GFP基因转化香樟胚性愈伤组织的研究

以香樟胚性愈伤组织作为受体,利用根癌农杆菌介导法进行了绿色荧光蛋白基因(GFP)的遗传转化研究。经农杆菌侵染后的胚性愈伤组织通过共培养、选择培养后获得抗性愈伤组织和体胚,对抗性愈伤组织及体胚的诱导过程进行了GFP荧光检测。结果表明,GFP基因能在抗性愈伤组织和体胚中强烈表达,证明GFP基因能够在香樟遗传转化中得到应用。对抗性愈伤组织的PCR检测初步证实外源GFP基因已整合到香樟胚性愈伤组织的基因组中。     

根癌农杆菌介导转化水稻成熟胚及转Metr基因植株的获得

以粳稻品种广陵香糯为材料,用携带有双元载体pBB的根癌农杆菌EHA105为载体,研究了根癌农杆菌介导转化粳稻成熟胚愈伤组织的几个影响因素,建立了合适的粳稻成熟胚愈伤组织转化系统。一种基于MS为基本培养基的商品培养基(HRM)较适合于作为粳稻成熟胚愈伤组织诱导培养基,合适的愈伤组织诱导培养天数为7~8 d,合适的筛选培养基为CC培养基。在此基础上,将Metr基因导入粳稻品种广陵香糯中,获得了一批转基因水稻植株,PCR分析表明外源基因已经整合进了水稻的基因组中。部分转基因植株后代遗传分析表明外源基因的分离符合3∶1的理论比例。     

植物根际促生细菌定殖研究进展

植物促生菌(plant grwth-promoting bacterium,PGPB)因可有效抑制根际病原菌,促进植物生长,增加作物产量等作用,在农业生产领域展现出巨大前景。以了解植物根际促生细菌的种类,理解定殖相关的促生机制为目的,展示了根际细菌的定殖过程及影响细菌在根部定殖的因素,通过抗生素标记、免疫学方法、外源基因标记等方法进行定殖微生物的检测,以高通量测序技术在根际定殖中的广泛应用为结果,得出结论应从遗传水平上对菌株进行解读,获得植物根际土壤微生物群落多样性,功能基因等研究,这项工作对预测根际促生细菌与植物的交互作用,生物菌剂的田间应用有重要意义,应是植物根际促生细菌今后的研究方向。     

GFP基因转化藿香的研究

以藿香无菌苗幼嫩茎段为受体,利用根癌农杆菌介导法进行了绿色荧光蛋白基因(GFP)的遗传转化研究。经农杆菌侵染,通过共培养、选择培养后获得其抗性愈伤组织,对抗性愈伤组织的诱导过程进行了GFP荧光检测。结果表明,GFP基因能在抗性愈伤组织中强烈表达,证明GFP基因能够在藿香遗传转化中得到应用。对抗性愈伤组织的PCR检测初步证实外源GFP基因已整合到藿香愈伤组织的基因组中。     

恶臭假单胞细菌与紫花苜蓿在泥炭培养体中结合定殖研究

在植物根系定殖外源微生物是促进植物健康生长和污染土壤修复的重要方法,而植物根部存在适宜的生长空间是外源微生物定殖的关键。利用泥炭是植物和微生物优良的培养基质的特点,将泥炭作为外源微生物和植物根部的结合体,研究在播种时期接种和露根时期接种条件下,恶臭假单胞细菌(AB-92019)在泥炭与苜蓿根系构成的定殖环境中的定殖动态和定殖密度。结果表明:2种定殖时期在泥炭体的定殖效果有明显不同,露根时期接种后第20 d的定殖密度为6.10 logcfu/g干泥炭;播种时期接种定殖密度下降较快,第20 d的定殖密度为5.62 logcfu/g干泥炭。而在苜蓿根系20 d后的定殖密度,播种时期接种(3.90 logcfu/g鲜根)高于露根时期接种(3.03 logcfu/g鲜根)。并且2种时期定殖都不影响苜蓿正常的生长。     

一株水稻促生长内生真菌的绿色荧光蛋白基因标记与示踪

将绿色荧光蛋白基因(gfp)转入到碱蓬内生真菌JP4-1中并检测菌株在水稻幼苗中的定殖情况。采用PEG-Ca Cl2介导的原生质体转化方法将携带gfp基因的p CT74质粒与菌株基因组整合获得转化子,用转化子侵染水稻幼苗,荧光显微镜下示踪JP4-1菌株及其侵染特性。转化子经连续传代6次仍能发出绿色荧光且荧光强度良好,能够稳定遗传;经PCR验证gfp基因已成功转入JP4-1菌株和水稻幼苗植株内并表达。转化可获得稳定表达GFP的JP4-1转化子,JP4-1菌株可定殖于水稻幼苗的根、茎、叶,定殖位置为细胞间隙,其促生作用与野生型菌株无明显差别。     

