版纳微型猪近交系GHR基因克隆及生物信息学分析

目的获得版纳微型猪近交系(BMI)生长激素受体基因(GHR)序列,通过生物信息学分析预测GHR功能并进行GHR mRNA多组织表达谱分析。方法以版纳微型猪近交系的肝脏组织为材料提取RNA,RTPCR方法扩增GHR基因编码区序列,将序列连接至pMD18-T载体进行克隆、测序和生物信息学分析;半定量PCR检测GHR mRNA在BMI不同组织中表达量的差异。结果克隆出了BMI GHR编码区序列,提交GenBank获得登录号KC999114。该基因CDS长1917 bp,编码638个氨基酸。生物信息学分析表明,与长白猪的GHR序列相比BMI存在4处氨基酸替换,分别为p.E381D、p.A409S、p.L556V和p.A580G,均发生在胞内域。GHR基因多组织表达谱分析显示:GHR mRNA几乎在各组织中均有表达,在肌肉中表达量最高,在小肠、心、肝、神经纤维、脾、卵巢中表达量较高,在肺、胃、大脑、胰和肾中的表达量较低。结论成功克隆了版纳微型猪近交系GHR全长编码区序列,进行了生物信息学功能分析和组织表达谱分析,为进一步阐明版纳微型猪近交系生长矮小机理奠定了基础。     

版纳微型猪近交系 GHR 基因克隆及生物信息学分析简

目的 获得版纳微型猪近交系（BMI）生长激素受体基因（GHR）序列,通过生物信息学分析预测GHR功能并进行GHR mRNA多组织表达谱分析.方法 以版纳微型猪近交系的肝脏组织为材料提取RNA,RT-PCR方法扩增GHR基因编码区序列,将序列连接至pMD18-T载体进行克隆、测序和生物信息学分析;半定量PCR检测GHR mRNA在BMI不同组织中表达量的差异.结果克隆出了BMI GHR 编码区序列,提交GenBank获得登录号KC999114.该基因CDS长1917 bp,编码638个氨基酸.生物信息学分析表明,与长白猪的GHR序列相比BMI存在4处氨基酸替换,分别为p.E381D、p.A409S、p.L556V和p.A580G,均发生在胞内域.GHR基因多组织表达谱分析显示：GHR mRNA几乎在各组织中均有表达,在肌肉中表达量最高,在小肠、心、肝、神经纤维、脾、卵巢中表达量较高,在肺、胃、大脑、胰和肾中的表达量较低.结论 成功克隆了版纳微型猪近交系GHR全长编码区序列,进行了生物信息学功能分析和组织表达谱分析,为进一步阐明版纳微型猪近交系生长矮小机理奠定了基础.     

版纳微型猪近交系AQP3克隆、序列分析及组织表达

目的 克隆版纳微型猪近交系aquaporin 3(AQP3)基因,并利用生物信息学方法分析其序列特征,研究其在猪各组织中的表达情况.方法 从版纳微型猪近交系脾脏中提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增猪AQP3编码区序列,将纯化的片段与pMD18-T载体连接,转化宿主菌DH 5α,筛选阳性克隆进行测序.并采用半定量RT...     

