RNA原位杂交技术的一些应用技巧

目的:检测基因在动物组织或细胞中的时空表达模式。方法:转录反义RNA探针;利用RNA原位杂交技术检测人和小鼠牙原基中若干基因的表达。结果与结论:通过优化条件,转录出完整的反义RNA探针,并成功地利用RNA原位杂交技术在组织中检测到基因的表达;分析了一些在RNA原位杂交的过程中可能碰到的问题及其解决方法。     

地高辛标记Ucp2基因RNA探针的制备和应用

目的:制备用于检测小鼠胚胎早期Ucp2基因表达的地高辛标记的特异性RNA探针。方法:提取小鼠胚胎脑组织总RNA,设计引物,通过RT-PCR方法获取Ucp2基因片段,将其克隆到pGEM-T载体。分别利用Sp6、T7和Ucp2特异性引物,PCR扩增获得转录模板,通过Sp6及T7 RNA聚合酶,获得地高辛标记的正义、反义Ucp2 RNA原位杂交探针。检测标记探针的效价后,通过全胚胎原位杂交分析制备探针的特异性和杂交效果。结果:成功获得Ucp2基因正义、反义探针,反义探针能高效灵敏检测到Ucp2基因在小鼠胚胎Ed9.5、Ed10.5神经系统呈现高表达,而正义探针未能检测到表达信号。结论:成功制备了特异高效的地高辛标记Ucp2 RNA原位杂交探针,为进一步研究Ucp2基因在小鼠胚胎组织中的表达,尤其在神经组织的定位奠定基础。     

应用RNA原位杂交技术研究马尾松针叶中银松素合酶的基因表达

以马尾松（Pinus massoniana Lamb．）银松素合酶（PS）基因为模板,体外转录合成带地高辛标记的反义RNA全长及特异探针,并用这2个探针与马尾松针叶组织石蜡切片进行原位杂交,研究该基因在马尾松针叶中的表达特性以及外界诱导因素对该基因表达的调节特性。结果表明,该基因的转录表达主要集中在针叶的韧皮部;紫外线照射和酵母提取液处理均可使该基因的转录水平明显增加。     

银松素合酶基因地高辛标记RNA探针的合成

目的:体外转录合成银松素合酶(PS)基因地高辛标记反义RNA探针。方法:通过双酶切把PScDNA全长序列接到pBlueskriptⅡKS( )的多克隆位点上;同时,经由NCBI比对确定PScDNA的特异序列,设计含有SalⅠ和XbaⅠ这2个酶切位点的上、下游引物,用PCR法扩增含有该位点的目的片段,并连接到pBlueskriptⅡKS( )的多克隆位点上;最后利用pBlueskriptⅡKS( )上的启动子T7,用T7RNA聚合酶在体外转录合成地高辛标记PS全长及特异序列的反义RNA探针。结果:通过对构建探针的单、双酶切,PCR及电泳鉴定,表明成功合成了PS基因地高辛标记的全长及特异序列的反义RNA探针。结论:RNA探针的合成为后续马尾松PS基因表达的RNA原位杂交研究打下了基础。     

siRNA降低肿瘤细胞端粒酶活性的研究

利用T7RNA聚合酶在体外转录合成针对端粒酶模板RNA(hTR)的两条互补单链RNA,经退火形成siRNA.采用TRAP法检测端粒酶活性,分析siRNA在肿瘤细胞裂解液的干扰作用.结果表明:T7RNA聚合酶可以高效地转录出短的单链RNA,制备的siRNA可明显地降低肿瘤端粒酶的活性,其降低肿瘤端粒酶活性的作用强于等量的反义链RNA.该法廉价、高效、简易,有可能为肿瘤的基因治疗提供一种新的探索途径.     

Cdk2ap1在不同性别鸡胚中的表达

为研究通过抑制消减杂交筛选出的cdk2ap1基因在鸡胚胎发育过程中的表达, 设计cdk2ap1引物并通过 RT-PCR扩增cdk2ap1基因片段, 构建cdk2ap1/pGEM-T重组质粒。以构建的重组质粒为模板, 使用Sp6和T7 RNA聚合酶合成地高辛(dig )标记的正、反义RNA探针, 借助胚胎整体原位杂交技术研究了cdk2ap1在雌雄鸡胚中的表达。结果表明cdk2ap1基因在4.0 d两性胚胎的脑间质、菱脑、听囊、脊神经管、前肢等部位均有表达, 且在雄性鸡胚中的表达量高于雌性; 在雄性鸡胚的生殖脊、后肢部位中该基因有表达但在雌性胚胎对应部位却基本没有表达。鉴于该基因在雌雄鸡胚中的差异表达, 推测cdk2ap1基因在鸡胚性别分化及性腺发育过程中起一定调节作用。     

