PI3K/AKT/NF-κB轴调控胃癌细胞HGC-27增殖

目的:构建磷酸化AKT1(Ser473)位点突变真核表达载体,并检测PI3K/AKT/NF-κB信号通路轴对胃癌细胞增殖的影响。方法:以带有pcDNA3.0-Flag标签的AKT1质粒为模板,扩增出AKT1(Ser473A)(丝氨酸突变成丙氨酸)位点突变编码序列,将其插入pcDNA3.0-Flag载体中,双酶切和测序验证后瞬时转染人胚肾293T细胞,Western印迹检测其表达情况;将突变质粒与空载体分别转染胃癌细胞HGC-27,通过Western印迹检测其下游基因核转录因子κB(NF-κB)在蛋白水平的变化;通过CCK-8法检测对细胞生长曲线的影响。结果:双酶切和测序结果表明,pcDNA3.0-Flag-AKT1(Ser473A)真核表达质粒构建成功;转染293T细胞后获得表达;转染胃癌细胞HGC-27后,Western印迹验证去磷酸化AKT1(Ser473A)可下调NF-κB的蛋白水平(P0.01);细胞生长曲线结果显示,转染pcDNA3.0-Flag-AKT1(Ser473A)较空载体细胞生长慢(P0.01)。结论:PI3K/AKT/NF-κB信号通路轴在胃癌发生发展过程中发挥重要作用。     

雌激素受体α磷酸化位点突变体T224A和S559A的构建及其转录激活活性检测

目的:构建雌激素受体α(ERα)T224A和S559A磷酸化位点突变体载体,在HEK293T细胞中检测其表达及突变体生物活性的改变。方法:以pc DNA3-Flag-ERα为模板,通过重组PCR技术扩增目的基因片段并突变碱基,插入pc DNA3-Flag载体;将构建的质粒转染HEK293T细胞进行瞬时表达,通过Western印迹检测融合蛋白的表达,采用萤光素酶报告基因方法检测ERα突变体的活性改变。结果:T224A和S559A磷酸化位点突变体在HEK293T细胞中得到表达,相对分子质量为66×103。在无雌激素(E2)时,野生型ERα及T224A和S559A突变体的转录活性分别为空载体的1.94、1.49和1.84倍;在雌激素存在时,野生型ERα活性增强了1.57倍,T224A和S559A突变体活性分别增强了0.54和0.61倍。结论:224位Thr磷酸化修饰对ERα的活性起重要作用,且2个磷酸化位点突变体受雌激素调控减弱。     

人自噬相关基因5真核表达载体的构建及表达鉴定

目的:构建带Flag标签的自噬相关基因5(ATG5)的真核表达载体,获得Flag-ATG5融合蛋白。方法:以人乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增人ATG5编码序列,将其插入pc DNA3-Flag载体,转染人胚肾293T细胞后,Western印迹检测其表达情况;将该重组质粒与ATG12表达质粒共转染293T细胞,通过免疫共沉淀法检测2个蛋白的相互作用。结果:Flag-ATG5真核表达质粒构建成功,转染293T细胞后融合蛋白获得表达,其相对分子质量约33×103;Flag-ATG5可与Myc-ATG12结合。结论:构建了带Flag标签的人ATG5真核表达载体,为进一步研究ATG5在自噬中的功能奠定了基础。     

CDX2基因高表达对胃癌细胞生物学行为的影响

目的探讨尾侧型同源转录因子-2(CDX2)基因过表达对胃癌BGC-823细胞增殖、迁移、凋亡等生物学特征的影响。方法采用脂质体转染法建立CDX2基因过表达的胃癌BGC-823稳定细胞株,分别采用RT-PCR、Western blotting和免疫细胞化学等方法检测转染重组表达载体pEGFP-C1/CDX2后,BGC-823细胞中CDX2基因及其蛋白的表达。MTT法检测CDX2基因过表达对细胞的增殖能力的影响;划痕实验检测CDX2过表达对细胞迁移能力的影响;流式细胞术检测CDX2过表达对细胞的凋亡的影响;应用基因芯片技术检测转染前后相关基因的差异表达。结果 RT-PCR及Western blotting检测结果显示,与对照组相比,转染pEGFP-C1/CDX2后,BGC-823细胞中CDX2基因和蛋白均呈高表达;CDX2过表达能明显降低转然组BGC-823细胞增殖能力和迁移能力;但对细胞凋亡影响不明显;基因芯片结果提示CDX2基因高表达能影响某些基因的表达。结论 CDX2过表达能明显抑制胃癌细胞增殖、降低迁移能力,提示CDX2在胃癌中可能发挥抑癌基因的作用。     