版纳微型猪近交系SRY基因编码区序列克隆及生物信息学分析

目的获得版纳微型猪近交系(BMI)SRY基因编码区序列并进行分子系统进化研究。方法以看家基因GAPDH为内参,对BMI猪的SRY基因编码区序列进行PCR扩增、克隆和序列分析,并应用Lasergene、Bi-oEdit、ClustalX、MEGA等生物信息学软件同鲸鱼、海豚、鹿、绵羊、牛、海豹、马、海象、熊猫、人、驴、熊、猫、虎和美洲豹等15个物种相应SRY编码区核苷酸序列和氨基酸序列进行了比对分析,在此基础上采用NJ和ME法对其编码区氨基酸序列构建了分子系统进化树。结果 BMI猪SRY基因编码区序列长711 bp,编码236个氨基酸,GenBank登录号为GU991615。BMI猪与鲸鱼、海豚、鹿、绵羊、牛、海豹、马、海象、熊猫、人、驴、熊、猫、虎和美洲豹的SRY基因编码区核苷酸序列相似性分别为83.7%、82.8%、78.4%、78.0%、76.9%、73.3%、73.1%、73.0%、72.9%、72.7%、72.7%、72.2%、71.6%、71.3%、70.8%,相应的氨基酸序列相似性分别为72.8%、54.5%、67.3%、64.5%、61.5%、61.9%、59.5%、61.4%、62.0%、59.1%、59.0%、62.0%、59.6%、59.6%、59.2%。结论 BMI猪同鲸鱼等15个物种的SRY基因编码区核苷酸和相应氨基酸序列具有较高的保守性。NJ和ME方法聚类构建的分子系统进化树表明,BMI猪与牛、绵羊、鹿聚为一个分支,符合分类学地位,它们分别为偶蹄目下的猪科、牛科和鹿科动物。     

巴马小型猪TNF-α基因的克隆与相关生物学信息分析

本研究旨在分析巴马小型猪TNF-α(tumor necrosis factor-alpha)基因的遗传变异情况。实验采用RT-PCR和克隆的方法成功扩增TNF-α基因的编码区序列,同时对TNF-α基因和相应的蛋白序列进行生物信息学分析。结果表明,巴马小型猪TNF-α基因编码区全长为699 bp,编码232个氨基酸;与Gen Bank中已发表的猪TNF-α基因(登录号:NM_214022.1)序列进行比对,未发现核苷酸碱基突变;编码的232个氨基酸分子量为25 253.9,理论等电点为5.44,不存在信号肽,但存在跨膜螺旋结构。经过序列相似性分析,巴马小型猪的TNF-α基因与猪、人、马、牛、家犬、绵羊同源性比较结果表明其具有较强的保守性。巴马小型猪的TNF-α基因与野猪的亲缘关系一致。     

版纳微型猪近交系133家系SLA-DQ cDNA的克隆和序列分析

目的阐明版纳微型猪近交系133家系(BMI-133)免疫相关基因及其可能在猪-人异种器官移植中的作用。方法提取外周血总RNA,通过反转录、cDNA合成及转化,最终获得了具有完整阅读框架的SLA-DQA和SLA-DQBcDNA克隆。结果序列分析表明,所获得的DQAcDNA长度为830bp,编码255个氨基酸残基;DQBcDNA长度为1103bp,编码262个氨基酸残基。结论和其他已报道的小型猪比较,本研究克隆的序列无论在核苷酸还是氨基酸水平上都与之存在差异,由此确定这是BMI-133的两个特有的新等位基因。另外,通过与人的相应序列对比发现,BMI-133与人类相应基因相比具有较高的同源性。随着研究的深入,BMI-133家系极有可能成为供异种器官移植的专用近交系猪群。     

人参euFUL基因的克隆与生物信息学分析

旨在研究人参(Panax ginseng C.A.Meyer)花的形成,根据GenBank数据库中基因片段设计特异引物,利用cDNA快速末端扩增方法(RACE),克隆了人参花中一个5'端部分缺失euFUL(命名为PgFu L)的编码区序列。获得的Pg FUL基因由867个核苷酸组成,编码212个氨基酸。生物信息学分析结果显示,PgFUL编码蛋白分子质量为24.64 k D,等电点p I5.80,不含信号肽,无跨膜区。二级结构中α-螺旋结构占60.19%、延伸链占5.21%、无规则卷曲占34.60%。序列比对和系统进化分析表明,PgFUL人参PgMADS protein3(BAK20018.1)的序列同源性为100%,与加拿大蝙蝠葛(AGX01589.1)相似度达95%,属于A功能基因中的eu FUL进化系。     