肝癌细胞AFP基因高水平的转录是受核蛋白成分的促进

利用大鼠甲胎蛋白(AFP)基因片段作为模板,分析大鼠肝癌细胞核蛋白成分对体外转录活性的影响,发现大鼠肝癌含有促进AFP基因体外转录的核蛋白。作为对照．没有发现任何成年大鼠肝核蛋白可以促进AFP基因的体外转录。为了确定促进AFP基因体外转录的核蛋白作用部位,对AFP基因模板5＇端上游序列进行了不同程度的删除,进一步分析核蛋白对删掉5’端上游序列后的模板体外转录的影响,结果表明,AFP基因转录的起始点到255bp这段DNA序列是大鼠肝癌核蛋白促进AFP基因转录必不可少的。以SV40DNA经Pst I酶酶切所得的DNA片段(1216bp和4027bp)代替AFP基因片段作为模板,不存在核蛋白促进体外转录的现象。用AFP基因转录的起始点到 255bp这段的DNA为探针,进行Southwestm印迹分析,结果发现了8种与探针结合的核蛋白。     

性类固醇激素对鲤鱼脑垂体生长激素基因表达的影响

建立核糖核酸酶保护法，检测性类固醇激素对鱼鱼脑垂体生长激素基因表达水平的影响。根据已知的鲤鱼生长激素ｃＤＮＡ设计ＰＣＲ引物，亚克隆克建新的含鲁鱼生长激素ｃＤＮＡ片段的质粒，并以此作为模板，体外转录合成鲁鱼生长激素的反义ＲＮＡ探针，用以检测鲤鱼脑垂体中的生长激素ｍＲＮＡ水平，处于性腺成熟早期的雌性鲤鱼埋植雌二醇５天或１０天后，血液中生长激素水平均显著高于对照组，但其脑垂体的生长激素ｍＲＮＡ水平均没有     

WNK1基因不同转录本在小鼠肾脏中的表达及意义

目的研究WNK1基因长短两个转录本在小鼠肾脏组织中的表达分布特征,为进一步研究它们的生物学功能提供实验数据.方法 RT-PCR扩增两个转录本的特异性片段,Northern印迹杂交证实片段特异性后,将片段克隆入pGEM-T载体中,体外转录同位素标记的正义和反义RNA探针,在小鼠肾脏组织石蜡切片上进行原位杂交检测.结果 WNK1基因长转录本微弱广泛地表达在小鼠肾脏组织上,短转录本特异地表达在小鼠肾脏皮质部的远曲小管上.结论在肾脏,WNK1基因的短转录本是功能性转录本,其编码的蛋白质在生物学功能上可能与其它激酶不同.     

养殖施氏鲟的性腺转录组特征分析

鲟是目前世界上最古老的软骨硬鳞鱼类之一,雌雄个体之间无明显的第二性征。为了解人工养殖下鲟性腺发育的分子特征,研究以人工养殖2龄施氏鲟(Acipenser schrenckii Brandt)为研究对象,对其精巢与卵巢进行转录组测序分析。结果发现,雌雄性腺中共有19690个差异表达基因转录本,其中与性别分化相关基因包括转录因子Dmrt1、Sox9、Foxl2等和生长转化因子Amh、Bmp15、Gdf9等。另外,通过差异表达基因KEGG代谢通路富集分析发现了4条与卵巢发育相关的通路,分别为黄体酮介导的卵母细胞成熟、卵母细胞减数分裂、卵巢类固醇合成、促性腺激素释放激素信号通路。其中,卵巢类固醇合成通路中18个差异表达基因的表达模式暗示了2龄施氏鲟限制卵巢雌激素的合成,但精巢中雄激素的合成未受影响。研究结果为研究鲟性腺分化和发育机制以及今后在m RNA表达水平上鉴定鲟性别提供了基础。     

人TANK结合激酶1的基因克隆、表达及生物活性鉴定

目的:克隆人TANK结合激酶1(TBK1)基因,构建其真核表达载体,检测该基因在293细胞中的表达,并利用萤光素酶报告基因实验检测其生物活性。方法:应用RT-PCR方法,以HeLa细胞RNA为模板,扩增获得TBK1基因,定向克隆到pcDNA3-Flag载体中,以LipofectAMINE2000转染试剂转染pcDNA-Flag-TBK1至293细胞中进行瞬时表达,并利用萤光素酶报告基因实验检测诱导β干扰素(IFN-β)转录的情况。结果:测序结果表明,从人HeLa细胞总RNA中克隆到正确的TBK1基因全长编码序列,利用Western印迹检测其在293细胞中获得有效表达,利用萤光素酶报告基因实验检测TBK1可以诱导IFN-β转录激活。结论:真核表达的人TBK1具有相应的生物学活性,为研究其功能奠定了基础。     

