噬菌体及其裂解酶控制金黄色葡萄球菌的研究进展

近70年来,由于抗生素的广泛使用,耐药金黄色葡萄球菌不断出现。美国1999～2005年因感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）而入院的患者增加1倍多,其中诊断为败血症的患者增加81．2％。因此,寻找控制耐药菌的新对策十分迫切。目前有望替代抗生素的控菌手段有抗菌肽、噬菌体等。其中,噬菌体的发现早于抗生素,后因抗生素的普及而被忽视。如今,耐药菌株的流行使噬菌体治疗再次受到关注。本文就应用噬菌体及其裂解酶控制金黄色葡萄球菌的研究进展进行综述。     

金黄色葡萄球菌噬菌体vB_Sau_P68的基因组分析和裂解酶

【背景】金黄色葡萄球菌是常见的人畜共患条件致病菌,随着多耐药菌株分离率的增长,研发与抗生素作用模式不同的抗菌剂迫在眉睫。【目的】分离高效且特异性强的金黄色葡萄球菌噬菌体,对其进行功能注释,并对其编码的裂解酶进行功能验证。【方法】通过对噬菌体全基因组序列进行分析找到裂解酶基因,利用原核表达系统对其编码的2个裂解酶蛋白进行克隆,用SDS-PAGE与蛋白免疫印迹法(Western blotting)鉴定目的蛋白是否表达,并采用单斑法验证其裂解活性。【结果】本研究的噬菌体为一株新的金黄色葡萄球菌噬菌体,命名为vB＿Sau＿P68,该基因组全长为139 409 bp,GC含量为31.0%,编码220个开放阅读框(open reading frame,ORF),透射电镜观察具有正二十面体头部和收缩性尾部,形态学分类属于肌尾噬菌体。该噬菌体编码2个裂解酶基因,分别具有CHAP催化结构域与SH3＿5结合结构域,SDS-PAGE与Western blotting表明Lys161能够表达且有裂解活性,Lys163则无法外源表达。对Lys161序列进行分析,该裂解酶无信号肽,无跨膜区域,以无规则卷曲为主。【...     

提高噬菌体裂解酶抗菌活性的研究进展

随着细菌耐药性问题的日益严重,人们开始寻求新型抗菌制剂。噬菌体裂解酶是一种由ds DNA噬菌体编码的水解酶,能高效特异性地裂解细菌细胞壁且不易使细菌产生耐药性。由于天然裂解酶具有宿主谱窄,不能裂解革兰阴性菌等缺点,研究者对裂解酶进行了大量的设计改造。本研究主要对提高噬菌体裂解酶抗菌活性的研究进展进行综述。     

金黄色葡萄球菌体外抗菌活性分析

抗生素在临床上已广泛应用了数十年 ,在抗感染疾病中发挥了极其重要的作用 ,特别是金黄色葡萄球菌耐药菌株相继出现 ,给临床治疗带来困难。目前已知这种耐药是由位于染色体外的 DNA上的耐药基因所编码 ,并通过接合、转导和转化等方式在细菌间传播 ,其中以接合为最主要。同时在传播过程中 ,这种耐药基因又可不断重新组成新的耐药基因而产生对多种抗生素同时耐药的多重耐药菌株。因此本文对174株金黄色葡萄球菌的耐药机理及抗生素耐药性进行研究 ,对如何减少耐药菌株的产生控制医院内感染的流行 ,指导临床治疗有着一定的意义。1　材料与方法…     

噬菌体裂解酶的抗菌特性

摘要：噬菌体裂解酶是一类细胞壁水解酶,可水解肽聚糖,造成细菌的破裂。裂解酶一般具有两到三个结构域,参与对底物的催化和结合。作为一种新型的杀菌制剂,裂解酶已被越来越多地应用于化脓链球菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性细菌病的治疗。与抗生素治疗相比,裂解酶不易使细菌产生抗性且作用相对专一,这可能是解决现在日趋严重的细菌耐药性的一种可行方法。另外,裂解酶还具有高效性,作用协同性,且自身抗体不削弱其作用等优势,使之成为未来预防、控制致病菌一种可能的新途径。     

金黄色葡萄球菌透明质酸裂解酶HylS的异源表达与特性研究

透明质酸酶能够将透明质酸聚糖降解成具有抗氧化等生物活性的低分子量寡糖.微生物来源透明质酸酶具有酶学性质多样和易于重组表达等特点,是开发透明质酸酶的研究热点.通过基因组测序获得一个潜在的金黄色葡萄球菌来源透明质酸裂解酶基因hylS,将其进行了大肠杆菌BL21(DE3)异源重组表达,并对重组酶进行了酶学特性和酶解产物抗氧化...     

