cryIAc基因在转基因玉米中的遗传规律及对抗虫性影响

旨在研究目的基因在转基因植株和后代植株(株系)中的遗传规律及其对转化植株抗虫性的影响。以花粉介导法将cryIAc基因导入玉米自交系‘郑58’和‘昌7-2’,对转化植株及其后代株系进行分子检测和田间抗虫鉴定。结果表明:(1)转化‘郑58’和‘昌7-2’,T1代分别获得转基因植株24和41个,转化率高达20%以上;(2)转基因T2代、杂交F2代及回交1代(B1)的分子检测结果证明,外源基因的遗传符合孟德尔的3∶1、3∶1和1∶1的遗传分离规律;(3)连续多带的分子检测结果还表明,外源基因可稳定遗传并有效表达,表达水平在9.8-14.3 ng/g叶片鲜重之间;(4)抗虫鉴定结果显示,在阴性对照全部感虫情形下,转基因纯合株系仍表现出较高抗虫活性;(5)此外,回交试验结果还证明外源基因通过杂交可传递给下一代;(6)最终经筛选得到SZ003、SZ005、SC001、SC004和SC007五个高抗虫转基因株系。结果表明,花粉介导法是一种高效、快捷的转化方法,cryIAc基因导入玉米自交系植株后赋予和提高了转基因植株的抗虫活性。     

转双价抗虫基因大白菜新种质的获得及其抗虫性分析

采用超声波辅助花粉介导方法,将双价抗虫基因BmkIT-Chitinase导入早熟型大白菜自交系20-19-3,最终获得了5个转基因大白菜优良自交系纯合株系Z1-5、Z2-7、Z9-6、Z11-6和Z20-13;以转基因大白菜株系和非转基因对照植株为材料,对BmkIT-Chitinase基因在大白菜中的遗传规律、基因表达及抗虫性进行进一步分析。结果显示:(1)转化株后代多代(T_1~T_4)PCR、Southern blotting等分子跟踪检测表明,目的基因已成功导入受体植株,且能够稳定遗传;用该转基因方法对大白菜进行基因转化所获得的转基因植株分析显示,外源基因多数以多拷贝形式整合于核基因组,少部分外源基因以单拷贝形式整合。(2)Elisa分析结果证明,所导入的外源基因可高效表达,T4代株系新鲜叶片中表达产物量最高达到0.069μg·g~(-1)左右。(3)转基因株系田间抗虫性统计分析表明,转化株系与对照在抗虫性方面有显著差异,其对小菜蛾及菜青虫抗性普遍提高2~3级。研究认为,转BmkIT-Chitinase基因大白菜中BmkIT-Chitinase基因的表达可有效提高大白菜的抗虫性。     

转基因玉米中目的基因的遗传表达及其抗病性研究

采用花粉介导方法将几丁质酶基因和潮霉素基因导入玉米(Zea maysL.)自交系海92-1中,以筛选抗玉米丝黑穗病的转基因品种.对转化植株及其后代植株的PCR、Southern blot检测表明,目的基因已导入转化植株并整合到其基因组中,且能够稳定遗传.ELISA分析证明转基因植株中目的基因可高效表达,表达产物量在9.8~16.3 ng?g-1鲜叶左右.统计分析显示,目的基因产物表达水平与转基因植株的抗病性呈极显著正相关(r=0.925,P<0.01).接种病毒鉴定结果揭示转基因株系的抗病性比对照提高3~4级.结合农艺性状筛选,选育到401、403这2个抗丝黑穗病且其它农艺性状优良的转基因纯合株系.     

马铃薯块茎特异性启动子驱动的人白细胞介素-12的遗传转化研究

为获得高效表达人白细胞介素-12(h IL-12)蛋白的转基因马铃薯植株,利用根瘤农杆菌侵染法将前期构建的马铃薯块茎特异性启动子Ppatatin驱动的h IL-12植物表达载体导入马铃薯,通过共培养、筛选、分化等过程获得转基因植株,并结合PCR、RT-PCR、GUS染色及ELISA分析对转基因植株进行鉴定。结果显示,获得12个马铃薯转基因株系,PCR检测表明其中的10个株系目的基因已导入马铃薯基因组,转基因阳性率为83%;RT-PCR分析表明其中的7个株系外源基因在转录水平成功获得表达,ELISA分析表明其中的5个株系有明显的蛋白水平表达。对这7个株系后代的检测表明外源基因成功表达且具有良好的遗传稳定性。     

