重组人抗血栓蛋白在大肠杆菌中的自诱导表达及纯化

旨在优化重组人抗血栓蛋白(rHAP)工程菌的自诱导培养基,以提高菌体产量及可溶性的重组rHAP蛋白含量.选取蛋白胨、酵母提取物、甘油、葡萄糖为因素,各取4个水平,采用正交表L16(45)进行试验设计,时影响菌体生长和可溶性rHAP表达水平的乳糖浓度进行了优化.结果表明自诱导培养基碳氮源的最优配比:2％蛋白胨,1.5％酵母,0.5％甘油,0.03％葡萄糖,0.2％乳糖.此时表达菌密度OD600和可溶性rHAP目标蛋白表达量分别是未优化前的2.04倍和2.85倍.在20 L发酵表达时,rHAP工程菌OD600值高迭93,菌体温量为1 620 g/20L.利用Q-Sepharose和SP-Sepharose纯化,Western blotting结果表明表达蛋白为目的融合蛋白.     

转TNF-α基因大肠杆菌培养条件的优化

目的：优化转pMD-489-TNF大肠杆菌的发酵条件,提高菌体产量及TNF-α产率。方法：通过单因素及正交实验,对影响转基因大肠杆菌生长及TNF-α表达的培养液成分、诱导剂浓度、培养温度等工艺条件进行了优化。结果：M9＋LB培养基成分的最优配比为3%葡萄糖、2%蛋白胨、4%酵母粉和1%NH4Cl,诱导剂IPTG浓度为0.5mmol/L,诱导时间4h,培养液初始pH是7.0,于37℃培养。结论：优化后的培养条件促进了菌体的生长和TNF-α的表达,菌体干重和TNF-α表达率比没有经过优化时升高了1.34倍和4.11倍,TNF-α产率从0.113%提高到0.479%,提高了324%。     

拟南芥赤霉素受体AtGID1a原核表达条件的优化研究

运用均匀设计法,对影响Rossetta(DE3)/pGEX-KG/AtGID1a表达水平的因素进行了优化,摸索出了对可溶性蛋白进行诱导表达的最优条件,即蛋白胨16 g/L,酵母粉5 g/L,葡萄糖4g/L,IPTG终浓度0.1 mmol/L,诱导温度23 ℃,IPTG诱导时间4 h.在此条件下,目的蛋白的平均密度从0....     

FGF21(L~(59)R)突变体基因工程菌发酵表达条件的优化

本研究对影响FGF21(L~(59)R)突变体基因工程菌发酵条件的因素进行了优化。采用正交试验确定FGF21(L~(59)R)突变体基因工程菌的最佳LB培养基配方,利用SDS-PAGE电泳检测不同发酵条件对FGF21(L~(59)R)突变体蛋白表达情况。LB培养基最佳配比(g/L):蛋白胨11,酵母粉6,氯化钠10,葡萄糖1;在此基础上优化基因工程菌发酵条件,确定LB培养基p H 6.5~7.2,装液量(溶解氧)20%,菌体密度(A_(600))1.0,IPTG浓度0.6 mmol/L,37℃条件下诱导5 h,突变体蛋白的表达量由优化前的12%提高至35%。结果表明,培养基配方、p H、装液量(溶解氧)、菌体密度(A_(600))、IPTG浓度、温度、诱导时间均对FGF21(L~(59)R)突变体基因工程菌表达量有影响。     

响应面法优化表达丙酮酸氧化酶重组大肠杆菌培养基

本研究利用响应面法优化重组大肠杆菌的培养基提高了其表达丙酮酸氧化酶的产量。首先,单因素优化实验表明pH、甘油浓度、酵母粉浓度、胰蛋白胨浓度分别为pH 7、0. 3%、1. 2%、0. 6%时有利于重组大肠杆菌表达丙酮酸氧化酶。进而,利用Box-Behnken法对甘油、酵母粉、胰蛋白胨设计三因素三水平实验,通过响应面回归分析,得到模型预测的最优培养基条件。在0. 6%甘油、3. 18%酵母粉和0. 44%胰蛋白胨的培养基条件下重组大肠杆菌产丙酮酸氧化酶有最高活力。验证试验结果丙酮酸氧化酶活力达到(17 194. 9±504. 9) U/L,与模型的预测值相近,比未优化前提高了1. 7倍。本研究结果为丙酮酸氧化酶的大规模生产和工业化应用提供了基础。     