陆川猪FAM134B基因克隆及生物信息学分析

本试验旨在对陆川猪FAM134B基因进行克隆及生物信息学分析。本研究利用Gen Bank公布的猪序列设计引物,应用RT-PCR扩增得到目的基因片段,应用生物信息学方法分析和预测了陆川猪FAM134B基因的理化性质与二级结构。结果显示:陆川猪FAM134B基因编码区全长1 107 bp,编码368个氨基酸;陆川猪FAM134B基因与与金华猪(JX854456.1)、牛(KM587693.1)、山羊(KF684947.1)、人(NM_001034850.2)、小鼠(NM_001034851.2)、大鼠(NM_001034912.1)、非洲爪蟾(NM_001126975.1)序列相似性分别为87.80%、87.44%、86.9%、68.47%、67.01%、67.29%、61.44%,结合系统进化树分析,结果表明不同物种FAM134B基因在进化过程中具有高度保守性。通过比较分析发现,陆川猪FAM134B基因CDS序列区比NCBI公布的金华猪FAM134B序列(JX854456.1)多了一段129 bp序列,比预测的猪FAM134B序列(XM_003483804.2)少了一段371 bp,这提示所扩增得到的陆川猪FAM134B基因有可能是另外一种剪接体。本研究成功克隆陆川猪FAM134B基因完整的CDS序列,为今后FAM134B基因在陆川猪的脂肪沉积及脂肪代谢方面的研究提供基础理论。     

水稻条叶枯病毒(RStV)基因组组分4的克隆与序列分析

利用RTPCR技术合成并扩增了水稻条叶枯病毒(RStV)中国云南分离物基因组组分4的全长cDNA,将PCR产物克隆在载体pCRII上,并进行全序列测定,所得核苷酸序列及推测的氨基酸序列与日本分离物T进行比较。结果表明,在核苷酸水平,两分离物的vORF、vcORF及基因间非编码区序列的同源性分别为94.9%、94.1%、86.1%,5’端非编码区序列相同,而3’非编码区同源性为96.1%,仅有两个核苷酸不同;在氨基酸水平,vORF及vcORF编码蛋白的同源性分别为99.4%和98.3%。可见,编码区的大小及其氨基酸序列和两末端序列都是很保守的。因此,中国云南分离物Y与日本分离物T可能有很近的亲缘关系。     

苹果乙烯不敏感基因EIN2片段的克隆及序列分析

分别以苹果果实总DNA和cDNA为模板,采用PCR、RT-PCR方法扩增、克隆乙烯不敏感基因(ethyleneinsensitive 2,EIN2),并利用生物信息学方法分析其核苷酸序列和蛋白质结构。结果表明:(1)以DNA和cDNA为模板的扩增结果完全相同,扩增的EIN2基因片段为4 378bp,尚未发现有内含子,开放阅读框全长3 282bp,编码1 093个氨基酸;苹果EIN2相对分子质量为118.9kD,等电点为5.52,其蛋白可能为脂溶性疏水蛋白。(2)所克隆苹果EIN2基因编码的氨基酸序列与拟南芥(AAD41077.1)、碧桃(ACY78397.1)和葡萄(CAN66374.1)EIN2基因编码的氨基酸序列一致性分别为52%、79%、62%。(3)构建的EIN2基因进化树显示,拟南芥、小盐芥、甜瓜、杨毛果EIN2基因亲缘关系较近,聚为一类;葡萄为一类;蒺藜苜蓿为一类;碧桃、矮牵牛、西红柿聚为一类;苹果单独为一类。而且苹果EIN2基因与碧桃等同源基因的亲缘关系相对较近,与拟南芥、小盐芥同源基因的亲缘关系相对较远。     