转AtNHX1基因玉米的产生及其耐盐性分析

以玉米(ZeamaysL.)骨干自交系DH4866、齐319和鲁原16106的胚性愈伤组织为材料,采用农杆菌介导法将AtNHX1和hpt基因转入玉米培养细胞,经筛选获得了抗潮霉素的愈伤组织并再生植株。经PCR检测和Southernblot验证,确定了22.8%的再生植株为转基因植株。农杆菌液浓度、愈伤组织基因型及共培养时间对转化率均有明显影响。外源基因在转基因植株后代中的分离呈多样性,在部分株系中表现出孟德尔遗传规律。耐盐筛选表明,一些转基因植株及其后代具有很好的耐盐性,部分株系可在0.8%-1.0%NaCl溶液浇灌下萌发和生长。Northern杂交表明,植株耐盐性提高与AtNHX1基因的转录水平相一致。     

转基因抗矮花叶病玉米的遗传、表达及抗病性研究

目的：研究目的基因在转基因植株及其后代中遗传表达的稳定性,以及目的基因表达与抗病性的关系,最终得到转基因纯合株系。方法：以采用花粉介导法将RDV运动蛋白缺陷型（RDV MP^-）基因导入玉米自交系478的转基因种子（T0）作为试验材料,对其或其后代进行潮霉素抗性筛选、PCR检测、目的基因表达产物含量测定、农艺性状筛选,以及田间接种病毒的抗病鉴定。结果：通过潮霉素抗性筛选从T0种子获得了11株疑似转化植株;对T1、T2、T3代转基因植株的PCR分析证实目的基因已导入玉米植株,并显示随着转化植株世代交替,目的基因可稳定遗传给下一代,且目的基因在待测材料中的检出比例也随着代数的增加而提高;目的基因表达量的测定结果为1．83-11．57ng／mg叶片鲜重之间;田间接种玉米矮花叶病病毒试验结果证明转化植株比对照植株的抗矮花叶病能力有了显著提高,个别株系在T1代的发病率就为0,T1、T2、B代转化植株的抗病性逐代提高,比临近对照的抗病性提高2～5级;目的基因表达量与植株（系）的抗病性显著相关,r=0．923,P〈0．01;入选纯合系的农艺性状也有较大变化,穗粒数比对照系增加约5％。结论：通过以上方法,可以筛选到转基因抗病玉米纯合株系。     

转AtNHX1基因玉米的产生及其耐盐性分析

以玉米(Zea mays L.)骨干自交系DH4866、齐319和鲁原16106的胚性愈伤组织为材料,采用农杆菌介导法将AtNHX1和hpt因转入玉米培养细胞,经筛选获得了抗潮霉素的愈伤组织并再生植株.经PCR检测和Southernblot验证,确定了22.8%的再生植株为转基因植株.农杆菌液浓度、愈伤组织基因型及共培养时间对转化率均有明显影响.外源基因在转基因植株后代中的分离呈多样性,在部分株系中表现出孟德尔遗传规律.耐盐筛选表明,一些转基因植株及其后代具有很好的耐盐性,部分株系可在0.8%-1.0%NaCl溶液浇灌下萌发和生长.Northern杂交表明,植株耐盐性提高与AtNHX1基因的转录水平相一致.     

花粉管介导的转bar基因水稻植株的获得及其遗传

采用花粉管通道法将bar基因导入籼稻品系E32,得到对除草剂Basta具有抗性的转基因水稻。遗传分析表明外源bar基因在受体植株后代中呈单基因显性遗传,在世代间可以稳定遗传。目前已分离出抗性稳定的株系。     

利用微滴数字PCR方法快速分析转基因玉米中外源基因的拷贝数

以玉米自交系501幼胚为受体材料,首先将来自球形节杆菌的EPSPS基因(G23V)按玉米密码子偏爱性进行优化与人工合成,并且将其克隆到表达载体pBAC9200中;然后利用农杆菌介导法将质粒载体转入玉米自交系501的幼胚中。经过愈伤诱导、草甘膦抗性筛选和分化培养最终获得14株转化再生植株。经PCR、RT-PCR检测表明,其中5株目的基因G23V-EPSPS稳定整合且在转录水平获得表达。随后,利用微滴数字PCR技术对外源基因拷贝数进行了检测分析,分析结果表明在5株阳性转基因植株中,外源基因G23V-EPSPS拷贝数分别为0.12、1.0、0.9、1.89和0.66,介于0~2之间。成功建立了草甘膦抗性基因G23V-EPSPS在玉米中的遗传转化体系,为以新型高抗草甘膦G23V-EPSPS基因作为转基因玉米筛选标记基因奠定了基础;而且以微滴数字PCR技术代替传统的Southern Blot简便快速的完成外源基因拷贝数的分析,为微滴数字PCR技术在转基因外源基因拷贝数检测上的广泛应用做了初步的探索。     