人U6基因POI Ⅲ启动子表达反义VEGF cDNA抑制SMMC-7721肝癌细胞VEGF表达的观察

 由 RNA聚合酶启动子在细胞内转录高浓度反义 RNA是抑制靶蛋白的一种有效手段 ,有报道 POI 启动子转录小分子 RNA存在效率不高 ,带有较多的非特异性序列等缺点 ,为了克服这些问题 ,表达反义 VEGF RNA的人 U6基因表达盒对人肝癌细胞株 SMMC- 772 1 VEGF表达的抑制作用进行了研究 .首先 PCR扩增 2 0 0 bp VEGF c DNA以正、反向插入人 U6 sn RNA.通过测序证实反向插入的正确性 .采用细胞原位杂交 ,RNA酶保护分析 ,Northern印迹来证实反义 RNA表达的情况 ,利用 RT- PCR方法研究了其对人肝癌细胞株 SMMC- 772 1 VEGF表达的抑制效果 .细胞原位杂交结果显示 U6启动子转录产物主要分布于细胞核内 ,细胞浆内亦有表达 ,RNA酶保护分析显示 U6基因 POI 启动子能高表达所需大小反义 RNA,Northern印迹结果显示脂质体 lipo-fectamine介导含 U6基因 POI 启动子的质粒转染人肝癌细胞株 SMMC- 772 1后 1 2 h即有表达且可持续表达 6 d. RT- PCR证实 U6基因 POI 启动子转录的反义 VEGF RNA能有效抑制SMMC- 772 1细胞 VEGF的 m RNA表达 .已有的研究结果揭示 POI 启动子是反义基因治疗中一种好的选择     

黄鳝(Monopterus albus)P450(11β)基因cDNA的克隆和表达分析

11β-羟化酶(11β-hydroxylase)由P450(11β)(Cytochrome P450 11β-hydroxylase)基因编码,是一种重要的线粒体酶,指导合成11-羟睾酮,11-羟睾酮是合成硬骨鱼中最重要的雄性激素11-KT的前体物质,参与精子发生过程。本研究首先利用RT-PCR和RACE技术克隆了黄鳝(Monopterus albus)P450(11β)基因c DNA全长序列,然后利用生物信息学进行了分析,最后利用RT-PCR和荧光定量PCR方法对不同组织的表达情况进行了研究。结果显示:黄鳝P450(11β)基因c DNA全长为1 812 bp,开放阅读框1 632 bp共编码544个氨基酸氨基酸,5'非编码区(5'UTR)9个碱基,3'非编码区(3'UTR)168个碱基。黄鳝P450(11β)基因结构的保守性较高,具有细胞色素P450超家族基因的5个特征区域。氨基酸序列同源性分析表明黄鳝与其他鱼类的同源性在64%~76%之间,与舌齿鲈同源性最高为77%,但与人和老鼠的相似度仅为41.9%和37.7%。系统进化树分析以哺乳类为外群,黄鳝与点带石斑鱼、罗非鱼、舌齿鲈等聚为一大支。基因表达显示黄鳝P450(11β)基因在性腺和脑组织中表达,尤其在精巢中高表达,在卵巢中几乎检测不到。表明该基因对精子发生和精巢发育过程起着一定的作用。     

黄鳝性腺自然逆转过程中vasa基因的表达分析

本研究采用RNA反义探针原位杂交技术,对vasa基因在黄鳝(Monopterusalbus)性腺发育过程中的表达情况进行了分析。结果表明:vasamRNA在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期卵母细胞的胞质中均匀分布,在Ⅳ、Ⅴ期卵母细胞中vasamRNA有向胞质外周皮层迁移集中的趋势,但不明显;退化的卵粒也呈现vasamRNA阳性反应;在Ⅲ、Ⅳ期卵巢的被膜中检测到带有vasa阳性信号的细胞,这些细胞可能是待向精原细胞分化、迁移到卵巢被膜上的原始生殖细胞(Primordialgermcell,PGC),在性逆转过程中这些PGC可能由卵巢被膜迁移到精小叶中并发育成精子;在成熟精巢中,vasa在精原细胞和初级精母细胞中表达。进一步采用碱性磷酸酶染色法分析黄鳝卵巢及精巢后发现:在卵巢中,除了卵母细胞外,卵巢被膜中也检测到了带有碱性磷酸酶阳性信号的细胞;在成熟精巢中,只在生殖腺囊内的雄性生殖细胞中检测到碱性磷酸酶,而精巢被膜中没有检测到带有碱性磷酸酶阳性信号的细胞。本研究结果初步表明:黄鳝的雄性生殖细胞可能起源于雌性阶段卵巢被膜中的原始生殖细胞[动物学报51(3):469-475,2005]。     