携带Flag标签的人自噬相关蛋白4B的真核表达及功能鉴定

目的:构建携带Flag标签的人自噬相关基因4B(ATG4B)的真核表达质粒,获得Flag-ATG4B融合蛋白,并检测其与LC3的相互作用。方法:以本实验室保存的乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增获得ATG4B序列,并将其插入pc DNA3.0-Flag载体构建成重组质粒,转染HEK293T细胞后用Western印迹检测融合蛋白的表达,用免疫共沉淀检测ATG4B与LC3的相互作用。结果:菌液PCR和重组质粒的双酶切结果及测序均表明重组质粒构建成功,Western印迹表明融合蛋白在HEK293T细胞中获得表达,免疫共沉淀结果表明表达的ATG4B能与LC3结合。结论:构建了pc DNA3.0-Flag-ATG4B真核表达质粒,表达的ATG4B蛋白对LC3的切割至关重要,这为进一步研究ATG4B在自噬过程中的作用奠定了基础     

人Polo样激酶1活性缺失突变体和结构域在293细胞中的瞬时表达

目的:构建人Polo样激酶1(Plk1)活性缺失突变体及结构域突变体的真核表达载体,并在293细胞中表达。方法:用二次PCR方法扩增Plk1基因并点突变,将82位赖氨酸突变为精氨酸,定向克隆到pcDNA3-Flag载体中;用普通PCR方法扩增Plk1激酶区域及Polo盒区域(PBD)基因,定向克隆到pcDNA3-Flag载体中;将上述质粒转染293细胞进行瞬时表达,Western印迹检测Plk1蛋白的表达。结果:构建了Flag-Plk1(K82R)、Flag-Plk1KD、Flag-Plk1PBD真核表达质粒,在293细胞中均可有效表达,蛋白相对分子质量分别为68×103、45×103、31×103。结论:在293细胞中表达了Flag-Plk1(K82R)、Flag-Plk1KD、Flag-Plk1PBD蛋白,有助于进一步探究Plk1对底物的功能。     

在表达HCV Core蛋白的肝癌细胞中建立Notch1低表达稳定转染细胞株

目的筛选并包装Notch1基因shRNA低表达的慢病毒,感染稳定表达丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)核心蛋白(core)的肝癌细胞,在此基础上建立低表达Notch1基因的SMMC7721-Core稳定转染细胞株。方法设计针对Notch1基因mRNA的干扰序列,并将其连接入载体质粒,转染HEK293T细胞,构建带有Notch1基因的慢病毒表达载体,感染稳定表达HCV Core蛋白的人肝癌细胞株SMMC7721-Core,采用定量聚合酶链反应(quantitative PCR,qPCR)和免疫印迹法(Western blot)检测干扰效果。结果构建了带有干扰Notch1基因的慢病毒表达载体,感染SMMC7721-Core细胞后筛选获得稳转细胞株,qPCR测得Notch1 mRNA低表达,Western blot检测到Notch1蛋白低表达。结论成功构建了Notch1低表达SMMC7721-Core人肝癌稳定转染细胞株,为进一步开展对HCV Core蛋白诱导肝癌过程中Notch1所起作用的研究提供了依据。     