谷子肌动蛋白基因的克隆及序列分析

以谷子 (Setariaitalica)为材料 ,提取总RNA。根据植物肌动蛋白基因编码区的两端的保守序列设计了简并引物 ,用 5’RACE方法扩增出了谷子肌动蛋白基因编码区序列。以豌豆肌动蛋白cDNA作探针进行的Southern杂交分析表明扩增出了目的基因。将所获得的片段克隆到T载体后进行测序 ,序列分析结果表明 :谷子肌动蛋白基因的编码区长 1 1 3 1个核苷酸 ,编码了 3 77个氨基酸 ;所得序列 (命名为MIAc)与GenBank中注册的肌动蛋白基因序列的相似性均在 6 0 %以上 ,与其它肌动蛋白氨基酸序列的相似性达 89%以上。根据高等植物肌动蛋白序列相似性重建了进化树 ,表明谷子肌动蛋白与水稻肌动蛋白异型体RAc2和RAc3之间的亲缘关系最为密切 ,在进化过程中分化时间最为接近     

手足口病病例肠道病毒CVA12型的鉴定及VP1基因特征分析

目的运用分子生物学方法对长沙市1例手足口病(Hand foot and mouth Disease,HFMD)患者咽拭子标本进行未分型肠道病毒的鉴定及VP1基因特征分析。方法采用兼并引物RT-PCR扩增病毒VP1区片段,BLAST比对确定其型别;特异性引物扩增VP1区基因全长,测定序列进行分析。结果所得序列BLAST比对分析为Coxsackievirus A12(CVA12)型肠道病毒;病毒VP1区基因序列全长为888bp,编码296个氨基酸,同源性分析显示与国内外CVA12毒株核苷酸同源性介于81.9%~98.4%之间;氨基酸同源性在95.3%~100.0%之间。与CVA12美国标准株Texas-12核苷酸同源性为81.9%,氨基酸同源性为95.3%。系统进化表明,长沙市CVA12与国内毒株亲缘关系较近,而与日本、美国则亲缘关系较远。结论从1例手足口病轻症病例中鉴定出CVA12型肠道病毒,该病毒VP1区基因进化特征与国内CVA12毒株亲缘关系近。     

贵州黑山羊、黔北麻羊IL-2基因的克隆与生物信息学分析

为获得贵州特色品种黑山羊与黔北麻羊IL-2基因,本试验以Con A刺激的贵州黑山羊与黔北麻羊外周血淋巴细胞为材料,采用RT-PCR方法分别扩增贵州黑山羊与黔北麻羊IL-2基因,进行克隆与生物信息学分析。结果显示,(1)贵州黑山羊与黔北麻羊IL-2基因核苷酸与氨基酸一致性为100%,完整编码阅读框大小为468 bp,编码155个氨基酸;(2)黔北麻羊、贵州黑山羊IL-2基因与Gen Bank中羊源IL-2基因核苷酸一致性为95.9%~100%,氨基酸一致性为91.1%~100%;(3)遗传进化树结果表明,贵州黑山羊与黔北麻羊IL-2基因处于同一进化分支,与羊源IL-2基因亲缘关系较近;(4)生物信息学分析结果显示,IL-2蛋白二级结构中以α螺旋与无规则卷曲较多,该蛋白为亲水性蛋白,含信号肽序列,无跨膜结构,无特征功能结构域;(5)不同动物IL-2蛋白的抗原性分析存在差异,贵州黑山羊/黔北麻羊IL-2蛋白与羊源IL-2蛋白的比较差异较小,与人和其它动物的比较差异较大。由此得出结论,获得贵州黑山羊与黔北麻羊IL-2基因完整编码区序列,二者核苷酸与氨基酸序列一致。贵州黑山羊/黔北麻羊IL-2基因与羊源IL-2基因亲缘关系近,预测其编码的蛋白为亲水性的分泌型蛋白,不同动物IL-2基因抗原性存在差异。     

