蓝藻橙色类胡萝卜素蛋白的基因克隆及在大肠杆菌中的异源表达和功能分析北大核心CSCD

旨在体内证明蓝藻橙色类胡萝卜素蛋白（OCP）具备不依赖类胡萝卜素的单线态氧（~1O_2）清除功能。通过PCR扩增蓝藻OCP基因,对其进行原核诱导表达,并通过细菌点板和生长曲线测定法检验它在大肠杆菌中的抗~1O_2活性。结果表明,直接从蓝藻水体提取的宏基因组中成功扩增得到OCP基因SyOCP,其编码区大小为954 bp。生物信息学分析表明,SyOCP来源于主要蓝藻种类——集胞藻（Synechocystis sp.PCC 6803）。经IPTG诱导,SyOCP基因在大肠杆菌中获得了高水平的可溶性表达。另外,异源表达SyOCP的重组大肠杆菌对常见的~1O_2光敏诱发剂染料——亚甲基蓝的耐受性得到了显著增强。蓝藻OCP（不结合类胡萝卜素）内在的抗~1O_2功能在大肠杆菌中得到了体内验证。     

酮古龙酸菌细胞色素c的表达、成熟及活性分析

目的:从酮古龙酸菌Y25中扩增细胞色素c基因,在大肠杆菌中表达、成熟并进行生物活性分析。方法:从酮古龙酸菌Y25基因组中PCR扩增细胞色素c基因,构建pET22b表达载体;从大肠杆菌BL21(DE3)中扩增细胞色素c成熟基因簇ccmABCDEFGH,连接到带有山梨糖脱氢酶组成型启动子的pBBR1MCS2-P200载体中;将构建的2个质粒共转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行血红素染色检测;通过氧化还原光谱法对Ni柱亲和纯化的重组蛋白进行活性分析。结果:扩增得到1404 bp的细胞色素c基因及6481 bp的ccmABCDEFGH基因簇;重组菌株经IPTG诱导表达后行SDS-PAGE分析,可见相对分子质量为50×103的表达条带;血红素染色显示重组蛋白结合有血红素;经氧化还原光谱扫描,显示亲和层析纯化得到的目的蛋白有细胞色素c特征吸收峰。结论:从酮古龙酸菌Y25中扩增得到了细胞色素c基因,在大肠杆菌中进行了表达和成熟,表达蛋白具有细胞色素c生物活性。     

稻瘟病菌MoDUO1基因的克隆、原核表达及纯化

MoDUO1基因是稻瘟病菌的致病基因,主要与稻瘟病菌的营养生长、分生孢子发育及致病性相关。本研究旨在构建稻瘟病菌MoDUO1基因原核表达载体,诱导表达并纯化MoDuo1重组蛋白,为后续研究蛋白互作奠定基础。通过RT-PCR扩增得到MoDUO1基因的ORF,酶切回收后与线性化p ET-30a相连,构建了原核表达载体pET-30a-Duo1,将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,扩大培养至OD值为0.6~0.8,加入IPTG至终浓度为0.2 mmol/L,37℃,200 r/min诱导2 h,大量表达得到MoDuo1基因重组蛋白,纯化后得到MoDuo1蛋白。     

弗氏志贺菌5a 型 M90T 株 ClpB 蛋白在大肠杆菌中的融合表达和纯化

目的：构建弗氏志贺菌cZp8基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达后,纯化带T7标签的ClpB蛋白。方法与结果：PCR扩增得到线性化表达载体pET24a与2574bp的c加曰基因片段,利用不依赖连接反应的克隆法（LIC）进行克隆,得到重组质粒pET-ClpB,转入大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达,通过一系列条件优化,确定可溶性表达条件为在30℃下、用1mmol／LIPTG诱导2h;利用抗T7单克隆抗体琼脂糖珠进行亲和纯化,得到了纯度很高的相对分子质量为95×10^3的ClpB-T7融合蛋白。结论：实现了ClpB-T7在大肠杆菌中的可溶性表达,并纯化获得了高纯度的融合蛋白。     

原核生物核糖核酸酶HII基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

核糖核酸酶HII (RNaseHII)能有效降解RNA和DNA杂交链中的RNA链。为进一步研究其功能 ,利用大肠杆菌XL1blue为模板 ,相应的寡聚脱氧核苷酸为引物 ,PCR扩增大肠杆菌RNaseHII(rnh 2 )基因 ,并将目的基因连接到克隆载体 pUC18上 ,经测序确认无误 ,分别亚克隆到能够进行IPTG诱导的表达载体pTrcHisC和进行温度诱导的表达载体pBV2 2 0上。重组质粒转化到大肠杆菌DH5α细胞中获得高效表达。在载体pTrcHisC和 pBV2 2 0中目的蛋白RNaseHII的表达量均超过菌体总蛋白的 2 0 % ,且表达产物以稳定的包涵体形式存在。此项工作为以后目的蛋白的纯化提供了有利条件 ,并为研究其结构和功能奠定了基础。     