发根农杆菌介导丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶1基因RNA干扰载体的转化

目的：利用发根农杆菌ACCC10060介导丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶1基因（SmGGPS1）RNA干扰（RNAi）载体转化丹参叶片,生成SmGGPS1的RNAi转基因毛状根。方法：根据已克隆到的SmGGPS1特异区域设计并合成2段RNAi序列,分别插入RNAi双元载体pK7GWIWG2D（Ⅱ）中,构建2个含卡那霉素（Kan）和绿色荧光蛋白（GFP）双筛选标记的植物表达载体pK7GWIWG2D（Ⅱ）-SmGGPS1-RNAi2和pK7GWIWG2D（Ⅱ）-SmGGPS1-RNAi3;利用带有上述2个RNAi载体的发根农杆菌ACCC10060侵染丹参叶片,诱导生成转基因毛状根;通过Kan抗性筛选和GFP绿色荧光观察统计转化率。结果：分别得到SmGGPS1-RNAi2和SmGGPS1-RNAi3转基因毛状根301根和399根,平均转化率为60.34%。结论：首次建立了发根农杆菌介导的外源基因转化丹参的体系。     

优良大麦品种花30幼胚遗传转化体系的优化

以大麦花培基因型花30的幼胚为外植体,设置不同的培养基类型、不同激素配比及碳源,研究其对幼胚愈伤组织诱导及绿苗分化的影响,以此建立和优化一个适于优良大麦品种遗传转化的高效组织培养体系。结果表明:在N6、MS和B5的组合改良培养基下,以蔗糖为碳源,附加2mg/L 2,4-D、1mg/L ABA时,有最高的愈伤组织诱导率,且愈伤质量最好。Cu2+的添加具有抑制幼胚直接发芽成苗和改善愈伤组织质量的双重功效。添加2mg/L 6-BA对愈伤组织的分化效果比较理想。为了提高农杆菌介导转化大麦外源基因的瞬时表达率和优化遗传转化体系,利用花30幼胚产生的愈伤组织为受体材料,通过检测GUS基因的瞬时表达情况,研究了农杆菌介导的大麦遗传转化中菌液的浓度、侵染时间以及共培养天数对遗传转化的影响,结果表明:当菌液浓度OD600=0.5的条件下,侵染15min,共培养2d表现出最佳的GUS瞬时表达率。     

水稻高效再生体系的建立及其对大豆Em基因的转化

以粳稻丰达1号成熟胚为外植体,建立了适合水稻转化的高效再生体系,通过农杆菌介导法将大豆Em基因转化水稻.结果表明:以NMB 500 mg·L-1脯氨酸 250 mg·L-1谷氨酰氨 300 mg·L-1水解酪蛋白 2 mg·L-12,4-D为作诱导培养基诱导愈伤组织,其诱导率为97%;愈伤组织分化率为65%;农杆菌介导法转化水稻愈伤组织,获得了26株再生植株;随机选取其中4株候选转基因水稻幼苗进行PCR筛选,初步证明大豆Em基因已整合到水稻基因组DNA中;RT-PCR检测结果表明,转入的外源大豆Em基因在转基因水稻中得以表达.本实验成功地建立了适合水稻转化的高效再生体系,为通过基因工程技术培育水稻新品种奠定了基础.     

胶烟草叶肉原生质体的植株再生及转化试验

胶烟草叶肉原生质体经培养得到的愈伤组织在含0.5-1.5mg/1 2,4-D的MS培养基上培养40-50天后可形成体细胞胚,2,4-D的浓度在1 mg/1时诱导频率最高,可达45%。体细胞胚在无激素的MS琼脂培养基中即可形成完整植株。通过愈伤组织分化过程中的组织学观察发现,在胚状体形成过程中细胞内淀粉粒呈一动态变化,推测胚状体邻近的愈伤组织细胞在胚状体发育提供营养方面可能起重要作用。利用根癌农杆菌改建的Ti质粒对胶烟草原生质体进行遗传转化,在无激素的MS培养基上筛选得到基因4的转化细胞克隆。电泳法证明T-DNA胭脂碱合成酶基因在转化细胞内表达。     

