泛素/类泛素化调控DNA损伤修复机制研究进展

细胞对DNA损伤进行精确、高效修复的机制被称为DNA损伤应答机制,增殖细胞核抗原(PCNA)在DNA损伤修复机制中起着核心的作用。当细胞遭遇到DNA损伤时,PCNA通过泛素化及类泛素化的翻译后修饰对DNA修复过程进行调控。本文重点阐述DNA损伤修复的不同方式,以及泛素/类泛素化相关蛋白参与调控DNA损伤修复过程的研究进展,并分析了DNA损伤修复与机体的衰老和发育之间的密切关系,为研究DNA修复蛋白的缺失在相关疾病中的作用机制提供新思路。     

人增殖细胞核抗原的表达调控

增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)是一种生长调控蛋白,在DNA复制、修复、细胞周期调控、基因外遗传(epigenetic inheritance)等事件的协同机制中发挥重要功能。PCNA的表达调控发生在多个层次,涉及ATFl、CREB、RFXl、p53、E2F等转录因子以及内含子指导的反义RNA等等。     

受PCNA翻译后修饰调控的DNA损伤耐受机制

为了应对DNA损伤复制阻滞,增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)164位点的赖氨酸残基能够发生一系列的泛素化修饰并介导两种不用的损伤耐受机制,即DNA跨损伤合成(TLS)和无错耐受通路。目前,单泛素化的PCNA介导DNA跨损伤合成通路,而多泛素化的PCNA介导无错耐受通路这一观点已被普遍认可。另外,PCNA的164位点还能被泛素类似物小蛋白(SUMO)修饰,从而抑制DNA双链断裂重组。总结PCNA的翻译后修饰及其在DNA损伤应答过程中的作用机制,有助于我们了解PCNA在DNA损伤耐受机制中的中心作用。重点总结PCNA的翻译后修饰如何调控真核生物DNA损伤应答的不同途径。     

PCNA泛素化修饰对DNA损伤应答途径的调控

机体细胞在多种化学物质和内外环境不断攻击下会诱发DNA损伤。为了维持基因组的稳定性,细胞内拥有一系列完善而精确的细胞应答机制来保护基因组DNA的完整性。细胞首先通过DNA损伤检测点,然后通过一系列细胞信号转导通路,启动细胞周期阻滞,进而介导细胞修复或凋亡。大量研究表明泛素化作为一种重要的蛋白质翻译后修饰方式,参与调控了多种细胞生理过程。近期研究表明,DNA损伤导致复制应激可诱发PCNA的翻译后泛素化修饰,泛素化修饰的PCNA可能参与了多种DNA损伤应激过程,影响细胞选择不同的DNA损伤应答途径,导致细胞截然不同的转归。因此,更好地了解PCNA泛素化的作用及其影响DNA损伤应答通路可为我们更深入地了解人类细胞如何调控异常的DNA代谢过程和癌症的发生和发展机制提供依据。     

PCNA泛素化修饰对DNA损伤应答途径的调控

机体细胞在多种化学物质和内外环境不断攻击下会诱发DNA损伤。为了维持基因组的稳定性,细胞内拥有一系列完善而精确的细胞应答机制来保护基因组DNA的完整性。细胞首先通过DNA损伤检测点,然后通过一系列细胞信号转导通路,启动细胞周期阻滞,进而介导细胞修复或凋亡。大量研究表明泛素化作为一种重要的蛋白质翻译后修饰方式,参与调控了多种细胞生理过程。近期研究表明,DNA损伤导致复制应激可诱发PCNA的翻译后泛素化修饰,泛素化修饰的PCNA可能参与了多种DNA损伤应激过程,影响细胞选择不同的DNA损伤应答途径,导致细胞截然不同的转归。因此,更好地了解PCNA泛素化的作用及其影响DNA损伤应答通路可为我们更深入地了解人类细胞如何调控异常的DNA代谢过程和癌症的发生和发展机制提供依据。     

p53基因与DNA修复

DNA的损伤修复是一个多因子参与的、多环节的复杂修复系统。p53基因以多条信号通路,多种调控方式参与DNA修复。它可以通过其下游一系列靶基因p21、gadd45等调控细胞周期,使细胞停滞于G1期、G2期等检测点,从而使受损DNA有足够的时间进行多因子参与的修复过程;也可以与DNA修复因子PRSA、PCNA、XPp48基因等相互作用,直接参与DNA修复;还可以蛋白－蛋白相互作用参与DNA修复。     