易变山羊草抗禾谷孢囊线虫基因中核苷酸结合位点区(NBS)的克隆及序列分析

 大部分已克隆的植物抗病基因都包含有核苷酸结合位点区 (NBS)和富含亮氨酸的重复序列区 (LRR) .利用来自节节麦的抗禾谷孢囊线虫基因Cre3位点NBS区保守序列设计特异引物 ,从含有来自易变山羊草的抗禾谷孢囊线虫基因的小麦品系E 10的基因组中PCR扩增得到一条约 5 30bp的单一条带 .将扩增条带克隆和序列分析发现 ,该克隆 (Rccn4 )的编码区长 5 2 8bp ,含一个不完整的开放读码框 ,没有起始密码子、终止密码子和内含子结构 ,它编码一个 176个氨基酸残基的蛋白质 ,分子量为 2 0 4kD .Rccn4含有NBS LRR类抗病基因NBS区共有的保守模体I(V)LDD、T(T S)R、G(L S)PLA(A I L)、RCF(A L)Y ,并且与Cre3基因的NBS编码区核苷酸和氨基酸同源性分别为99 4 %和 98% .它是一个新的含NBS编码区核苷酸的抗禾谷孢囊线虫基因     

内蒙古白绒山羊翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)基因克隆及组织表达特性分析

旨在克隆内蒙古白绒山羊翻译控制肿瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein,TCTP)基因并分析其表达模式。采用RT-PCR技术扩增TCTP基因编码区cDNA序列,将得到的基因cDNA序列及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析,利用定量RT-PCR方法检测TCTP基因在绒山羊不同组织中的表达特异性。获得的内蒙古白绒山羊TCTP基因编码区cDNA序列全长519 bp,包含了完整的ORF,编码172个氨基酸残基组成的蛋白质。核苷酸序列与绵羊、牛、猪、人、猴及大鼠的同源性在99%-95%之间。生物信息学分析表明,编码的蛋白质理论分子质量19.6 kD,等电点(pI)4.673,含有一个N端糖基化位点,一个蛋白激酶C磷酸化位点,3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,定位于细胞质中。定量RT-PCR方法检测表明,TCTP基因在绒山羊肾脏、肌肉、胰腺、肝脏、睾丸和脑组织中均有表达,其中在肝脏中的表达量较高,在脑中表达量较低。     

山羊卵泡刺激素α亚基cDNA的分子克隆与序列分析

从新屠宰的雌山羊脑垂体中提取总RNA ,反转录获得cDNA .以此cDNA为模板用PCR法扩增目的片段 ,获得长为 380bp的山羊卵泡刺激素α亚基cDNA片段 .将它克隆至pMD 18 T Verctor.随机挑选 3个阳性重组子进行测序 ,将测序结果与绵羊、牛、猪等多种哺乳动物该基因的核苷酸序列及相应氨基酸序列进行比较 .结果表明 ,山羊卵泡刺激素α亚基基因氨基酸序列与绵羊、水牛的同源性最高 ,达 96 % ,与牛的同源性达 95 % ,与人的同源性较低 ,为 74 % .山羊卵泡刺激素α亚基基因编码区的核苷酸与绵羊的同源性最高 ,达 95 % ,与水牛、牛的同源性达 94 % ,与马和大鼠的同源性较低 ,为 85 % .总体来看 ,在哺乳类动物中FSHα亚基基因同源性还是很高的 .     

牦牛ZP3基因的克隆及蛋白质结构的预测

本研究对牦牛ZP3基因的编码区进行了克隆,在此基础上对ZP3蛋白的分子结构预测,为研究牦牛受精生物学提供基础。根据GenBank中普通牛的ZP3核苷酸序列设计特异性引物,以牦牛卵巢组织总RNA为模板,通过RT-PCR技术扩增牦牛ZP3基因cDNA序列(GenBank登录号为GQ856646),利用DNAMAN生物软件进行核苷酸和氨基酸序列分析、蛋白质专家系统ExPASy进行ZP3蛋白质分子结构预测。结果表明,扩增出的牦牛ZP3基因编码序列长1 266 bp,编码421个氨基酸。牦牛与牛、猪、狗、人、鼠和鸡ZP3基因核苷酸相应序列的同源性分别为98.42%、96.73%、79.67%、78.71%、69.15%和56.61%,氨基酸同源性分别为98.10%、83.85%、74.24%、70.26%、62.62%和46.12%,符合物种进化规律。预测的ZP3蛋白二级和三级结构显示它是一个具有22个氨基酸信号肽的亲水性β-桶状跨膜蛋白。牦牛ZP3基因编码区的成功克隆,为进一步研究该基因的结构与功能及其在受精过程中的作用提供了基础。     