文摘

000042抗结肠癌相关抗原单链抗体基因的构建和表达[中]/朱林霞…//生物工程学报.-2000,16(1).-82～85通过ＰＣＲ扩增和酶切分别得到抗结肠癌相关抗原抗体的重链可变区序列、轻链可变区序列及连接肽序列,将它们构建成为ＶＨ-ｌｉｎｋｅｒ-ＶＬ形式的单链抗体基因片段,并在大肠杆菌中进行表达。ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析结果表明,以ｐＣｏｍｂ3为载体,在大肠肝菌ＪＭ83中,ｓｃＦｖ未获得有效表达,而以ｐＥＴ-22ｂ( )为载体的ｓｃＦｖ在大肠杆菌ＢＬ21(ＤＥ3)中,30℃诱导培养获得了高效表达,表达水平占全菌蛋白的35.5%。(杨淑培)000043大肠杆菌原核…     

中华蜜蜂蜂毒磷脂酶A_2基因在大肠杆菌中的表达(英文)

将中华蜜蜂蜂毒磷脂酶A2(AcPLA2)蛋白成熟肽编码区基因(405 bp)克隆至表达载体pETBlue-1,在大肠杆菌Tuner(DE3)plac I中诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测,表达产物分子量为15kD,约占细菌总蛋白的4.6％;用意大利蜜蜂蜂毒磷脂酶A2(AmPLA2)纯品制备的兔源多克隆抗体为一抗作Western blot,表达产物显示类似于天然纯AmPLA2的特异性印迹,证实AcPLA2基因已在大肠杆菌中得到表达。     

黑胸大蠊浓核病毒磷脂酶A2功能区的克隆及其表达

通过RT-PCR扩增获得PfDNV结构蛋白基因VP1含磷脂酶A2(PLA2)功能区片段,将其连接到pMD18-T载体上并亚克隆到原核表达载体pET28a和pET26b,构建阅读框架正确的重组表达载体pET28a-PLA和pET26b-PLA,转化大肠杆菌BL21-codonplus(DE3)-RIL,经IPTG诱导,SDS-PAGE显示得到了目的融合蛋白,以抗组氨酸的单克隆抗体对经Ni-NTA亲和层析柱纯化的目的蛋白进行了westernblot鉴定,结果表明成功表达PfDNV结构蛋白PLA2,对于研究该酶的生物学特性及其在病毒对细胞侵染过程中的功能奠定了基础。     

黑胸大蠊浓核病毒磷脂酶A2功能区的克隆及其表达

通过RT-PCR扩增获得PfDNV结构蛋白基因VP1含磷脂酶A2(PL A2)功能区片段,将其连接到pMD18-T载体上并亚克隆到原核表达载体pET28a和pET26b,构建阅读框架正确的重组表达载体pET28a-PLA和pET26b-PLA,转化大肠杆菌BL21-codonplus(DE3)-RIL,经IPTG诱导,SDS-PAGE显示得到了目的融合蛋白,以抗组氨酸的单克隆抗体对经Ni-NTA亲和层析柱纯化的目的蛋白进行了western blot鉴定,结果表明成功表达PfDNV结构蛋白PLA2,对于研究该酶的生物学特性及其在病毒对细胞侵染过程中的功能奠定了基础.     

I型鸭肝炎病毒VP1、3D基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据GenBank中的I型鸭肝炎病毒全基因序列设计了扩增I型鸭肝炎病毒VP1、3D基因的引物, 用该特异性表达引物从I型鸭肝炎病毒cDNA模板中扩增得到目的基因VP1、3D, 用相同的限制性内切酶酶切目的基因和表达载体pET32a后构建重组表达载体, 转化宿主BL21(DE3), 用不同浓度的IPTG诱导VP1、3D基因的表达, 收集菌液进行SDS-PAGE电泳, Western-blotting分析蛋白免疫原性。结果表明, VP1、3D在大肠杆菌中表达量较高, 表达产物的分子量约为48 kD、68 kD, 并能被兔抗DHV-1血清所识别。I型鸭肝炎病毒VP1、3D蛋白在大肠杆菌中表达产物具有免疫原性。     

利用大肠杆菌表达系统制备抗VEGF螺旋-环-螺旋多肽及其纯化的研究

VEGF(血管内皮生长因子)是一种诱导肿瘤血管形成的作用最强、特异性最高的血管生长因子.本实验利用抗VVEGF螺旋-环-螺旋多肽的基因M49,通过PCR技术扩增获得目的基因,构建原核表达pET-32a(+),转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21进行表达,并对目的蛋白进行诱导表达及纯化.结果表明PCR...     

Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1、3D基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据GenBank中的Ⅰ型鸭肝炎病毒全基因序列设计了扩增Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1、3D基因的引物,用该特异性表达引物从Ⅰ型鸭肝炎病毒cDNA模板中扩增得到目的基因VP1、3D,用相同的限制性内切酶酶切目的基因和表达载体pET32a后构建重组表达载体,转化宿主BL21(DE3),用不同浓度的IPTG诱导VP1、3D基因的表达,收集菌液进行SDS-PAGE电泳,Western-blotting分析蛋白免疫原性.结果表明,VP1、3D在大肠杆菌中表达量较高,表达产物的分子量约为48 kD、68 kD,并能被兔抗DHV-1血清所识别.Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1、3D蛋白在大肠杆菌中表达产物具有免疫原性.     

小鼠金属硫蛋白在聚胞藻中的金属诱导表达与纯化

应用蓝藻类金属硫蛋白基因启动子(smt O-P)的金属诱导性,在单细胞的聚胞藻PCC 6803中表达小鼠金属硫蛋白结构基因(mMT-1 cDNA)。在大肠杆菌HB 101中构建含有smt O-P和mMT1 cDNA的穿梭表达载体pKT-MRE,经质粒转移,链霉素筛选,Southern和Western杂交分析鉴定得稳定的转基因工程藻落。同时,做小批量锌诱导表达,并纯化了外源蛋白,5L培养液含鲜藻重5.0g,得到3.5mg mMT-1;转基因藻在高金属浓度下的耐受性测定表明,外源基因的表达提高了蓝藻对金属离子的抗性,约为野生藻的2倍。     

猪丹毒丝菌SpaA蛋白的表达与纯化

[目的]在大肠杆菌中表达猪丹毒丝菌spaA基因并纯化重组蛋白。[方法]利用PCR扩增猪丹毒丝菌临床分离株spaA基因,构建重组质粒p GEX-4T-1-spaA,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达融合蛋白GST-SpaA,并优化表达条件。最后采用GST琼脂糖纯化树脂纯化,SDS-PAGE和Western Blotting检测。[结果]成功扩增spaA基因,获得重组表达菌株BL21(DE3)/p GEX-4T-1-spaA;在菌体OD_(600)为0. 9时,加入IPTG至终浓度0. 1 mmol/L,34℃诱导6 h的条件下表达效果最好。经SDS-PAGE检测和纯化后得到大小为97 kDa的GST-SpaA; Western Blotting检测结果表明,GST-SpaA具有良好的免疫原性。[结论]成功在大肠杆菌中表达了SpaA蛋白,经纯化得到具有免疫原性的重组蛋白,为后续研制猪丹毒丝菌SpaA蛋白亚单位疫苗奠定基础。     

解毒酶基因的克隆及其在大肠杆菌和蓝藻中的表达(英文)

近几年来 ,在明确了杀虫药剂抗性机理的基础上 ,从杀虫药剂抗性的昆虫中分离出高抗性基因 (即解毒酶基因 ) ,将该基因克隆到表达载体 pRL 4 39上 ,得到表达载体 pRL B1,将其转化大肠杆菌HB10 1,获得了可以表达解毒酶基因的转基因工程菌株。同时构建了穿梭表达载体 pDC B1,并转化大肠杆菌HB10 1后 ,在抗生素氨卞霉素 (30 μg/mL)和卡那霉素 (30 μg/mL)平板上挑选阳性克隆 ,将阳性克隆的细胞、蓝藻和结合质粒以三亲结合转移的方式转入蓝藻。斑点杂交、Southern分析结果表明已经获得了Synechococcussp .PCC 794 2转基因工程藻。     

酿酒酵母乙醇脱氢酶2(ADH2)基因的克隆表达及活性验证

为了从酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中克隆出乙醇脱氢酶2(Alcoholdehy drogenase2,ADH2)基因并使之在大肠杆菌中高效表达。以酿酒酵母细胞中提取的总RNA为模板,通过反转录获得酿酒酵母乙醇脱氢酶2基因,连接到表达载体pTAT上,得到重组表达质粒pTAT-ADH2,将此重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,重组工程菌株经IPTG诱导表达得到ADH2蛋白。将该蛋白纯化后,在体外进行活性检测和小鼠体内进行毒理试验,检测ADH2的酶活性。测序结果表明克隆的基因与GenBank中所报道的adh2基因序列有90%的同源性,经SDS-PAGE电泳分析,目的蛋白得到了有效表达,蛋白条带扫描分析表明,表达量占总蛋白的50%左右,纯化得到的蛋白在小鼠体内进行毒理试验,显示出一定的活性。酿酒酵母adh2基因的克隆正确,不仅在大肠杆菌中进行了高效表达而且表现出了较好的酶活性。     