靶向survivin的siRNA对胃癌BGC-823细胞增殖的影响

目的探讨干扰RNA沉默生存素（survivin）基因表达对人胃癌BGC-823细胞增殖和凋亡的影响。方法设计并合成3条靶向survivin的小分子干扰RNA（siRNA）,构建表达性干扰RNA质粒（shRNA）——shRNA-survivin-1、shRNA-survivin-2和shRNA-survivin-3,分别转染胃癌BGC-823细胞,实时定量PCR检测干扰RNA沉默survivin mRNA表达效果,Westernblot观察对胃癌BGC-823细胞survivin蛋白质表达的抑制,MTT（四甲基偶氮唑盐）比色法分析检测细胞生长抑制率,流式细胞计数检测各组细胞周期和凋亡率,探讨干扰RNA对胃癌BGC-823细胞生长的影响。结果在体外,shRNA-survivin-1有效沉默人胃癌BGC-823细胞survivin mRNA的表达,使sur-vivin mRNA相对水平明显降低（P〈0.05）,survivin蛋白质表达抑制,72h细胞生长抑制率达74.92%（P〈0.05）,shRNA-survivin-1使G2/M期细胞百分比明显增加,凋亡率显著增加（P〈0.05）。结论 shRNA-survivin-1可以沉默survivin基因的表达,可以显著抑制胃癌BGC-823细胞的增殖,在一定程度上诱导其自发凋亡。本研究为靶向sur-vivin的RNA干扰在胃癌的基因治疗提供了有力的理论依据和技术储备。     

5型腺病毒E1A基因通过调控GP73的表达抑制肝癌细胞增殖的初步研究

目的:研究5型腺病毒(Ad5)E1A基因通过调控高尔基蛋白73(GP73)的表达水平,抑制肝癌细胞Hep G2的增殖。方法:以腺病毒为模板、pc DNA-flag-Vector为载体,构建真核表达载体pc DNA3-Flag-Ad5E1A;免疫印迹实验鉴定重组蛋白Ad5E1A的表达;免疫印迹实验验证Ad5E1A对GP73表达水平的影响;将Ad5E1A基因转染Hep G2细胞,用CCK-8试剂盒检测Hep G2细胞的增殖情况。结果:免疫印迹实验结果证实,真核表达载体pc DNA3-FlagAd5E1A在HEK293细胞中得到表达;Ad5E1A可明显抑制GP73的表达。酶标仪检测发现,与转染Flag-GP73组相比,Ad5E1A组的抑制率为17.5%,差异无统计学意义(P0.05);而与转染Flag-GP73组比,共转Ad5E1A和GP73组的抑制率为37.8%,差异有统计学意义(P0.05)。结论:Ad5E1A基因通过调控GP73的表达抑制了肝癌细胞Hep G2的增殖。为研究肝癌发生机制,开发新型治疗方案提供了实验基础。     

DEK真核表达载体的构建及其对p53启动子活性的影响

目的：构建DEK的pcDNA3-Flag表达载体,研究其对抑癌基因p53启动子活性的影响。方法：以乳腺文库为模板,PCR扩增DEK编码序列,克隆到pcDNA3-Flag载体,构建成pcDNA3-Flag-DEK,转染293T细胞,Western印迹鉴定peDNA3-Flag载体介导的DEK的表达,萤光素酶报告基因活性实验研究DEK对p53启动子活性的影响。结果：双酶切实验证实得到pcDNA3-Flag-DEK阳性克隆;Western印迹实验发现DEK在293T细胞内表达;转录活性实验表明在ZR75-1乳腺癌细胞中,DEK呈剂量依赖性抑制p53启动子的活性。结论：构建了DEK的真核表达载体,并发现此表达载体能在ZR75-1乳腺癌细胞中抑制p53启动子活性。     