生防放线菌Ahn75的荧光标记及其在水稻中的定殖

【背景】目前gfp标记基因已成为研究靶标微生物与宿主之间互作的一种重要工具。利用gfp基因标记生防菌株,可以对生防菌株的生存及定殖能力进行有效追踪。【目的】对生防放线菌Ahn75进行荧光标记,探讨其在水稻中的定殖规律,为研究Ahn75的稻瘟病防治机制奠定基础。【方法】首先通过电激转化将含绿色荧光标记基因(gfp)的质粒pIJ8655导入大肠杆菌ET12567中,然后采用接合转移的方法将gfp整合到Ahn75基因组上;通过平板对峙试验检验Ahn75-GFP在标记绿色荧光后对稻瘟病病原菌的抑菌活性;采用喷施孢子液的方式将带荧光标记的Ahn75-GFP定殖水稻,并利用荧光显微镜观察生防菌在水稻中的定殖情况;对定殖水稻中的内生菌进行重分离,探究菌株在水稻组织中的分布规律。【结果】PCR扩增和荧光观察表明,绿色荧光标记基因成功整合到生防放线菌Ahn75中。通过平板对峙试验,发现Ahn75-GFP对稻瘟病病原菌抑菌活性与原始菌株没有显著差别。在荧光显微镜下,可以观察到Ahn75-GFP能稳定定殖于水稻的根、茎、叶等组织中,而水稻内生菌重分离试验表明该菌株在茎中的定殖力最强。【结论】获得一株绿色荧光标记生防菌株Ahn75-GFP,结果显示该菌株定殖水稻效果良好,这对于研究Ahn75的稻瘟病防治具有重要意义。     

内生真菌印度梨形孢诱导小麦抗根腐病作用研究

【目的】明确印度梨形孢(Piriformospora indica)诱导小麦对根腐病产生抗性的作用机制。【方法】用印度梨形孢悬液浸种,以无菌培养液为对照,用病原菌禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)侵染小麦,对其相关生理生化指标及转录组变化进行分析。【结果】禾谷镰孢菌能诱导小麦产生过氧化氢,降低细胞内水含量,破坏细胞膜的稳定性;根部定殖印度梨形孢的小麦细胞内抗氧化酶活性增强,活性氧自由基含量降低,胞内水含量提高,细胞膜稳定性增强;印度梨形孢定殖能改变由于病原菌引起的mRNA转录组变化,抗性相关基因的表达增强。综合表明印度梨形孢定殖能有效地提高小麦对禾谷镰孢菌的抗性。【结论】研究结果为深入理解植物与微生物互作、开发新型高效环保抗根腐病生物制剂提供理论和实验依据。     

内生真菌印度梨形孢诱导小麦抗根腐病作用研究

【目的】明确印度梨形孢(Piriformospora indica)诱导小麦对根腐病产生抗性的作用机制。【方法】用印度梨形孢悬液浸种,以无菌培养液为对照,用病原菌禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)侵染小麦,对其相关生理生化指标及转录组变化进行分析。【结果】禾谷镰孢菌能诱导小麦产生过氧化氢,降低细胞内水含量,破坏细胞膜的稳定性;根部定殖印度梨形孢的小麦细胞内抗氧化酶活性增强,活性氧自由基含量降低,胞内水含量提高,细胞膜稳定性增强;印度梨形孢定殖能改变由于病原菌引起的mRNA转录组变化,抗性相关基因的表达增强。综合表明印度梨形孢定殖能有效地提高小麦对禾谷镰孢菌的抗性。【结论】研究结果为深入理解植物与微生物互作、开发新型高效环保抗根腐病生物制剂提供理论和实验依据。     

根分沁物

鉴于对根部分泌物的广泛观察,我们的评论局限于直接与土壤中根部定殖的微生物有关的近期研究。当根生长在固体培养基而不是液体培养基时,根部的有机物质分泌则成倍的增加。因此,用液体培养植物所做的许多分泌物的研究,与在土壤里生长的植物没有量的关系。分泌作用随着较大的机械阻力而增加,此阻力可能是在压实土壤中,由于Fusarium作用,增加了菜豆根腐烂的一个因子。用~(14)CO_2标记的小麦和大麦插种到沙     

小麦恢复可育基因非配子融合的转移

由于利用了根癌农杆菌作为载体的DNA 转移系统,高等植物中的双子叶植物基因转移 获得了成功。但根癌农杆菌的天然寄生范围仅 限于双子叶植物,因此,单子叶植物的转化尚待 探索其他途经。有人采用单细胞或原生质体摄 取外源DNA,再生成愈伤组织,进而培育成完 整植株‘”。有人为了避开从细胞培养成植株的 某些困难,设想采用配子作为接受外源DNA的 受体,在体外培养花粉,把精子作为显微注射 DNA的靶子,再由花粉管进人子房,通过受精 将外源遗传物质引人到合子,从而形成转化的 胚,再发育为转化的植株［[91。还有人设想,以雌 配子作为显微注射DNA的靶子,将外源DNA 直接注射入卵细胞,然后通过受精,使外源DNA 进人受精卵,发育为转化的胚及转化的植 株^[2,3,5,4,10]。此外,最近有人报道,已经重组了 Ti质粒,可在单子叶植物玉米中作为外源DNA 转移的载体L川。但在单子叶植物的禾本科农作 物中,如小麦、水稻、玉米等,至今仍缺少可行的 外源基因转移技术。     

