BLM解旋酶基因的克隆、表达载体构建及表达研究

克隆获得BLM基因全长CDS区,研究其在细胞中的表达情况。从人前列腺癌PC3细胞中提取总RNA,反转录成cDNA,采用分段克隆的方法获得BLM全长CDS区,将其定向插入到原核表达载体pET-32a和真核表达载体pEGFP-N3,构建p ET-32a-BLM和p EGFP-N3-BLM。将获得的重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞或转染PC3细胞,通过SDS-PAGE、Western blotting、荧光定位观察等方法研究人BLM解旋酶在细胞中的表达或定位。BLM解旋酶的原核表达结果显示,不同IPTG浓度对BLM解旋酶的表达量影响不大,低温有助于其表达量的提高。Western blotting检测发现,构建的人BLM解旋酶重组原核和真核表达载体分别能在大肠杆菌细胞和PC3细胞中表达出分子量约为179 kD的蛋白质,与预期分子量大小一致。荧光共定位结果显示,人BLM解旋酶主要定位在细胞核。成功克隆了人BLM解旋酶全长CDS区,且构建的重组表达载体pET-32a-BLM和pEGFP-N3-BLM能在相应的宿主细胞中正确表达。     

烟草NtCBL1基因的克隆、表达载体构建及表达分析

CBL是一类Ca²⁺感受蛋白,在植物适应或抵制逆境胁迫的过程中发挥重要的作用。从烟草品种K326中克隆到了一个CBL1的同源基因,该序列包含了一个642 bp的开放阅读框,编码一个由213个氨基酸残基组成的蛋白,预测分子量为24.5 kDa,等电点为5.03。同源性分析结果显示,该基因与林烟草CBL1、甜辣椒CBL1等具有较高的同源性,故命名为NtCBL1。生物信息学分析表明,NtCBL1具有CBL家族保守的EF-hand钙结合结构域。组织表达分析发现该基因在成熟期的根、茎、叶、花中均有表达,在根中的表达量最高。逆境胁迫实验表明,该基因表达受低钾、高盐、干旱、ABA和低温诱导调控,参与烟草生物与非生物逆境胁迫的响应。并成功构建了NtCBL1-pBI121过表达载体。研究结果为解析NtCBL1在响应逆境胁迫的功能奠定一定理论基础。     

红麻过氧化物酶基因分离、过表达载体构建及转化拟南芥分析

红麻是一种以收获韧皮纤维为主的经济作物,因其具有纤维产量高,抗逆境生长能力强等特点,在我国大部分地区都有种植。近年来,随着其韧皮纤维在纺织工业中的应用,红麻越来越受到育种家的高度重视。其韧皮纤维中木质素含量高低是限制其纤维品质好坏的重要因素之一,过氧化物酶基因在不同品质的木材中差异表达较为显著。为研究该基因在红麻(Hibiscus cannabinus L.)木质素合成过程中的作用,通过红麻转录组数据库筛选到过氧化物酶(Peroxidase)基因的核心片段,利用Tail-PCR技术获得了Peroxidase基因c DNA全长,命名为Hc POD。生物信息学分析表明:Hc POD基因编码序列长952 bp,编码316个氨基酸,相对分子量为33.9 k D,等电点为4.85。为进一步研究该基因的功能,本研究利用p CAMBIA1301载体作为骨架载体构建了红麻过氧化物酶基因过表达载体,利用花絮侵染法转化拟南芥。通过对转基因和非转基因植株体内木质素含量检测后发现,在拟南芥体内过表达红麻POD基因能显著提高拟南芥的木质素含量水平。研究结果为进一步分析该基因功能和了解红麻木质素合成的分子机制具有意义。     