外阴硬化性苔癣组织P53、PCNA表达、DNA含量及与细胞增殖的关系

探讨外阴硬化性苔癣组织中的 P5 3、PCNA表达 ,DNA含量与细胞增殖的关系。免疫组化方法测定 2 0例外阴硬化性苔癣组织和 10例正常外阴皮肤中 P5 3、 PCNA蛋白表达 ;图像分析技术检测两组基底层细胞核形态及 DNA含量。结果显示 ,外阴硬化苔癣组 P5 3阳性表达率为 40 % ,与正常皮肤比较 P<0 .0 5 ,PCNA阳性表达率为 70 % ,与正常皮肤比较 P>0 .0 5 ,阳性表达主要分布于棘层、颗粒层 ;基底细胞核显著变小和 DNA含量降低 (P<0 .0 5 )。结果表明外阴硬化性苔癣组织中存在细胞增殖异常     

UV照射和MMS诱导下PCNA表达的变化及相关研究

目的：建立DNA损伤的模型,在蛋白水平和mRNA水平研究PCNA的表达变化情况。方法：uV照射和MMS处理细胞后利用Westernblot和实时荧光定量PCR检测PCNA蛋白表达水平和mRNA水平的变化,以及利用倒置荧光显微镜观察细胞的形态变化。运用ShRNA干扰技术降低泛素E3连接酶RAD18和CUIAA的表达,检测内源PCNA蛋白表达水平的变化。结果与结论：uV照射和MMS处理细胞后,细胞形态发生变化,随着时间的延长,大部分细胞趋于死亡。实时荧光定量PCR的结果发现PCNA的mRNA水平下降,但是PCNA蛋白水平的表达无明显变化,说明DNA损伤时PCNA蛋白的稳定性增加,暗示细胞中存在着一定的机制,维持PC—NA蛋白表达量的稳定。干扰E3连接酶CUIAA和RAD18的表达时,PCNA蛋白水平有所升高,提示二者参与了PCNA的降解过程。     

PCNA 泛素化对Hela 细胞苯并芘损伤敏感性的影响

目的:观察PCNA泛素化修饰对Hela细胞损伤敏感性的影响。方法:Western blot法检测His-PCNA及His-mutant PCNA(mPCNA,K164R)在Hela细胞中的表达。DNA损伤剂苯并芘(BaP)和依托泊苷(VP-16)分别处理Hela细胞后,MTT法检测不同细胞系对DNA损伤药物的敏感性;Western blot法检测细胞PCNA的泛素化修饰。结果:Western blot结果显示His-PCNA和His-mPCNA在Hela细胞中稳定高表达。MTT结果显示,苯并芘损伤后,稳定高表达mPCNA的细胞系与野生型及高表达PCNA细胞系相比,其细胞存活率呈明显下降趋势,而VP-16作用后,三种细胞存活率无明显差异。Western blot结果显示苯并芘损伤可特异性诱导PCNA发生泛素化修饰。结论:苯并芘损伤能够诱导PCNA发生泛素化修饰,从而降低Hela细胞对苯并芘损伤的敏感性。     

用ribozyme抑制增殖细胞核抗原的表达对HaLa细胞增殖的影响

增殖细胞核抗原(PCNA)是DNA聚合酶δ的辅助蛋白,它是细胞染色体DNA复制所必需的。人工设计的ribozyme具有可特异地切割PCNA mRNA的性质,将此ribozyme的自修剪体内表达质粒导入HeLa细胞,从细胞总RNA中分离相应部分能在体外切割靶RNA片段,证明此表达质粒在细胞内能表达出有活性的ribozyme分子。与对照相比,导入ribo-zyme表达质粒的HeLa细胞进入S期的时间从12 h推迟到20 h,而突变ribozyme的对照表明反义抑制对细胞进入S期的影响较小(推迟到15 h)。证明该ribozyme能有效抑制He-La细胞DNA复制,同时亦证明PCNA对于细胞DNA复制及细胞周期进程的重要性。     

甲基化修饰在细菌表观调控中的功能

为了适应复杂多变的生存环境,微生物通常需要在保证基因组序列不变的前提下不断调整胞内代谢网络。表观调控可以在不改变DNA序列的情况下对基因表达进行调控,因此成为细菌中重要的调控方式。作为一种DNA修饰,DNA甲基化修饰是生物体中最常见的表观调控工具。在本文中我们全面、深入解析了两种孤儿甲基转移酶:DNA腺嘌呤甲基转移酶(DNA adenine methyltransferase,Dam)和细胞周期调控甲基转移酶(Cell cycle-regulated methyltransferase,Ccr M)在原核生物中的表观调控功能。我们主要探讨了DNA甲基化参与的细胞生理过程包括DNA复制起始、DNA错配修复、基因表达调控、致病性和相变异等方面。同时,我们结合三维基因组研究技术基因组结构捕获(Chromosome conformation capture,3C)技术和新型DNA磷硫酰化修饰讨论了该领域的发展前景。     

