组NGF的慢病毒表达载体能够高效的转染人脐带间充质干细胞,基因转染后干细胞的增殖分化能力与未转染细胞差异无统计学意义,可作为一种高效的干细胞转染方法。