棉铃虫β-catenin基因的克隆、表达分析及真核表达载体构建

β-catenin基因是生物进化上高度保守的基因,是Wnt/β-catenin信号通路中的重要组分。本研究通过RACE方法获得了棉铃虫β-catenin基因的全长c DNA序列,命名为Har-β-catenin(Gen Bank登录号为KJ206237)。其开放阅读框长2382 bp,编码793个氨基酸残基。与已报道的其它物种β-catenin蛋白相似,Har-β-catenin蛋白具有多个ARM重复结构域。运用RT-PCR的方法比较滞育和非滞育蛹脑中Har-β-catenin基因的表达情况,结果表明非滞育蛹脑中Har-β-catenin基因的表达水平高于滞育蛹脑。最后,我们构建了包含Har-β-catenin全长编码区的真核表达载体并调查了Har-β-catenin的亚细胞定位情况。这些结论为我们进一步研究Wnt/β-catenin信号通路在棉铃虫滞育中的作用奠定了基础。     

斜纹夜蛾ppie基因的克隆及表达载体构建

肽基脯氨酰基顺反异构酶E (Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase E, PPIE)是亲环蛋白家族的成员之一,具有肽基脯氨酰基顺反异构酶(Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase, PPIase)活性,能与亲环蛋白抑制剂CsA特异性结合。PPIE具有两个结构域:N-端的RNA识别域(RNA Recognition Motif, RRM)和C-端的PPIase活性域。PPIE和其他亲环蛋白一样,具有蛋白质折叠功能。研究表明,哺乳动物细胞中的PPIE能抑制流感病毒复制,能与MLL PHD3相互结合。但昆虫细胞中PPIE的功能研究较少。本文以斜纹夜蛾Spodoptera litura为研究对象,克隆得到ppie基因,通过生物信息学分析发现,斜纹夜蛾ppie基因ORF全长876 bp,共编码291个氨基酸,具有亲环蛋白家族标签:YQGSlFHRIIPDFMCQGG。构建了真核表达载体pIZT/V5-His-ppie,结果证明,构建的真核表达载体能在昆虫细胞中表达,融合蛋白大小为36 kDa左右,与预测大小一致。还通过免疫荧光实验确定,PPIE定位于细胞核中,与前人研究报道一致。本文研究内容将为进一步研究斜纹夜蛾PPIE功能奠定基础。     

THP基因的重新克隆及草菇表达载体的构建

草菇 (Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａｖｏｌｖａｃｅａ)是一种高温型的食用菌 ,在 4℃低温条件下 ,其菌丝自溶死亡 ,子实体发软、液化直至腐烂[1～ 3 ] 。草菇的这一特性严重地限制了草菇的生产、新鲜草菇的流通、低温冷冻保鲜和出口创汇以及草菇菌种的低温冷冻储藏。草菇是同宗结合的真菌 ,生活史复杂[4 ] ,菌丝没有锁状联合 ,杂种选择缺乏标记 ,这给草菇的杂交育种带来极大的困难[5,6] 。基因工程的发展为解决草菇不耐低温冷藏这一难题提供了可能。ＴＨＰ(ＴｈｅｒｍａｌＨｙｓｔｅｒｅｓｉｓＰｒｏｔｅｉｎ)基因—热滞后蛋白基因 ,是加拿大科学…     

小鼠IL-6基因的克隆及表达载体的构建

采用常规的分子生物学技术,从小鼠骨髓细胞中克隆了含信号肽序列的IL-6,并构建了表达载体,序列分析表明所克隆的IL-6序列与文献报道的一致,构建的表达载体经鉴定正确。     

菘蓝MYB34基因的克隆及其表达分析

该研究以菘蓝新鲜嫩叶为材料,采用RT-PCR方法,克隆了菘蓝IiMYB34基因(GenBank登录号为MF373610),并对其进行生物信息学和表达模式分析。结果表明:(1)IiMYB34基因组DNA全长为1 854bp,包含3个外显子和2个内含子;ORF全长为951bp,编码316个氨基酸;IiMYB34蛋白二级结构中无规则卷曲和α-螺旋所占比例最多,延伸链较少,与其三级结构的预测结果相一致;IiMYB34基因序列还存在2个保守的MYB DNA-binding结构域,属于典型的R2R3-MYB蛋白;IiMYB34氨基酸序列与欧洲油菜、甘蓝等植物的亲缘关系较近。(2)qRT-PCR分析显示,IiMYB34基因呈组织特异性表达,并在叶中表达量最高;茉莉酸甲酯、水杨酸及葡萄糖均显著诱导该基因的表达,而低温(4℃)和机械伤害处理对其表达具有一定的抑制效应。该研究结果为进一步揭示IiMYB34基因的功能奠定了基础。     

