β-葡聚糖酶的分离纯化和特性研究

对里氏木霉所产β-葡聚糖酶粗酶液通过饱和硫酸铵沉淀、Sephadex G-100 柱层析和DEAE-Sephadex A-50 柱层析进行纯化,比活提高14.60倍,活力回收6.62%。酶特性研究表明,最适温度和pH分别为60℃和5.0,在pH低于5.0时酶较稳定,酶的热稳定性在60℃以下。 Cu～2+、 Mn～2+ 、Mg～2+ 、Fe～3+ 和K+对酶有抑制作用, Zn～2+、Ca～2+、 Co2+和 Fe～2+ 有激活作用。     

β-葡聚糖酶的分离纯化和特性研究*

对里氏木霉所产β-葡聚糖酶粗酶液通过饱和硫酸铵沉淀、Sephadex G-100 柱层析和DEAE-Sephadex A-50 柱层析进行纯化,比活提高14.60倍,活力回收6.62%。酶特性研究表明,最适温度和pH分别为60℃和5.0,在pH低于5.0时酶较稳定,酶的热稳定性在60℃以下。 Cu～2+、 Mn～2+ 、Mg～2+ 、Fe～3+ 和K+对酶有抑制作用, Zn～2+、Ca～2+、 Co2+和 Fe～2+ 有激活作用。     

棒曲霉Asp-195v产蛋白酶的酶学性质研究

对液体发酵的棒曲霉Asp-195v菌株所产蛋白酶的活力进行了研究,并通过分离纯化获得了电泳纯的酶蛋白。研究结果表明,该蛋白酶的最适反应温度为40℃,在30-50℃温度范围内相对活力可保持在70%以上;最适pH为7,pH稳定范围在4-8;Mn2+对该蛋白酶活力有明显的激活作用,K+、Ag+、Cu2+、Fe2+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、Al3+和Fe3+离子则有明显的抑制作用,尤其是Hg2+和Pb2+对酶活的抑制作用更加强烈;其他试剂如葡萄糖、EDTA对酶活的抑制作用不明显,而蔗糖、SDS和Tween-20对酶活的抑制明显;以酪氨酸为底物采用双倒数作图法测得Vmax为30.40mmol/min,Km为97.53mmol/L。该酶的表观分子量为30.1kDa。     

棘孢曲霉SM-L22β-葡萄糖苷酶的纯化与性质

通过分子筛层析和离子交换层析等手段,分离纯化了棘孢曲霉SM-L22纤维素酶系中的β-葡萄糖苷酶组分。通过SDS-PAGE和IEF电泳测得其分子量为57.9 kDa,等电点为pH 4.5。该酶组分的最适温度60℃,最适pH 5.5,在40℃以下以及pH 3.0~10.0范围内稳定。Fe2+和Mn2+ 对酶有激活作用,而 EDTA对酶有较明显的抑制作用。底物专一性实验表明,该酶可作用于纤维二糖、水杨素和乳糖。作用于纤维二糖和水杨素的Km值分别为17.13 10-3 mol/L 和11.93 10-3 mol/L,Vmax分别为3.456 10-4 mol/L/min和7.139 10-4 mol/L/min,Kcat分别为3.75 S-1和7.73 S-1。     

木霉GXC产β-葡聚糖酶条件和酶学性质

研究了木霉GXC产β-葡聚糖酶的条件.结果表明,最适产酶碳源为麸皮,氮源为硫酸铵;产酶的最适条件为初始pH为4.0～5.0,30℃培养44h.粗酶液经硫酸铵沉淀、Sephadex G-25、Sephadex G-100和DEAE-Sehadex A-50柱层析得到纯β-葡聚糖酶,SDS-PAGE凝胶电泳显示一条带,测得分子量为35kD.该酶最适反应pH5.0,最适反应温度为60℃,在40℃以下、pH4.0～5.0酶活力相对稳定.5.0mmol/L以下的Ca2+、Zn2+和Fe2+,以及10.0mmol/L以下的Co2+对酶活力有激活作用;而Cu2+和Fe3+具有抑制作用.     