人磷酸葡萄糖变位酶5对肝癌细胞生长和迁移的影响

目的:构建带有Flag标签的人磷酸葡萄糖变位酶5(PGM5)基因的真核表达载体,研究PGM5对肝癌细胞生长、迁移的影响。方法:以人乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增PGM5基因编码序列,酶切后插入pcDNA3.0-Flag载体;将空载体与重组质粒分别转染293T细胞,Western印迹检测PGM5的表达;CCK8生长曲线实验研究PGM5对肝癌细胞生长的影响,细胞划痕实验检测PGM5对肝癌细胞迁移的影响。结果:双酶切及测序结果显示pcDNA3.0-Flag-PGM5真核表达载体构建成功;Western印迹表明PGM5在293T细胞中获得表达;生长曲线和划痕实验显示PGM5可以显著抑制肝癌细胞的生长和迁移。结论:构建了pcDNA3.0-Flag-PGM5表达载体,并发现PGM5可以抑制肝癌细胞生长和迁移,为进一步研究PGM5在癌症发生发展中的作用奠定了基础。     

TGM2对胃癌细胞BGC-823增殖、迁移和侵袭能力的影响

目的:转谷氨酰胺酶-2(transglutaminase-2,TGM2)是一种多功能的蛋白,在乳腺癌,胰腺癌,黑色素瘤和前列腺癌等肿瘤中高表达,而且和肿瘤的增殖和转移密切相关。本研究旨在探索TGM2对胃癌细胞BGC-823的增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法:q RT-PCR、蛋白质印迹及免疫组化检测TGM2在胃癌细胞及组织中的表达情况;慢病毒转染胃癌细胞BGC-823以干扰TGM2的表达,荧光显微镜下观察转染效率,蛋白质印迹检测TGM2表达干扰效果;CCK-8法检测TGM2下调对BGC-823增殖能力的影响;Transwell法检测TGM2下调对BGC-823的迁移和侵袭能力影响;蛋白质印迹检测TGM2下调对转移和凋亡相关蛋白表达的影响。结果:TGM2在胃癌细胞和组织中均高表达,P0.01(q RT-PCR),P0.001(免疫组化);转染慢病毒后,荧光显微镜下观察结果显示转染效率超过90%,蛋白质印迹结果显示实验组sh TGM2-1的干扰效果最好,TGM2明显下调,差异具有统计学意义,P0.0001;CCK-8结果表明TGM2下调后,从细胞铺板第2d开始,实验组(sh TGM2-1)的细胞增殖倍数明显下降,P0.05(2d),P0.01(3d),P0.001(4d),P0.01(5d);Transwell结果显示,TGM2下调后,BGC-823的迁移和侵袭能力明显减弱,P0.001(迁移),P0.01(侵袭);蛋白质印迹结果显示,TGM2下调后,NF-κB和Bcl-2表达下调,而Bax表达上调,P0.05(NF-κB)、P0.001(Bcl-2)和P0.0001(Bax)。结论:TGM2下调能抑制胃癌细胞BGC-823的增殖、迁移和侵袭能力,并和NF-κB、Bcl-2的下调以及和Bax的表达水平上调有关,为胃癌的临床治疗提供了新靶点。     

带Myc标签的人B55α真核表达载体的构建及其生物学功能

目的:构建带有Myc标签的人B55α真核表达载体,获得Myc-B55α融合蛋白,并初步检测其生物学功能。方法:以本实验室保存的乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增出B55α编码序列,将其插入p XJ-40-myc载体,Western印迹检测其表达情况;将重组质粒与空载体分别转染人胚肾293T细胞,通过Western印迹检测B55α蛋白表达水平及其对AKT磷酸化的影响;免疫共沉淀实验检测B55α与AKT是否存在相互作用。结果:双酶切和测序结果表明Myc-B55α真核表达质粒构建成功;Western印迹证实转染293T细胞后Myc-B55α融合蛋白获得表达,并可抑制AKT308的磷酸化;免疫共沉淀结果表明B55α与AKT存在相互作用。结论:构建了带Myc标签的人B55α真核表达载体,为进一步研究B55α在蛋白磷酸化修饰功能中的作用奠定了基础。     