大麦成熟胚愈伤组织的诱导和植株再生的研究

以10个大麦优良品种为实验材料,成熟胚为外植体,研究基因型、种子的不同切割方式、培养基、激素等对大麦成熟胚愈伤组织的诱导及植株再生的影响.结果表明,种子纵切后接种出愈率显著高于横切;改良MS培养基能提高出愈率;在愈伤组织诱导过程中,不同品种对激素2,4-D与Dicamba的反应表现不同;初代愈伤组织经过3次继代培养后会转变为两种类型的胚性愈伤组织;不同品种的植株再生在不同浓度有机添加物的分化培养基上表现不同;长时间的继代培养,一些品种在植株再生过程中出现一定数量的白化苗.供试材料均能进行愈伤组织诱导,但是只有部分品种能再生植株.本实验筛选出愈伤组织诱导频率和绿苗分化率均较高,适合于遗传转化的受体材料,如87-3175、87-0053、97-4010、97-6004及208813-509.     

GFP基因在棉花转化中的应用

以绿色荧光蛋白GFP基因为报道基因,用花粉管通道和农杆菌介导的转化方法将外源基因导入棉花（Gossypium hirsutum L.)分别获得转化幼胚,幼苗和转化愈伤组织,用手持紫外灯结合显微镜检术能够快速地对转化子进行活体筛选鉴定,比用GUS检测广阔圾明显的优越性,本研究不但为花粉管道道转化法的可行性提供了新的证据。同时也建立了GFP用于棉花基因工程研究的检测技术体系。     

基因枪法转化籼稻胚性愈伤组织获得可育的转基因植株

以籼稻胚性愈伤组织作为基因枪法转化的靶材料,建立了可重复的、高效的籼稻转化系统。从籼稻成熟胚诱导生长３￣４周的愈伤组织,经过２￣６周继代培养后,可以形成足够量的颗粒状胚性愈伤组织。用含有ｂａｒ基因和Ｂ．ｔ．δ－内毒素基因的质粒ｐＦＷＺ１６轰击转化胚性愈伤组织,在含２￣４ｍｇ／Ｌ Ｂａｓｔａ的培养基上进行筛选、预再生、再生及长根培养,并通过干燥处理增加再生频率和出苗数。从接种到获得转化小植株只需要４     

大麦水孔蛋白基因HvTIP2;1及其启动子的表达特性分析

组织特异性启动子作为基因工程的一种重要调控元件,在生物反应器、转基因新品种培育等领域有重要的应用前景。基于芯片数据的基因数字化差异显示分析,筛选到一个根特异表达的大麦水孔蛋白基因Hv TIP2;1,利用实时荧光定量RT-PCR方法了解该基因在不同组织和处理条件下的表达特性,并对基因启动子及功能进行了研究。结果表明,Hv TIP2;1表达具有根特异性并受植物生长发育的调控,其在成株期的表达量明显高于苗期。ABA激素处理组,Hv TIP2;1表现先上升,处理10h后又下降的表达变化趋势;铝、锰有毒金属离子处理组,Hv TIP2;1表达量明显高于对照组,但表现出上升-下降-上升的波动变化特征;盐胁迫导致Hv TIP2;1表达量持续下降,而干旱诱导Hv TIP2;1表达量不断升高,处理24h后表达量迅速下降,低于对照水平。利用PCR方法克隆位于基因编码区上游的启动子序列Hv1310p,该序列含有多个与根特异表达和胁迫响应有关的顺式作用元件。通过5'端缺失法分别构建514bp和1 258bp启动子的融合GUS报告基因表达载体,转基因烟草的GUS活性检测表明两个启动子片段都具有根特异性的启动活性。     

通过PEG法转化甘蓝获得转基因植株

通过PEG法将外源基因导入甘蓝(Brassica oleracea L.)下胚轴原生质体。以潮霉素和卡那霉素进行筛选,均成功地得到了抗性愈伤组织。对于潮霉素抗性愈伤组织,其绝对和相对转化频率分别为4.1×10~(-4)和1％～3％,在分化培养基上,抗性愈伤组织能够分化出芽。诱导生根后进行移栽,生长状况良好。Southem blotting分析表明外源基因已插入到植物细胞基因组中。对影响转化的一些因素进行了探讨。