人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白在大肠杆菌中的自诱导表达优化

考察了在大肠杆菌中自诱导表达人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白的可行性,并对自诱导培养条件及培养基成分进行优化,以提高蛋白产量。实验结果表明,最优培养基成分为蛋白胨19.17g/L,酵母膏9.59g/L,Na2HPO45.72g/L,KH2PO45.48g/L,(NH4)2SO42.66g/L,NaCl3.33g/L,甘油2%(V/V),葡萄糖0.68g/L,乳糖6.33g/L,MgSO40.24g/L。在温度33°C、接种量1%、pH7、装瓶量20mL/100mL培养条件下,用该最优培养基自诱导表达人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白的产量可达348.6mg/L。     

乳糖诱导高分子量重组蛛丝蛋白发酵培养基优化

在M9培养基的基础上,以乳糖为诱导剂,对基因重组蛛丝蛋白工程菌pNSR32/BL21(DE3)的发酵培养基进行了优化。利用单因子实验和正交试验优化出表达高分子量重组蛛丝蛋白的最优培养基配方,结果表明：优化的碳源为0.3%的甘油,氮源为3%的酵母膏、0.75％的蛋白胨和0.05％(NH4)2SO4及少量的无机盐。优化培养基有利于菌体的生长和目的蛋白的表达,表达重组蛛丝蛋白达总蛋白量的20%。     

MntH与含锰过氧化氢酶共表达基因工程菌的构建与发酵优化

构建Mn2+转运蛋白MntH与来源于Thermus thermophilus HB27的含锰过氧化氢酶的共表达基因工程菌,并进行了发酵培养基及培养环境条件的优化,确定培养基中最佳的碳氮源种类及其浓度分别为:甘油7.0 g/L,酵母粉3.75 g/L和蛋白胨11.25 g/L;当培养基中的Mn2+浓度为1 mmol/L时,最佳的IPTG诱导浓度为0.05 mmol/L。此外,最佳的培养基初始p H值及培养温度分别为:p H 8.0和37℃,在最优发酵条件下工程菌摇瓶发酵培养24 h,过氧化氢酶活最高可达476 U/m L是未优化前3倍。在5 L发酵罐的验证实验中,过氧化氢酶的酶活进一步提高至1 094 U/m L。     

毕赤嗜甲醇酵母工程菌高密度培养表达黑曲霉菊粉内切酶的研究

目的:对毕赤嗜甲醇酵母工程菌inu-26高密度培养表达黑曲霉菊粉内切酶的条件进行优化,找出最佳的外源蛋白表达条件。方法:在摇瓶优化培养的基础上进行发酵罐高密度培养,优化最佳产酶条件。结果:以葡萄糖为碳源、微量元素添加量100～200mL/L、甲醇浓度1g/L、pH6.0～7.0、诱导时间96h时酶的表达量最高;摇瓶模拟高密度培养表明影响酵母生长的最主要因素葡萄糖和硫酸铵的最佳浓度分别为20～45和11.5g/L;利用培养基F1进行高密度培养优于其他培养基,工程菌生长符合指数生长曲线,细胞生长延迟期为1.36h,比生长速率μ为0.4846h-1。结论:以葡萄糖为碳源,采用葡萄糖-甲醇混合诱导和100%甲醇单一诱导相结合,在菌体鲜重约为280g/L时连续诱导96h,菌体生长良好,不会出现自溶,且酶的表达量最高,为摇瓶培养的3倍多,酶活最高可达540 U/mL。     

抗肿瘤肽QX3-1融合蛋白在大肠埃希菌中表达条件的优化

优化抗肿瘤肽QX3-1融合蛋白在大肠埃希菌中的表达条件,提高表达量。从培养基、诱导温度、诱导剂浓度和诱导时间4个单因素实验入手,优化QX3-1融合蛋白的表达条件,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)和Band Scan凝胶分析软件分析QX3-1融合蛋白的表达量。p ED-QX 3-1/BL21重组菌在LB、大豆肉汤、TB和酪蛋白胨(自制) 4种培养基中,于酪蛋白胨培养基中的表达量最高;在20、25和37℃三种诱导温度下,于37℃环境中表达量最高;在1、5、10、15和20 mmol/L乳糖浓度的诱导下,于10 mmol/L乳糖诱导最佳;在30 h的诱导时间内,于第24小时,融合蛋白的表达量最高。从培养基、诱导温度、诱导剂浓度和诱导时间4个变量中筛选出适合QX3-1融合蛋白表达的最佳组合,使融合蛋白的表达量达到了31. 2%,相比未优化前提高了近一倍。     