微管结合蛋白Tau磷酸化位点突变体的构建及鉴定

目的:构建带有Myc标签的Thr-213、Thr-235、Ser-404磷酸化位点突变为Ala的Tau蛋白真核表达质粒,并在真核细胞中表达Myc-Tau3m蛋白。方法:利用重组PCR方法得到Thr-213、Thr-235、Ser-404磷酸化位点突变为Ala的编码序列,将其插入经Bam HⅠ和KpnⅠ酶切的p XJ40-Myc表达载体,在人293T细胞中转入空载体和重组质粒,利用Western印迹检测其表达及功能。结果:测序和酶切结果证实Myc-Tau3m真核表达质粒构建成功,转染293T细胞后获得表达,表达产物可促进微管的乙酰化。结论:构建了Thr-213、Thr-235、Ser-404磷酸化位点突变的Myc-Tau3m真核表达载体,为进一步研究Tau蛋白磷酸化的生理机能奠定了基础。     

人H-ras基因真核表达载体的构建及其对肿瘤细胞生长的促进作用

目的:构建癌基因H-ras真核表达载体,并检测其对肿瘤细胞生长的作用。方法:以乳腺文库为模板,PCR扩增H-ras基因片段,将其插入p XJ-40-myc载体后转染人胚肾HEK293T细胞,用Western印迹检测该融合蛋白的表达;将重组质粒转染人肠癌HCT-116细胞和人肝癌Hep G2细胞,通过细胞生长曲线(CCK8法)对myc-H-ras影响肿瘤细胞生长的情况进行分析。结果:利用PCR技术,从乳腺文库中扩增出H-ras基因片段,并成功插入p XJ-40-myc载体;重组质粒转染HEK293T细胞,经Western印迹检测融合蛋白正确表达;细胞生长曲线结果显示,转染myc-H-ras的结肠癌HCT-116细胞和人肝癌Hep G2细胞比转染空载体的细胞生长快。结论:构建了人H-ras基因真核表达载体,为进一步研究ras基因在肿瘤细胞中的作用奠定了一定基础。     

人LC3B基因的真核表达及鉴定

目的:构建带HA标签的重组人LC3B基因的真核表达载体,获得HA-LC3B融合蛋白,并初步检测其生物学功能。方法:从人乳腺文库中通过PCR技术扩增LC3B基因编码序列,将其插入pc DNA3.0-HA载体,获得HA-LC3B真核表达载体;将重组质粒与空载体分别转染人胚肾293T细胞,通过Western印迹检测转染细胞的表达情况,免疫共沉淀实验证实其生物学活性。结果:双酶切和测序结果表明HA-LC3B真核表达质粒构建成功,Western印迹表明重组质粒转染293T细胞后获得表达;免疫共沉淀实验显示HA-LC3B融合蛋白可以和Atg4B蛋白相互作用,具有较好的生物学活性。结论:在真核表达系统中表达了带HA标签的人LC3B,为进一步研究细胞自噬奠定了基础。     

钙敏感受体基因多态性E942K通过Ca2+和ERK1/2通路促进胃癌细胞增殖

本研究旨在探究钙敏感受体(calcium-sensing receptor, CaSR)的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)E942K对胃癌细胞增殖的影响及其机制。对46例胃癌患者和50例正常对照进行基因型检测。应用CaSR E942K突变质粒和野生型质粒转染SGC-7901和HEK-293构建细胞模型,采用CCK8和细胞克隆形成实验检测E942K突变对细胞增殖能力的影响,用钙显影成像技术检测E942K突变对钙信号的影响,并采用Western blot检测E942K突变后下游信号通路关键蛋白ERK1/2和β-catenin磷酸化水平的变化。结果显示,胃癌患者CaSR E942K的突变率显著高于正常对照(P 0.05)。CaSR E942K突变显著提高了SGC-7901胃癌细胞及HEK-293细胞的增殖能力、细胞内钙信号以及ERK1/2的磷酸化,却不影响β-catenin的磷酸化。以上结果提示,CaSR的E942K突变可能通过增强细胞内钙信号和ERK1/2磷酸化,最终促进了胃癌细胞的增殖,这些结果对胃癌的诊断和靶向治疗具有潜在的临床意义。     