番茄LeEIL1基因的克隆分析及表达载体构建

采用RT-PCR方法从番茄果实cDNA中成功克隆了番茄LeEIL1基因,并测序验证序列正确;经数据库检索等生物信息学分析方法,对番茄LeEIL1蛋白质与拟南芥、烟草、水稻、香石竹等的EIN3/EILs蛋白质序列进行了同源性分析,初步确定了番茄LeEIL1上的DNA结合功能域及其结合激活位点.并构建了LeEIL1的酵母表达工程茵pPIC9k-EIL1/KM71,为该基因的功能研究奠定了基础.     

蜻蜓凤梨AfGAI基因的克隆、分析与表达载体构建

根据蜻蜓凤梨转录组信息,通过RACE技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)获得蜻蜓凤梨中一个DELLA蛋白的cDNA序列,并将其命名为AfGAI。AfGAI cDNA全长1 960 bp,开放阅读框为1 764 bp,编码587个氨基酸。氨基酸序列分析结果显示,AfGAI蛋白含有DELLA蛋白家族共有的功能结构域:DELLA结构域和GRAS结构域,与菠萝(Ananas comosus)、海枣(Phoenix dactylifera)、油棕(Elaeis guineensis)、巨桉(Eucalyptus grandis)、陆地棉(Gossypium hirsutum)中的GAI同源性分别为90%、73%、73%、65%、59%。进一步构建了35S:AfGAI过表达载体,为解析凤梨科植物开花机理提供理论依据。     

柑橘MYB15基因的克隆与表达分析

采用电子克隆和RT-PCR方法从柚(Citrus maxima(Burm.)Merr.)、枳(Poncirus trifoliata(L.)Raf.)和柠檬(Citrus limon(L.)Burm.f.)实生苗中克隆了3个MYB蛋白基因,分别命名为CmMYB15、PtMYB15和ClMYB15;并用实时定量qRT-PCR技术检测了该基因在脱落酸(ABA)、干旱、低温和高盐胁迫处理下的时空表达。结果显示,CmMYB15、PtMYB15和ClMYB15的cDNA序列全长分别为994、992、988 bp,分别编码267、266、265个氨基酸,且编码的氨基酸序列N端均含有2个串联的不完全重复的MYB DNA-binding结构域,由此推测该3个基因均属于R2R3亚类;MYB15基因均能被ABA、干旱、低温和高盐胁迫诱导表达,且在柚、枳和柠檬中存在表达差异。本研究表明柚CmMYB15、枳PtMYB15和柠檬ClMYB15是MYB基因家族成员,可能在柑橘响应非生物胁迫过程中起到一定的作用。     

猪Gli1基因的克隆、表达谱分析及脂肪组织特异性表达载体的构建

Hedgehog(Hh)信号通路对动物脂肪沉积具有抑制作用,并且从果蝇到脊椎动物具有高度保守性,但在家猪研究中鲜见报道。文章选择家猪Hh通路的转录激活因子Gli1进行研究,通过RT-PCR结合RACE技术,首次获得家猪Gli1基因cDNA全长,利用Real-time PCR对家猪Gli1基因在不同组织中的表达丰度进行了分析,并构建了真核表达载体和脂肪组织特异性表达载体。结果表明:猪Gli1基因cDNA全长3 576 bp,基因组序列全长10 715 bp,共12个外显子,编码1 106个氨基酸。生物信息学分析表明,猪Gli1为不稳定亲水性蛋白,不具有跨膜结构域和信号肽序列,但具有锌指结构与核定位序列。对7个物种的Gli1蛋白序列和基因组序列相似性进行分析,发现各物种间序列相似性均在80%以上,说明Gli1在物种间高度保守。组织表达谱分析表明,Gli1仅在成体猪舌组织中表达;在家猪脂肪组织发育进程中,Gli1仅在出生1周的猪脂肪组织中检测到微弱表达,但1月龄及3月龄猪脂肪组织中均检测不到表达,由此推断猪Gli1表达与脂肪组织发育呈负相关。最后,将猪Gli1编码区克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP,体外转染实验证明该载体能够正确表达猪Gli1,另外还构建了脂肪组织特异性表达载体,为构建脂肪组织特异性转基因动物奠定基础。     