DNA甲基化与microRNA

细胞中DNA甲基化和microRNA（miRNA）相互影响,并共同调控着下游靶基因的表达活性,在细胞生长代谢、免疫、肿瘤和心血管疾病等生理和病理过程中发挥重要作用。首先简要介绍DNA甲基化与miRNA的概况,然后分析了miRNA调控下的DNA甲基化改变,探讨了DNA甲基化影响miRNA的表达活性变化,并归纳了miRNA与DNA甲基化之间的反馈调控关系;最后对DNA甲基化和miRNA的应用前景进行了简单探讨。研究DNA甲基化与miRNA间的网络调控关系,可为表观调控机制在理论和实践中的深入研究和应用提供参考。     

PCNA等5种基因在小鼠睾丸发育过程中的表达

以出生1日、30日和成年昆明小鼠睾丸组织为实验材料,利用地高辛标记的基因探针在组织切片上进行DNA－mRNA分子原位杂交,研究了PCNA、cyclinD1、cdc2、P21和P16基因共5种细胞周期调控基因在小鼠睾丸发育中的表达变化。结果发现：PCNA基因在30日龄和成年鼠睾丸中都有强的表达;而cyclin D1基因只在30日龄的小鼠睾丸组织中有表达;P21、P16和cdc2基因在3个不同的发育阶段都没有表达。这些结果表明：(1)细胞周期调控基因cyclin D1、cdc2、P16和P21与小鼠睾丸发育和精子发生过程的细胞增殖控制关系不大,可能小鼠睾丸和精子发育过程中的细胞增殖调控与其他细胞的增殖调控有不同的机制;(2)cyclin D1基因在小鼠睾丸中的表达模式表明,cyclin D1基因在睾丸发育中有不同于细胞增殖促进的作用;(3)小鼠睾丸发育中,精子发生开始时期可能晚于30日龄。 Abstracts：Using in situ hybridization technique with Dig Labeled DNA probe, we studied the expression of PCNA,cyclin D1, cdc2, P21 and P16 gene in the test of one day old,30 days old and adult Kunming mouse.The results shows that the expression of PCNA gene was strong in the test of 30 days old and adult mouse; cyclin D1 gene only expressed in the test of 30 days old mouse; cdc2,P21 and P16 gene did not express in the test of all three groups of mouse.These results suggest that:(1)cyclin D1,cdc2,P16 and P21 genes are not related to the regulaton of cell cycle during test development and germ genaration, and possibly the machanism of cell cycle regulation during test development and germ genaration is different from other kind of cells;(2)cyclin D1 has other founctions except promoting cell profilation;and (3)the germ genaration during test development may start after 30 days old.     

DNA甲基化与脂肪组织生长发育

DNA甲基化作为一种重要的表观遗传学修饰方式,在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用。DNA甲基化最重要的作用是调控基因表达,它是细胞调控基因表达的重要表观遗传机制之一。近年来的研究发现,DNA甲基化在脂肪组织生长发育以及肥胖症发生过程中发挥着重要作用。DNA甲基化通过调控脂肪细胞分化转录因子、转录辅助因子以及其他脂肪代谢相关基因的表达,从而调控脂肪组织的生长发育。该文综述了脂肪组织生长发育过程中DNA甲基化的最新研究进展,探讨了脂肪组织DNA甲基化的研究趋势和未来发展方向。     

DNA甲基转移酶的表达调控及主要生物学功能

DNA甲基化是表观遗传学的重要部分, 同组蛋白修饰相互作用, 通过改变染色质结构, 调控基因表达。在哺乳类细胞或人体细胞中, DNA甲基化与细胞的增殖、衰老、癌变等生命现象有着重大关系。对催化DNA甲基化的DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase, Dnmt)的研究可以揭示DNA甲基化对基因表达调控的机制, 从而研究与之相关的重要生命活动。文章以DNA甲基转移酶作为切入点, 探讨DNA甲基转移酶在基因表达调控中发挥的作用及其主要生物学功能。     