重组大肠杆菌产Streptomyces sp. FA1来源木聚糖酶的摇瓶发酵优化

为了实现来源于Streptomyces sp. FA1的木聚糖酶的高效胞外分泌表达,对E.coli BL21(DE3)/pET20b(+)/coe/xynA基因工程菌的发酵产酶诱导条件进行优化,获得最优的诱导条件为25 ℃发酵6 h后添加终浓度为0.4 mmol/L的IPTG。在此基础上对发酵培养基进一步优化,得到最优培养基成分为:甘油11 g/L,酵母粉24 g/L,蛋白胨8 g/L,磷酸盐浓度89 mmol/L,镁离子4 mmol/L。最终酶活达到780.2 U/ml,为未优化前的2.2倍,是目前大肠杆菌摇瓶发酵产木聚糖酶的最高表达水平,为实现该酶的工业化生产奠定基础。     

多表位恶性疟疾疫苗M.RCAg-1在大肠杆菌表达的条件优化和大规模培养

通过以培养基配方、IPTG浓度、金属离子复合液浓度、镁离子浓度、表达时间、接种量、诱导时间点等发酵的重要条件对重组蛋白表达量影响的研究,确定多表位恶性疟疾疫苗M.RCAg-1蛋白最佳表达条件为以改良TB培养基培养、最优Mg2+,诱导剂IPTG和金属离子复合液浓度分别为10mmol/L,0.5mmol/L,6μl/ml,接种量为10%,表达时间为4.5h,将优化后的参数用于50L发酵罐进行连续3批中试规模的发酵,最终收获菌体湿重平均为31.8±1.78g/L,目的蛋白表达量可占菌体总蛋白的50%左右,试验确定了恶性疟疾多表位随机组合蛋白M.RCAg-1在大肠杆菌中的最优表达条件,该条件能够适合大规模培养需要。     

裂殖壶菌Schizochytrium sp. 20888产DHA培养条件优化

【目的】为了优化裂殖壶菌产DHA的培养条件,提高油脂中DHA含量。【方法】采用单因素试验和正交设计试验方案,针对分批培养时间、培养基碳、氮源的种类和浓度以及培养温度开展试验,采用重量法测定生物量、采用索氏提取法测定油脂总量,采用气相色谱法测定油脂DHA含量,考察培养条件对细胞油脂DHA含量的影响。【结果】最适培养时间为4 d,培养温度23°C,最优碳氮源组成为(g/L):葡萄糖65、甘油80、蛋白胨6、酵母粉4和谷氨酸钠8。【结论】裂殖壶菌Schizochytrium sp.20888在葡萄糖和甘油组成的复合碳源和由蛋白胨、酵母粉和谷氨酸钠组成的复合氮源的培养基中可以得到最优的DHA产量,细胞DHA含量能达到33.68%。     

利用重组大肠杆菌生产人生长激素发酵工艺的研究

在摇瓶培养和发酵罐培养条件下,研究了E.coli/BL21(DE3)/pET30a(+)-hGH工程菌的不同发酵工艺条件。确立了该工程菌的最优化工艺参数:M9-2培养基,37℃、pH值为6.8-7.4、诱导起始菌体密度为OD600达3.0-4.0,IPTG浓度为1mmol/L,诱导时溶氧控制为50%以上,补料为10%甘油、5%Yeast extract和5%Tryptone。该工艺条件经过连续三批发酵,证实稳定可行,目的蛋白在胞间质呈可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的20%以上。     

GABAA受体蛋白片段在大肠杆菌细胞表达条件研究

为了提高GABAA受体α1蛋白片段在大肠杆菌中表达量,研究了重组菌的发酵条件,包括培养基,接种量,温度,摇床转速,pH,诱导培养时间和诱导剂IPTG使用浓度等对GABAA受体蛋白片段表达的影响。结果表明重组菌以LB培养基为发酵基质,按3%接种量,37℃培养细胞3.5h后IPTG32℃诱导5h,菌体生物量为3.25g/L,目标蛋白表达量达95mg/L。用16L发酵罐进行放大培养,菌体生物量达4.95g/L,发酵周期5.5h。最高目标蛋白表达量达到136mg/L。     