棘孢曲霉SM-L22 β-葡萄糖苷酶的纯化与性质*

通过分子筛层析和离子交换层析等手段,分离纯化了棘孢曲霉SM-L22纤维素酶系中的β-葡萄糖苷酶组分。通过SDS-PAGE和IEF电泳测得其分子量为57.9 kDa,等电点为pH 4.5。该酶组分的最适温度60℃,最适pH 5.5,在40℃以下以及pH 3.0~10.0范围内稳定。Fe2+和Mn2+ 对酶有激活作用,而 EDTA对酶有较明显的抑制作用。底物专一性实验表明,该酶可作用于纤维二糖、水杨素和乳糖。作用于纤维二糖和水杨素的Km值分别为17.13 10-3 mol/L 和11.93 10-3 mol/L,Vmax分别为3.456 10-4 mol/L/min和7.139 10-4 mol/L/min,Kcat分别为3.75 S-1和7.73 S-1。     

黑木耳漆酶纯化及部分漆酶特性的研究

黑木耳漆酶研究可为漆酶的进一步分离纯化、基因克隆表达和大规模生产应用奠定基础。对黑木耳"黑29"菌株漆酶粗酶液进行硫酸铵分级沉淀后,通过Native SDS-PAGE电泳检测,存在3种漆酶LacA、LacB、LacC,分子量分别为60,34,19 kD。经硫酸铵分级沉淀和DEAE-Sephacel柱层析技术分离得一纯化成分LacC,纯化倍数7.60,酶活性回收4.28%。对LacC的pH、温度、金属离子和Km值等部分酶学性质进行研究发现,该酶氧化ABTS的Km值为1.18×10-6mol/L,催化氧化底物ABTS的最适pH为3.8,在pH 3.0~4.6表现出较强的稳定性;最适反应温度为55℃,低于50℃时有较好的热稳定性;金属离子Ag+对漆酶有激活作用,而Fe3+、Mn2+、Co2+则有抑制作用。     

嗜热脱氮土壤芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶的克隆与重组表达及其酶学性质研究

【目的】克隆嗜热脱氮土壤芽孢杆菌中的β-葡萄糖苷酶基因bglB,在E.coli中异源表达,纯化并研究其酶学性质。【方法】利用PCR技术从嗜热脱氮土壤芽孢杆菌的基因组DNA中克隆得到bglB基因,将该基因克隆到表达载体pGEX-2TL上并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,对纯化后的β-葡萄糖苷酶的酶学性质及寡聚状态进行分析。【结果】重组表达的β-葡萄糖苷酶最适温度为65°C,最适pH为7.0,能在pH 5-10、60°C下稳定存在4 h,并能在较高的离子强度(880 mmol/L K+)下发挥其功能。Al3+离子对其有强烈的激活作用,Co2+有一定的抑制作用。最适反应条件下该酶比活力为0.043 IU/mg。该酶具有多种寡聚体形式,这些寡聚体均有β-葡萄糖苷酶活性。【结论】获得一个耐热耐盐的中性β-葡萄糖苷酶,为进一步研究β-葡萄糖苷酶的催化作用机理,提高其热稳定性提供一定的帮助。     

Bacillus sublitis JH-1木聚糖酶的纯化及酶学性质

对枯草芽孢杆菌Bacillus sublitis JH-1胞外木聚糖酶的纯化及酶学性质进行了研究。通过(NH4)2SO4分级沉淀法、透析除盐、DEAE-Sepharose FF弱阴离子交换层析等方法,从枯草芽孢杆菌Bacillus sublitis JH-1发酵液中分离纯化得到了电泳纯的木聚糖酶,其相对分子质量为3.45×104,比活力为75 899.68 U/mg。酶学性质研究结果表明:该酶的最适p H为6.0,在最适p H条件下保温2 h后仍能保持75%的活力,而p H越高,活力下降越快,表明为酸性木聚糖酶;最适温度为55℃,在50~60℃保温2 h后仍具有70%左右相对较高的活性,说明该酶具有较强的耐高温性;Fe2+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Ba2+和低浓度(5 mmol/L)的Fe3+对酶的活性有促进作用,而Mn2+和高浓度(10mmol/L)的Fe3+对酶的活性有抑制作用。     

一株β-葡萄糖苷酶产生菌株的分离鉴定及酶学性质研究

【目的】分离获得β-葡萄糖苷酶高产菌株,确定该菌分类地位,并对其所产β-葡萄糖苷酶的酶学性质进行初步研究。【方法】采用七叶灵显色法从土壤样品中筛选β-葡萄糖苷酶产生菌,再用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)显色法进行复筛;通过形态特征、生理生化特征及16S rDNA序列相似性分析等方法确定其分类学地位;利用超滤、疏水层析、阴离子层析、分子筛层析法对β-葡萄糖苷酶进行分离纯化;以PNPG为底物,测定β-葡萄糖苷酶的最适反应pH及最适反应温度,通过双倒数作图法确定β-葡萄糖苷酶催化不同底物水解的米氏常数Km值。【结果】从土壤样品中筛选得到一株β-葡萄糖苷酶高产菌株ZF-6C,初步鉴定为Bacillus korlensis;芽胞杆菌ZF-6C所产β-葡萄糖苷酶的分子量约为90 kD,最适反应pH和温度分别为7.0和40°C,该酶具有水解β(1,4)糖苷键的活性,最适底物为邻硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷,Km值为0.73 mmol/L。金属离子Ca2+、Pb2+增强酶活,而Cu2+、Fe2+抑制酶活。【结论】首次报道从Bacillus korlensis中分离得到β-葡萄糖苷酶,Bacillus korlensis ZF-6C所产β-葡萄糖苷酶在分子量、最适反应条件及底物特异性等方面均不同于已知酶,可能为一结构新颖且催化效率较高的β-葡萄糖苷酶。     