三角酵母D-氨基酸氧化酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

从三角酵母中提取总RNA ,反转录后进行PCR扩增得到D 氨基酸氧化酶 (D AminoAcidOxidase ,DAAO)基因 ,经测序可知 ,与文献中三角酵母的DAAO基因序列的同源性在 99%以上。将DAAO基因用NcoⅠ和BamHⅠ双酶切后 ,与相同酶切的大肠杆菌表达载体pET 2 8a连接 ,转化大肠杆菌TOP 1 0F′,并筛选得到重组质粒pET DAAO ,转化BL2 1 (DE3)感受态细胞 ,得到重组大肠杆菌BL2 1 (DE3) pET DAAO。对重组大肠杆菌中的D 氨基酸氧化酶进行了诱导表达 ,考察了诱导温度、菌浓度、诱导剂IPTG用量以及溶氧等因素对酶活的影响。结果表明 ,在 2 8℃、菌浓度 (OD6 0 0 ) 1 0、IPTG浓度 1mmol L时 ,DAAO酶活最高达 2 3 3U mL。研究进一步显示 ,用廉价无毒的乳糖可以替代IPTG进行诱导 ,当乳糖浓度为 2mmol L ,DAAO酶活可达 2 2 7U mL。经过补料分批培养和乳糖诱导 ,DAAO酶活可以达到 1 75U mL。     

Aeropyrum pernix K1磷脂酶A2的克隆、表达及其性质

从超嗜热需氧古细菌AeropyrumpernixK1中抽提出染色体基因组,经PCR扩增得到磷脂酶A2基因,用带有His-tag标记的pET15b作为表达载体,在大肠杆菌BLP中成功地诱导表达。表达产物经过Ni-螯合柱一步得到纯化。SDS-PAGE检测只有一条带,其准确分子量为17,871kD。对纯化后的磷脂酶A2测定其酶活性和生物活性,得出其最适反应温度为90℃,最适pH范围为7.8~8.2。至此首次成功地在大肠杆菌中表达了古细菌嗜热磷脂酶A2,这将为以后对该酶的结构和功能以及耐热机制研究打     

结核分枝杆菌Rv1759c 结构域与IL-2 融合蛋白的表达与鉴定

目的:构建结核分枝杆菌(MTB)Rv1759c结构域(Rv1759cD domain,Rv1759cD)与人IL-2(hIL-2)融合基因,并在大肠杆菌中表达获得重组的融合蛋白Rv1759cD-IL-2。方法:用PCR方法从MTB H37Rv基因组扩增Rv1759cD基因片段,测序后与hIL-2基因构建融合基因,并克隆到表达载体pProEX HTa。融合基因在大肠杆菌DH5α中诱导表达,经SDS-PAGE分析后,分别与His mAb、IL-2mAb和结核病人血清进行Western-blot鉴定,采用Ni-NTA亲和层析纯化蛋白。结果:获得的Rv1759cD基因经测序与GenBank公布的序列完全一致,与hIL-2基因连接后,构建的融合基因在大肠杆菌中有效表达。表达蛋白相对分子量为30KDAa,与预测值相符;Western-blot结果显示,在相对分子量30KDAa处分别与His mAb和鼠抗IL-2 mAb形成结合带,并与结核病人血清出现特异性结合。通过Ni-NTA亲和层析,可得到纯化的目的蛋白。结论:成功表达、纯化和鉴定了Rv1759cD-IL-2融合蛋白,并有可能作为新型结核病疫苗的靶抗原。     

家蝇伴侣蛋白TCP-1基因的序列分析、克隆及诱导表达

旨在对EST筛选得到的家蝇伴侣蛋白TCP-1(MD-TCPⅠ)基因进行序列分析,克隆其cDNA序列并在大肠杆菌中诱导表达。采用EST测序技术从已构建的家蝇幼虫cDNA质粒文库中筛选到MD-TCPⅠ基因,对其进行序列测定和分析。以该基因的cDNA文库质粒为模板,通过PCR的方法进行扩增,以pET-28a(+)为载体构建重组质粒,再转化到表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达产物通过SDS-PAGE进行鉴定。结果显示,MD-TCPⅠ基因ORF全长753 bp,编码250个氨基酸,理论分子量27.07 kD;等电点5.92,该序列编码的蛋白属于热休克蛋白60家族的TCP。构建了正确基因序列MD-TCPⅠ重组表达质粒,重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。