细胞外信号调节激酶活化在慢性支气管哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖中的作用

本文旨在探讨细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）在慢性支气管哮喘大鼠气道平滑肌细胞（airway smooth muscle cells,ASMCs）增殖中的作用。建立慢性哮喘大鼠模型,用ERK激动剂表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）和抑制剂PD98059干预慢性哮喘大鼠ASMCs的培养。采用流式细胞仪、四甲基偶氮唑盐（MTT）法、^3H-thymidine（TdR）掺入法和增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）免疫组织化学法检测ASMCs增殖情况,观察ERK信号通路对ASMCs增殖的影响。RT-PCR和Western blot检测ERK mRNA和ERK1／2、磷酸化ERK1／2（p-ERK1／2）蛋白的表达。与正常对照组ASMCs比较,慢性哮喘组ASMCs的G0/G1期细胞所占比例明显减少,S＋G2／M期细胞所占比例增高;吸光度（A490）值、细胞DNA合成量和PCNA阳性表达量均明显增加,ERK mRNA、ERK1／2蛋白、P-ERK1／2蛋白的表达量以及ERK活化率显著增高。经PD98059干预之后,慢性哮喘组ASMCs的S＋G2／M期细胞所占比例、A490值、细胞DNA合成量和PCNA阳性表达量明显降低,ERK mRNA、ERK1／2蛋白、p-ERK1／2蛋白的表达量以及ERK活化率显著降低。经EGF干预后,慢性哮喘组ASMCs的S＋G2／M期细胞所占比例、A490值、细胞DNA合成量和PCNA阳性表达量进一步增高,而这一作用可以被PD98059抑制。以上结果提示,慢性哮喘大鼠ASMCs内源性增殖活性增加,ERK1／2参与其增殖活性的调控,ERK信号通路在哮喘气道重建的ASMCs增殖调控中具有重要作用。     

利用拟南芥杂交组合研究siRNA与等位基因DNA甲基化调控中的联系

近年来,越来越多的实验结果表明,表观遗传因子,如DNA甲基化、小RNA、组蛋白修饰等在杂种优势形成中起到重要作用,然而对于这些表观遗传因子在F。中遗传调控方式的认识仍很有限．本实验室先前工作曾以拟南芥C24和Ler两种生态型及其正反交子一代为材料,运用新一代测序方法获得该杂交组合中DNA甲基化及小RNA单碱基分辨率的全基因组图谱．本文进一步对这批数据中的等位基因DNA甲基化水平进行分析,区分DNA甲基化遗传过程中的顺式与反式调控方式,并发现这两种调控方式均有重要的贡献．研究发现,siRNA与DNA甲基化的两种调控方式有密切联系,尤其在DNA甲基化的反式调控中,Fl中DNA甲基化变化程度越大,该区域内siRNA富集程度越强,二者可能存在某种调控机制．通过等位基因表观遗传组的分析研究杂交过程中DNA甲基化和小RNA遗传调控的规律,为更好地理解杂种优势机制提供了帮助．     

细菌DNA甲基化研究进展

DNA甲基化修饰是细菌调控基因表达的一种重要方式,在很多生理过程中发挥非常关键的作用.本文系统介绍了细菌DNA甲基化修饰的起源、DNA甲基转移酶,分类总结了DNA甲基化调控基因表达的机制.同时对近年来细菌DNA甲基化的功能、DNA甲基化检测方法的进展进行了综合评述.这些研究对人类了解细菌DNA甲基化表观调控及控制细菌感染具有重要指导意义.     

转录因子E2F1和PCNA在分离、培养的人视网膜色素上皮细胞中的表达及意义

为探讨转录因子 E2 F1及增殖细胞核抗原 (PCN A)在增生性玻璃体视网膜病变 (PVR)中的作用 ,采用 SABC免疫细胞化学法检测转录因子 E2 F1和 PCNA在无血清组及 2 0 %血清组培养的人视网膜色素上皮细胞 (RPE)中的表达。结果显示在无血清组中 ,转录因子 E2 F1表达的阳性率为 2 .4%± 0 .2 5 % ,而未见 PCNA表达 ;在 2 0 %血清组中 ,E2 F1及 PCNA的表达阳性率分别为 2 9.1%± 0 .71%和 48.6 %± 1.13%。说明 E2 F1和 PCNA蛋白的表达取决于人 RPE细胞的生长状态 ,在增殖活跃的细胞中表达增高 ;转录因子 E2 F1调控人 RPE细胞中 PCNA蛋白的表达。提示转录因子 E2 F1调控人 RPE细胞的细胞周期进展 ,在 PVR的形成中也发挥着关键性的作用     

干细胞中的DNA甲基化

DNA甲基化是表观遗传机制中一种重要的调控方式,它通过调控基因的表达影响一系列的生物学过程。干细胞作为具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体,其分化和再生过程必然受到精确的表观调控。DNA甲基化在干细胞的维持、分化调控等方面都发挥着重要作用。现对胚胎干细胞、多能干细胞以及成体干细胞中DNA甲基化及羟甲基化的最新研究进展进行简要综述,回顾并展望DNA甲基化在干细胞中的潜在生物学功能及调控机制,同时为未来在临床诊断治疗及药物研发等方面提供一定的参考。