酸性α-淀粉酶的分离纯化与酶学性质研究

纯化了枯草芽胞杆菌xm-1菌株酸性α-淀粉酶,并对其酶学性质进行了研究。通过硫酸铵沉淀和Sephadex G-75凝胶层析将酸性α-淀粉酶粗酶液纯化了32.5倍,活力回收率为10.0%。酶性质测定结果表明,该酸性α-淀粉酶分子量约为60kD,最适反应温度为45℃、最适作用pH5.0,该酶在pH3.4-6.0下稳定,高温耐受性差。Cu2+、Zn2+、EDTA对酶有不同程度的抑制作用,Ca2+和Mn2+对酶具有较强的激活作用。     

里氏木霉GXC木聚糖酶的研究*

研究了里氏木霉GXC产木聚糖酶的条件和酶学性质。结果表明,适宜产酶碳源为乳糖、甘露糖、棉子糖、木聚糖和麸皮,氮源为牛肉膏和酵母膏;产酶的最适初始pH为4.0,30℃培养60h。对以麸皮为碳源的培养液进行纯化的酶特性研究表明,木聚糖酶的最适反应温度为50℃,pH为5.5,该酶在pH5.0(7.0和40℃以下相对稳定。Fe3+和Mn2+对木聚糖酶有较大的促进作用,Cu～2+、Fe～2+和Ca～2+ 具有抑制作用。     

里氏木霉GXC木聚糖酶的研究

研究了里氏木霉GXC产木聚糖酶的条件和酶学性质。结果表明,适宜产酶碳源为乳糖、甘露糖、棉子糖、木聚糖和麸皮,氮源为牛肉膏和酵母膏;产酶的最适初始pH为4.0,30℃培养60h。对以麸皮为碳源的培养液进行纯化的酶特性研究表明,木聚糖酶的最适反应温度为50℃,pH为5.5,该酶在pH5.0(7.0和40℃以下相对稳定。Fe3+和Mn2+对木聚糖酶有较大的促进作用,Cu～2+、Fe～2+和Ca～2+ 具有抑制作用。     

重组磷脂酰丝氨酸合成酶的分离纯化及酶学性质研究

利对重组枯草芽孢杆菌(pBES-pss)表达的磷脂酰丝氨酸合成酶进行分离纯化及酶学性质研究.pBES-pss发酵后的粗酶液经硫酸铵盐析、中空纤维膜除盐浓缩、SP-Sepharose HP离子交换层析和Sephadex G-75凝胶层析,基本获得电泳纯的重组磷脂酰丝氨酸合成酶,比活力可达13.62 U/mg,分子量约为53 kD.酶学性质研究表明,该酶催化卵磷脂水解反应的最适pH8.0,最适温度为35℃.稳定性研究表明:该酶在pH 6.5～9.5 区间和低于45℃温度下稳定.表面活性剂及金属离子对该酶水解活性的影响结果表明,SDS、Tween20、Tween80对该酶有抑制作用,Triton X-100对该酶有增强作用;Mg2+、Zn2+、K+对该酶有抑制作用,Ca2+、Mn2+和EDTA对该酶有增强作用.     

黑曲霉D2-26高温乳糖酶的酶学性质研究

为研究黑曲霉来源的高温乳糖酶的酶学性质,对黑曲霉D2-26发酵液进行分离纯化使酶蛋白达到电泳纯,并对其进行酶学性质研究.结果表明:乳糖酶的最适温度70℃,在30℃～60℃有较高的耐受性;最适pH为2.5,pH稳定范围在2.0～9.0;Mn2 对乳糖酶活性有显著的激活作用,Hg2 、Pb2 对酶活有较强的抑制作用;SDS严重抑制了酶活性;以ONPG为底物采用双倒数做图法测得Vmax为97 nmol/min,Km为8.77 mmol/L;单亚基蛋白的分子量为116.978 kD;糖基化程度为11.3%.     