博尔纳病病毒X基因真核表达载体的构建及鉴定

目的构建博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)X蛋白真核表达载体,为BDV X蛋白的功能研究奠定基础。方法从BDV持续感染的人少突胶质瘤细胞(oligodentrocyte,OL)的总RNA中,通过逆转录和PCR获得BDV X基因的完整序列,将其连接到pc DNA6-myc-His(A)载体上,转化至E.coli感受态细菌后,提取质粒筛选阳性克隆,通过PCR法和DNA测序进行鉴定,并转染至OL细胞,通过Western blot方法验证重组蛋白的表达。结果测序鉴定目的基因序列正确插入至pc DNA6-myc-His(A)载体的酶切位点,PCR扩增的基因片段大小与目的基因相同,Western blot证明转染至OL细胞后可表达BDV X-His融合蛋白。结论成功构建了博尔纳病病毒X基因真核表达载体pc DNA6-myc-His(A)-BDV X。     

重楼活性单体pp-10通过抑制PI3K/Akt通路诱导人胃癌细胞BGC-823凋亡和自噬

目的:探讨重楼/七叶一枝花(Paris polyphylla)的醇提物单体pp-10诱导人胃癌BGC-823细胞凋亡和自噬及其分子机制。方法:采用MTT法和克隆形成抑制实验观察不同浓度的重楼单体pp-10对人胃癌BGC-823细胞的增殖抑制作用;Hoechst33342染色法检测pp-10作用于人胃癌BGC-823细胞后细胞核形态的改变;Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡;Western blotting检测重楼单体pp-10对细胞凋亡和自噬相关蛋白Caspase-3、Caspase-9、(ADP-核糖)聚合酶(PARP)、Bax、Bcl-2、LC3、P62以及PI3K/Akt信号通路相关蛋白(Akt、p-Akt、m TOR、p-m TOR、P70s6k、p-P70s6k)表达的影响。结果:重楼单体pp-10能显著抑制BGC-823细胞的生长,作用呈时间-效应关系及剂量-效应关系;克隆形成抑制实验表明随着pp-10浓度的增加,细胞克隆形成逐渐减少,与对照组相比有显著差异;在荧光显微镜下观察可见其细胞核固缩、边聚、裂解等细胞凋亡形态学变化;流式细胞术检测显示,随着作用药物浓度的增高,其凋亡率逐渐升高;Western blotting结果表明,随着药物浓度的增加,线粒体相关凋亡信号通路蛋白Caspase9、Caspase3及PARP均出现酶切活化条带,细胞促凋亡蛋白Bax的表达水平增加,抗凋亡蛋白Bcl-2减少,自噬相关蛋白Ⅱ型LC3增加,P62蛋白减少,p-Akt蛋白的表达水平下降,Akt下游蛋白p-m Tor、p-p70S6K表达减少。结论:重楼单体pp-10通过抑制BGC-823细胞增殖,诱导细胞凋亡和自噬,与下调P13K/Akt信号通路有关。     

非受体型酪氨酸激酶JAK1基因真核表达质粒的构建与真核表达

[目的]构建非受体型酪氨酸激酶JAK1(nonreceptor tyrosine kinase-JAK1)基因真核表达质粒pcDNA4.0-HisJAK1,并转染293T细胞进行真核表达。[方法]从Hela细胞中提取总的RNA,通过RT-PCR获得JAK1基因全长c DNA序列,并将其克隆至真核表达载体pcDNA4.0-His中,构建重组质粒pcDNA4.0-His-JAK1。将真核重组表达质粒转染293T细胞,转染48 h后,在荧光显微镜下观察转染情况。免疫印迹法检测JAK1蛋白转染24 h、36 h与48 h在293T细胞中的表达。[结果]经双酶切与质粒PCR鉴定质粒克隆正确,测序鉴定序列中第2199位碱基A突变为G,为同义突变,不影响氨基酸序列。转染293T细胞48 h后,间接免疫荧光实验显示在293T细胞中检测到绿色荧光。免疫印迹检测可见大小约为133 kDa的目的蛋白。[结论]成功获得JAK1基因全长序列,并成功构建pcDNA4.0-HisJAK1真核重组表达质粒,并在真核细胞293T中获得有效表达,为进一步研究JAK1蛋白质相互作用奠定了基础。