真核基因启动子非依赖的功能转录延伸复合物的体外组装

真核生物RNA聚合酶Ⅱ的持续合成能力对基因转录过程中每一个阶段,包括启动子脱离、转录暂停、转录终止以及转录偶联DNA损伤修复过程的调节至关重要.在RNA聚合酶Ⅱ介导的转录延伸过程中,其和模板DNA及转录产物RNA紧密结合,形成一个非常稳定的延伸三维复合物(elongationcomplex,EC).此特征性“泡”状结构的形成是RNA聚合酶Ⅱ持续合成能力所必需的.在不依赖启动子及众多转录起始因子的条件下,利用人工合成的RNA与DNA寡核苷酸,在体外组装形成具有功能转录活性的延伸复合物.结果表明,长度为9个核苷酸的RNA与模板DNA形成的杂合分子对转录延伸复合物的形成是必需的,而非转录模板DNA链的加入导致最终活性转录“泡”状复合物的形成,并可转录形成与模板相关的转录产物,进一步通过在模板DNA的特定位置引入一个乙酰氧乙酰氨基芴修饰基团,可特异性地阻断转录延伸过程,从而显示该系统在研究真核基因转录及转录偶联DNA损伤修复机制中的潜在应用价值.     

RNA干扰技术及其应用

RNA干扰（RNAi)是利用具有同源性的双链RNA诱发序列特异的转录后基因沉默的现象。它可以通过抑制蛋白表达模拟基因敲除技术,从利用体外合成双链RNA到通过质粒稳定表达小型干扰RNA诱发RNA干扰现象,这项技术被不断完善,并被广泛的应用,尽管RNAi的作用机制仍不清楚,但实验证实在RNA干扰过程中,外源的双链RNA在体内会被切割成小片段,新的双链RNA被合成,从而RNAi的作用机制假说正被逐步修正,由于RNAi技术的高效性和特异性,它已经成为基因功能研究的一种新方法。     

口蹄疫病毒3D基因的克隆表达及功能分析

利用RT-PCR技术扩增了口蹄疫病毒(FMDV)编码RNA依赖的RNA聚合酶的3D基因,并将其克隆到原核表达质粒载体pET-28a(+)中.3D基因经测序确认后在大肠杆菌BL-21中表达,表达产物纯化的目的蛋白进行Western-blotting检测,获得分子量约55KDa的单一3D基因表达产物.利用RNA体外复制体系和荧光定量PCR技术,证明纯化的3D基因表达产物RNA依赖的RNA聚合酶具有较高的酶活性,可以在体外从头合成FMDV RNA,且主要以引物依赖的方式合成病毒基因组.     

口蹄疫病毒3D基因的克隆表达及功能分析

利用RT-PCR技术扩增了口蹄疫病毒(FMDV)编码RNA依赖的RNA聚合酶的3D基因,并将其克隆到原核表达质粒载体pET-28a( )中。3D基因经测序确认后在大肠杆菌BL-21中表达,表达产物纯化的目的蛋白进行Western-blotting检测,获得分子量约55KDa的单一3D基因表达产物。利用RNA体外复制体系和荧光定量PCR技术,证明纯化的3D基因表达产物RNA依赖的RNA聚合酶具有较高的酶活性,可以在体外从头合成FMDVRNA,且主要以引物依赖的方式合成病毒基因组。     

斑马鱼胚胎发育过程中FGF3基因的表达

为了解斑马鱼胚胎发育过程中FGF3基因的时空性表达情况,并探讨其对胚胎发育的调控作用,该研究分别提取2,4,8,12,24,36,48,72hpf斑马鱼胚胎的总RNA,经逆转录成cDNA,实时荧光定量PcR检测FGF3基因mRNA表达量;扩增FGF3基因特异片段,构建pGEM-T／FGF3基因片段重组质粒,经克隆及测序验证后,合成地高辛标记的反义RNA探针,以整体原位杂交法检测斑马鱼胚胎FGF3基因的空间性表达。结果显示：FGF3P基因在2hp胚胎就有表达,并持续至胚胎孵化,12hpf胚胎FGF3表达量达到高峰（P〈0．01）;胚胎发育过程中心表达部位以头、尾、咽弓为主。由此得出结论,FGF3主要在胚胎发育早期表达,其表达可能与胚胎脑、眼、耳、咽弓及尾部器官的发育调控有关。     

用T7RNA聚合酶体外转录合成大鼠肝tRNA~(Ile)

采用PCR技术从rec M1 3mp1 8中扩增出 1 2 0bp的大鼠肝tRNAIle合成基因片段 ,经限制性内切酶BstNⅠ酶切后作为模板 ,利用T7RNA聚合酶在体外无细胞体系转录由T7启动子带动的大鼠肝tRNAIle基因 ,生成不含修饰碱基的tRNAIle,并对体外转录反应条件进行了优化 ,回收的tRNA产量可达DNA模板量的 4 0倍