海洋扩展青霉（Penicillium expansum）果胶酶的纯化及酶学性质研究

通过超滤、DEAE Sephadex A-50离子交换层析、Sephadex G-100凝胶过滤层析,对一株来自海洋的扩展青霉(Penicillium expansum)所产果胶酶进行分离纯化,得到电泳纯的果胶酶,经SDS-PAGE电泳显示单一条带,且果胶酶亚基的分子质量约为63.96 ku,纯化倍数为24.13,回收率为36.32%。酶学性质研究结果表明,该果胶酶的最适反应温度为50℃,最适p H值5.4,在p H值4.6~6.2比较稳定,Mg2+、Ca2+对果胶酶活力有明显激活作用,Cu2+有明显抑制作用,以果胶粉为底物的Vmax为393.56μg/(min·m L),Km为3.34 mg/m L。     

一株嗜热毛壳菌β-葡萄糖苷酶的分离纯化及特性

研究了液体发酵嗜热毛壳菌Chaetomium thermophile产生的β-葡萄糖苷酶的分离纯化及特性。粗酶液经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析、Phenyl-Sepharose 疏水层析、Sephacryl S-100分子筛层析等步骤后获得凝胶电泳均一的β-葡萄糖苷酶。经12.5%SDS-PAGE和凝胶过滤层析方法分别测得该酶的分子量大小约为78.4kDa和81kDa。该酶反应的最适温度和pH值分别为60℃和4.5-5.0。有较好的酸稳定性和热稳定性。金属离子对β-葡萄糖苷酶的活性影响较大, 其中Ca2+对酶有激活作用, 而Ag+、Cu2+ 、Hg2+对酶有显著的抑制作用。该酶对水杨苷具有很强的底物特异性。     

β-葡萄糖苷酶Bgl747的定向筛选、重组表达与酶学性质

【背景】β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase,EC3.2.1.21)是3种纤维素酶中的重要成分之一。目前工业用纤维素酶大都来源于木霉等真菌,较少来源于细菌,而且在应用中还存在反应条件(温度、pH等)适用范围窄、酶活力较低、获取成本偏高等问题,这大大限制了β-葡萄糖苷酶的应用。从秸秆还田土壤细菌中筛选β-葡萄糖苷酶有极大地可能性筛选出酶学性质较好的酶,从而解决现存的工业问题。【目的】从土壤中筛选β-葡萄糖苷酶,通过基因重组、表达优化和蛋白纯化获得一株新型β-葡萄糖苷酶,探究其酶学性质,为其在工业上的应用奠定基础。【方法】利用功能筛选法从土壤中筛选出β-葡萄糖苷酶,全长为747 bp,命名为Bgl747,构建重组表达质粒pET-28a-Bgl747,以Escherichia coli BL21(DE3)为宿主菌株,经IPTG诱导实现可溶性表达并优化表达条件,通过His标签蛋白纯化试剂盒纯化获得纯化酶,探究其酶学性质。【结果】β-葡萄糖苷酶Bgl747属于BglB超家族,分子量为27.23 kD,最适反应温度为45°C,最适p H 4.0;最佳诱导条件:当OD600为1.0,加入终浓度为0.6 mmol/L的IPTG,于37°C、220 r/min诱导10 h后β-葡萄糖苷酶Bgl747蛋白获得最高表达量1.82 mg/m L;底物为对硝基苯-β-D-半乳糖苷(p-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside,p NPG)时的比酶活225.07 U/mg,米氏常数Km值和最大反应速率Vmax分别为0.268mmol/L、547.23μmol/(L·min);1mmol/LK+、1 mmol/L和10 mmol/L Fe2+、30%甲醇、30%乙醇、1 mmol/L和10 mmol/L盐酸胍对酶活都有促进作用,30%TritonX-100及10 mmol/L SDS抑制其酶活效果较为明显;该酶受到产物葡萄糖的反馈抑制,葡萄糖浓度越高,抑制效果越明显,但当葡萄糖浓度为1 mol/L时,酶活仍保持50%以上。【结论】Bgl747反应温度范围较广且稳定,酶学性质优异,为其在纤维素降解等工业应用奠定基础。     

β—1,4—内切木聚糖酶的分离纯化及其性质

通过硫酸铵分级盐析、DEAE-SephadexA50和DEAE－SepharoseCL-6B离子交换层析、FPLC等一系列分离纯化手段,从拟康氏木霉（TrichodermapseudokonigiRifai）固体培养基发酵抽提液中分离得到了Native－PAGE电泳纯的木聚糖酶,SDS-PAGE显示该酶为单肽链结构,分子量约为66kD。该酶的酶反应最适温度为55℃。酶反应的最适pH为4．5。该酶作用于山毛榉木聚糖（Beech－xylan）的Km为20mg/mL,Vmax为3．3μmol·min-1·mg-1。Hg2 、Cu2 对酶反应有较强的抑制作用,而Fe2 、Mn2 对该酶反应则有促进作用。