酿酒酵母HAL1基因的克隆及植物表达载体的构建

HAL1基因是酵母中重要的耐盐基因。以酿酒酵母AS2.375菌株的DNA为模板,根据已发表的序列设计引物,经PCR扩增得到约900 bp的HAL1基因片段,连接到pMD18-T载体上,转化大肠杆菌JM109,筛选重组质粒进行酶切分析和序列测定,结果显示已克隆到完整的可读框,该基因的序列与已知序列同源性达99%。将HAL1基因从T-载体上切下连接到pAM194载体上构建了HAL 1基因的植物表达载体,用于烟草的转化获得了耐盐性提高的转化植株。     

小鼠IL-18基因的克隆及真核表达载体的构建

研究ＩＬ－１８是否具有对造血功能调控的作用。采用常规分子生物学技术,从小鼠骨髓细胞中克隆了含信号肽序列的ＩＬ－１８,构建了表达载体。经序列测定表明所克隆的ＩＬ－１８序列与文献报道的一致,构建的真核表达载体正确。     

UK114基因的克隆和表达载体的构建

山西农业大学生命科学学院常泓、中国农业大学食品学院南庆贤、山西农业大学动物科技学院岳文斌三位科学工作者采用PCR法扩增得到重组UK114cDNA序列将其克隆于T-easy载体并进行了序列测定与分析．结果表明：该序列全长1017bp,有一个开放的阅读框（40nt-450nt）,可编码137个氨基酸（14．2KDa）,与UK114的序列比较,同源性为91％,突变的86个核苷酸中都为无义突变,开放阅读框中仅有一个核苷酸突变。他们在实验中构建了pBV114表达载体,选择阳性克隆提取质粒进行酶切,用琼脂糖检测获得的1kb和3．7kb的两个片段。[第一段]     

嘌呤核苷磷酸化酶基因的克隆及原核表达载体的构建

通过PCR方法从产气肠杆菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、大肠杆菌扩增嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)基因,然后将扩增的约720bp的基因片段克隆到pET-28b表达载体上,构建重组PNPase的表达载体。核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因在三个菌株之间有很高的同源性。SDS-PAGE电泳结果显示出明显的特异性蛋白质条带,其分子量约为29.8kDa.该载体的构建为进一步研究核苷及其类似物的生物合成奠定基础。     

小鼠全长干细胞因子基因的克隆及表达载体的构建

采用常规的分子生物学技术,从小鼠骨髓细胞中克隆了含信号肽序列的ＳＣＦ,并构建了表达载体。序列分析表明所克隆的ＳＣＦ序列与文献报道的一致,构建的表达载体经鉴定正确。     

大豆GmPDS基因的克隆及VIGS表达载体构建和鉴定

病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)技术是近年来发展起来的一种反向遗传学快速研究基因功能的方法,对于植物特别是难于转化的大豆而言尤其适用。本研究采用PCR技术从大豆(Glycine max)基因组中克隆了八氢番茄红素去饱和酶(phytoene desaturase,PDS)基因的部分序列,命名为GmPDS(Glycinemax PDS)。该片段长430bp,序列分析表明,该基因与大豆八氢番茄红素去饱和酶(GenBank登录号:M64704)cDNA序列同源性为99%。双酶切GmPDS片段和烟草脆裂病毒载体(pTRV2),构建了重组载体pTRV2-GmPDS,并将该重组载体分别转化农杆菌C58C1/pMP90、GV3101和LBA4404,为分析pTRV载体是否可以浸染大豆奠定了基础。