转金属硫蛋白及其突变体αα 基因烟草的Tl代性状分析

转金属硫蛋白MT及其突变体αα的烟草自交得到T1代,转基因植株的重金属抗性和除草剂抗性在后代中得到保持.不同的转基因株系在含有除草剂的培养基中萌发时表现出不同的抗性分离比,说明外源基因在植物染色体内可能有不同的整合拷贝数.两种转基因烟草在含有不同浓度Cd的培养基中萌发时表现出高的重金属抗性,其中转αα基因烟草对Cd的抗性优势在T1代种子萌发实验中更加明显.以MTcDNA为探针进行Southernblot杂交,在T0代和T1代同时检测到两种转基因烟草外源基因的存在,证明外源基因确实整合到烟草基因组内并稳定传递到后代.Westemblot结果证明了外源基因在烟草第二代的表达.纯合株系仍需要进一步的筛选.     

导入bar基因的水稻新植株可遗传

江苏省农业科学院粮作所王才林、赵凌、宗寿余等和中科院上海生化所龚蓁蓁等9位科研人员,用花粉管通道法将bar基因导入水稻获得可遗传的转基因植株。亦即他们利用花粉管通道法将抗Basta除草剂的bar基因导入水稻品系E32,获得转基因植株。但在T0代仅表现为部分抗性,T1代全部获得了抗性,T3代全部转基因植株能充分表达对Basta除草剂的抗性。通过对转基因植株后代进行PCR分析,证实了bar基因已整合到受体植株的基因组之中,以后又经过遗传分析表明,bar基因能在有性生殖过程中传递给后代植株,并在T3代开始就可分离出抗性一致的稳定株系。目前,其…     

转金属硫蛋白及其突变体αα基因烟草的T1代性状分析

转金属硫蛋白MT及其突变体αα的烟草自交得到T1代,转基因植株的重金属抗性和除草剂抗性在后代中得到保持,不同的转基因株系在含有除草剂的培养基中萌发时表现出不同的抗性分离比,说明外源基因在植物染色体内可能有不同的整合拷贝数。两种转基因烟草在含有不同浓度Cd的培养基中萌发时表现出高的重金属抗性,其中转αα基因烟草对Cd的抗性优势在T1代种子萌发实验中更加明显。以MT cDNA为探针进行Southern blot杂交,在T0代和T1代同时检测到两种转基因烟草外源基因的存在,证明外源基因确实整合到烟草基因组内并稳定传递到后代。Western blot结果证明了外源基因在烟草第二代的表达,纯合株系仍需要进一步的筛选。     

利用花青素可视化跟踪表达系统快速筛选表达Cry1Ab/c基因的转基因玉米

以草甘膦抗性基因Epsps为标记基因, 在原核Kan^r基因两侧引入Cre(环化重组酶)基因识别的Lox-P位点, 同时以编码花青素合成转录因子的Bi和Cl基因为可视化选择报告基因, 构建了Bt杀虫蛋白基因Cry1Ab/c的可视化跟踪表达载体pBAC9017。用PDS1000/He基因枪转化玉米(Zea mays)自交系501的幼胚和胚性愈伤组织, 获得147个草甘膦抗性的玉米再生植株。其中106棵植株获得了结实种子, 16棵植株的结实种子有紫红色花青素基因的表达。经PCR检测表明, 外源Cry1Ab/c基因已经整合到玉米的基因组中。转基因植株种子蛋白粗提物用BT-Cry1Ab/1Ac金标免疫检测试纸条和ELISA检测, 结果表明, Cry1Ab/c在部分转基因植株后代中表达。     

农杆菌介导法向玉米茎尖导入抗草甘膦EPSPS基因的研究

以玉米自交系郑58的茎尖为受体,通过农杆菌介导法将抗草甘膦EPSPS基因转入玉米中,研究以茎尖为受体的农杆菌转化体系的可行性。98株转化苗,经过300 ppm的除草剂(农达)筛选,共获得13株转基因植株,经PCR检测,其中7株表现阳性,转化率达7.14%。初步证明外源基因已经整合到玉米基因组中,以玉米茎尖作为受体的转化系统用于基因转化是可行、高效的。     