鲨肝刺激物质类似物在大肠杆菌中的高密度发酵

为建立重组鲨肝刺激物类似物(r-sHSA)的高密度发酵方法,本研究在利用单因素实验和均匀设计实验优化摇瓶发酵培养基的组成和浓度以及诱导剂(IPTG)浓度的基础上,利用5L发酵罐进行了放大试验,探讨了补料方式、补料培养基的组成和浓度、诱导剂加入时间和诱导后菌体的收获时间对工程菌生物量和r-sHSA产量的影响。结果表明:在改良LB培养基(0.97%甘油,0.91%酵母粉,0.72%胰蛋白胨,0.782%KH2PO4,0.267%K2HPO4·3H2O,0.062%MgSO4·7H2O,0.5%NaCl,pH7.0)中,当pH控制在7.0、溶氧浓度为25%～30%的前提下,采用指数补料方式加入优化后的补料培养基(620g/L甘油,94.8g/L胰蛋白胨,3.3mL/L微量元素,7.5g/LMgSO4·7H2O)进行培养,在工程菌的OD600达到23时,加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导6h后收获菌体,菌体的生物量可达(123.27±1.184)g/L,r-sHSA产量为(2.662±0.041)g/L,比优化前提高了13.7倍。     

重组大肠杆菌产尿素酶B高密度发酵条件的优化

探究重组大肠杆菌产尿素酶B（urease B subunit, UreB）的高密度发酵条件。通过实验室摇瓶和30 L发酵罐对UreB基因工程菌的发酵条件进行优化。结果表明：30 L发酵罐中以TB培养基为发酵培养基,接种量为5%,发酵温度为37 ℃,pH为6.8,溶氧量为30%左右,培养至2 h开始恒速流加50%甘油,4 h流加50%酵母提取物和50%胰蛋白胨,并加入终浓度为0.5 mmol/L的异丙基β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG),诱导表达4 h,结束发酵,所得菌体干物质约为25.7 g/L,UreB表达量为31.4%。此工艺可以提高UreB的产量。     

重组人白细胞介素-11工程菌的发酵条件研究

为了探讨发酵条件对大肠杆菌表达人白细胞介素-11融合蛋白的影响,利用正交实验设计,对工程菌的生长条件和人白细胞介素-11融合蛋白表达进行优化。在摇瓶中研究了培养基中的葡萄糖、蛋白胨、酵母抽提物的浓度、pH及摇床转速、装液量、接种量等。确定了工程菌生长及表达的培养基和培养条件:葡萄糖10g/L,蛋白胨20g/L,酵母抽提物10g/L,pH7.5,接种量10%,装液量10%,摇床转速220r/min及诱导时间为4~5h。然后在BiofloⅢ-5L发酵罐中以优化的发酵条件进行了3批实验,结果表明:工程菌量达到55g/L(DCW),重组人白细胞介素-11融合蛋白表达量为33%左右,为进行中试研究奠定了理论基础。     

HCMV pp65截短蛋白原核表达条件优化

为了提高HCMVpp65蛋白片段在大肠杆菌中表达量,研究了不同发酵条件对其表达的影响,包括培养基、接种量、温度、摇床转速、pH、诱导时间以及诱导剂IPTG使用浓度等。结果表明,以LB培养基为发酵液,按5%接种量,37℃培养3h后IPTG诱导5h,重组菌菌体生物量为0.6g/L,目的蛋白表达量达18mg/L。用3.7L发酵罐进行放大培养,菌体生物量达0.85g/L,最高目的蛋白表达量达到25mg/L。     

蔗渣发酵菌剂培养基的筛选及发酵条件的优化

采用单因素和正交试验研究了蔗渣高效发酵菌剂(芽孢杆菌B-A、曲霉菌F-A、链霉菌A-B)的摇瓶发酵最佳工艺条件.结果表明:芽孢杆菌B-A的最佳培养基配方:牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、葡萄糖1%、NaCl 0.5%、可溶性淀粉0.5%、3.08%浓度的MnSO4溶液0.1;最适发酵条件为pH7、装液量100 ml(250 ml三角瓶)、36℃培养27 h.曲霉F-A的最佳培养基配方:葡萄糖3%、豆饼粉3%、蛋白胨1.2%、酵母膏0.3%、K2HPO4 0.05%、KH2PO40.05%、CaCl20.08%、MgSO40.04%、MnSO40.04%、ZnSO40.02%;最适发酵条件为pH6、装液量50 ml、30℃培养3 d.链霉菌A-B的最佳培养基配方:可溶性淀粉4.5%、蔗糖1%、豆饼粉3%、NaNO30.2%、ZnSO40.01%、KH2PO40.001%;最适发酵条件为pH7、装液量50 ml、30℃培养3 d.