谷子肌动蛋白基因的克隆及序列分析

以谷子（Setaria italica）为材料,提取总RNA。根据植物肌动蛋白基因编码区的两端的保守序列设计了简并引物,用5'RACE方法扩增出了谷子肌动蛋白基因编码区序列。以豌豆肌动蛋白cDNA作探针进行的Southern杂交分析表明扩增出了目的基因。将所获得的片段克隆到T载体后进行测序,序列分析结果表明：谷子肌动蛋白基因的编码区长1131个核苷酸,编码了377个氨基酸;所得序列(命名为MIAc)与GenBank中注册的肌动蛋白基因序列的相似性均在60%以上,与其它肌动蛋白氨基酸序列的相似性达89%以上。根据高等植物肌动蛋白序列相似性重建了进化树,表明谷子肌动蛋白与水稻肌动蛋白异型体RAc2和RAc3之间的亲缘关系 最为密切,在进化过程中分化时间最为接近。     

山羊磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶生物信息学分析

旨在克隆山羊磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)基因cDNA全序列并进行序列分析.提取山羊睾丸中总RNA,利用RT-PCR和RACE技术,扩增山羊PHGPx基因cDNA序列并对其生物信息学进行分析.结果表明,山羊PHGPx基因cDNA序列全长844 bp,共编码199个氨基酸;山羊与牛、猪、人和小鼠的氨基酸序列同源性均大于90％;山羊PHGPx蛋白二级结构功能区域属谷胱甘肽过氧化物酶家族,预测23-24和28-29氨基酸位点有潜在的信号肽位点;UPGMA算法构建该物种间分子系统进化树,山羊与牛先聚为一类,再分别与猪、鼠、人、鸡聚类,最后与蜜蜂聚类,与物种动物学分类基本吻合.首次克隆了山羊PHGPx基因,具有GSH-Px家族典型特征,研究结果将为PHGPx基因表达分子调控研究提供一定的理论依据.     

新城疫分离毒HN蛋白的抗原性初步分析及分子特性研究

运用针对NDV囊膜糖蛋白(HN)的单克隆抗体(MAbs),对2005～2006年间自我国江苏和广西部分地区的20株NDV分离株进行排谱试验,初步分析了不同毒株之间HN蛋白的抗原表位差异;并应用RT-PCR技术成功扩增了其HN基因整个编码区,经克隆、测序最终获得13株鸡源NDV与7株鹅源NDV HN基因的编码区序列,分析测定核苷酸序列及推导的氨基酸序列,并将鹅源NDV与鸡源NDV相应序列进行了比较.结果单抗排谱试验表明,20株NDV分离株之间HN蛋白的抗原表位存在差异;测序结果表明,测定的HN基因的编码区长度皆为1716nt编码571个氨基酸;分离株中18株基因Ⅶ型NDV分离株之间HN基因编码区核苷酸序列具有较高的同源性,达94.8%～100%;与近几年国内流行的其它基因Ⅶ型NDV之间的核苷酸序列同源性为92.1%～99.6%.对其推导的HN蛋白一级结构中潜在的糖基化位点及HN蛋白细胞受体结合相关区域的氨基酸序列等进行了比较分析.结果显示,单抗排谱差异显著株在部分氨基酸位点发生了突变;同时揭示我国部分地区同期流行的鹅源NDV与鸡源NDV HN基因之间具有较近的亲缘关系.