RNA介导的病毒抗性在转基因烟草中的遗传分析

以含非翻译马铃薯Y病毒外壳蛋白(PVY—MCP)基因的抗病和感病T0代转基因烟草为材料,对转基因及RNA介导的病毒抗性在T1～T4代转基因植株中的遗传进行了研究。结果表明,在含低拷贝(1～2个)转基因的感病植株后代中,转基因是作为一个单显性遗传位点,遵循孟德尔遗传分离规律,各世代转基因植株仍表现感病。含多拷贝(4～6个)转基因的抗病植株,转基因在T1代的分离虽符合多位点插入的15：1和63：1遗传规律,但转基因发生了重排,RNA介导的病毒抗性表现为不稳定遗传。从含多拷贝转基因的抗病植株的T1代株系中,分离获得了两株含2个拷贝转基因的抗病植株;其后代中,转基因及抗性遗传遵循孟德尔遗传分离规律,可稳定遗传和表达,获得纯合的抗病转基因株系。对转基因在不同抗病类型植株中整合方式分析显示,抗病植株中多存在转基因的反向串联重复序列。     

基因枪法转基因水稻中hpt基因稳定遗传

基因枪转化将潮霉素磷酸转移酶基因（ｈｐｔ）导入粳稻品种７７１７０,获得可育的转基因植株,研究外源基因遗传的稳定性。自交后代（Ｔ１和Ｔ２）经潮霉素筛选获得抗性植株和敏感植株,分子鉴定结果表明抗性植株带有ｈｐｔ基因,而敏感植株中没有ｈｐｔ基因存在。Ｔ１和Ｔ２代中潮霉素抗性表现为显性单基因位点的遗传方式,符合孟德尔分离规律,并得到分子鉴定结果的证实。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果显示,ｈｐｔ基因多拷贝整合在水     

转OsMAPK4基因烟草的抗旱性研究与遗传分析

以低温处理的水稻辽盐241植株叶片总RNA为模板, 用OsMAPK4基因特异引物通过RT-PCR扩增出OsMAPK4基因, 构建了由E12启动子调控的OsMAPK4基因植物表达载体pBME12。通过农杆菌介导法将OsMAPK4基因导入烟草, 筛选获得25株转基因植株。抗旱性研究结果表明, OsMAPK4基因的超量表达提高了T1代转基因植株的抗旱性。卡那霉素抗性在T1代转基因植株中的分离情况表明, 大多数转基因株系符合单基因遗传规律。     

以胆碱脱氢酶基因对小黑杨花粉植株的遗传转化

以小黑杨（Populus simoniixP．nigra）花粉植株叶片为外植体,用根癌农杆菌介导法将胆碱脱氢酶基因（betA）导入其中,将获得的4株卡那霉素抗性转基因株系进行PCR检测,结果均为阳性。用荧光定量PCR对转基因株系的betA基因转录结果检测表明,4个转基因株系均已表达外源基因,但表达量有差异。对获得的4株转基因株系及对照进行NaCl胁迫处理,当NaCl浓度为0．55％时,非转基因小黑杨花粉植株生根率为0,转基因株系生根率为80％～100％;在NaCl为0．70％～0.80％时,则转基因株系生根率也为0。4个转基因株系的甜菜碱含量显著高于未转基因对照,说明抛融基因的导入提高了转基因株系的耐盐性。     

农杆菌介导籼稻优良恢复系bar基因的遗传转化研究

应用农杆菌介导转化体系,成功地将含有CaMv35s启动子启动的bar基因导入籼稻幼胚来源的愈伤组织,获得籼稻优良恢复系T461、R402和752三个品种（系）共47个抗除草剂Basta的转基因株系,Southem分析结果表明,转基因植株基因组中检测到bar基因的整合,转基因植株自交后代Basta除草剂抗性鉴定表现出分离,且大多数为1-2个整合位点的孟德尔方式遗传。结果表明,根癌农杆菌介导法可以有效且可靠地转化籼稻。     

无载体框架序列转基因小麦中外源1Ax1基因表达框的遗传分析

为了研究无载体框架序列转基因小麦中转基因表达框的遗传规律,选育稳定表达的转基因株系,利用基因枪介导1Ax1基因的最小表达框转化得到了转基因小麦,对其后代转基因植株中1Ax1基因表达框的遗传进行了分析,结果表明：无载体框架结构的1Ax1基因在转基因后代中稳定遗传,在T1代中呈现3:1的分离,遵从孟德尔遗传模式;SDS－PAGE分析表明其中部分转基因后代分离出新的高分子量蛋白亚基分子量略低于1Dx5亚基。