鱼源副乳房链球菌前噬菌体裂解酶Sply828的抗菌活性

【背景】副乳房链球菌（Streptococcus parauberis）是重要的水产病原菌,该病原菌已逐渐出现新的血清型及多重耐药性状,因此亟须开发出一种新的抗菌药物用于该病害的防治。研究发现,前噬菌体编码的裂解酶能够有效地杀死其宿主,具有良好的抗菌应用前景。【目的】以副乳房链球菌前噬菌体裂解酶为对象,研究其杀菌宿主谱并优化其裂解活性的条件。【方法】利用PHASTER工具对副乳房链球菌菌株KRS02083全基因组序列分析发现,其前噬菌体包含一种裂解酶的基因Sply828;通过基因克隆、表达和纯化等技术得到裂解酶Sply828蛋白;通过浊度递减实验探究裂解酶Sply828对不同细菌的杀菌活性及其最适的裂解条件。【结果】裂解酶Sply828对鱼源副乳房链球菌具有最佳的杀菌活性,并发现该酶对处于指数生长期的细菌杀菌效果最好;其最适裂解温度为28°C,最适pH为6.2;Ca²⁺和Mg²⁺对该酶的杀菌活性有促进作用,但是Zn²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Ni²⁺明显抑制...     

链球菌噬菌体裂解酶在大肠杆菌中的表达、纯化及活性检测

噬菌体裂解酶是噬菌体产生的细胞壁水解酶,通过水解宿主菌细胞壁使子代噬菌体释放,在体外能高效且特异性地杀死细菌。本研究旨在克隆和表达链球菌噬菌体裂解酶PlyC,并测定其生物学活性。利用PCR方法扩增PlyC的2条肽链PlyCA和PlyCB,构建表达载体pET-32a(+)-PlyCA和pET-32a(+)-PlyCB,分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,以0.7 mmol/L IPTG在30 oC诱导7 h实现了高效表达,SDS-PAGE分析表明PlyCA和PlyCB表达量均可达菌体总蛋白的30%以上。采用Ni2+-NTA亲和层析法纯化目的蛋白,其纯度大于95%。用透析复性方法得到目的产物重组链球菌噬菌体裂解酶PlyC,以浊度法和平板计数法检测其体外抗菌效果,扫描电子显微镜观察裂解酶作用前后细菌细胞形态变化。结果表明重组PlyC能特异性裂解化脓性链球菌(A组β-溶血性链球菌),以4μg/mL浓度作用于OD600为0.56的菌液60 min后杀菌率达99.6%,扫描电镜观察结果显示该酶作用于菌体后,链球菌细胞裂解,呈碎片状态。本研究为开发一种新型、高效的链球菌感染疾病治疗药物打下了基础。     

万古霉素对金黄色葡萄球菌体外抗菌活性研究

目的调查万古霉索对金黄色葡萄球菌的体外抗菌活性。方法收集温州医学院附属第一医院2005年2～7月从临床各种标本分离的金黄色葡萄球菌112株,PCR检测mecA基因确定MRSA,采用琼脂稀释法和全自动微生物分析仪检测金黄色葡萄球菌万古霉素MIC值,使用4mg／L万古霉索脑心浸液琼脂（BHIA）筛选异质性耐万古霉素金黄色葡萄球菌（hVRSA）。结果MRSA的检出率为64．3％,万古霉素的MIC大多数≤2mg／L,MIC。为2mg／L,有2株菌在4mg／L万古霉素BHIA平皿上生长,经菌群分析法证实非hVRSA。仪器法检测的万古霉素MIC值与琼脂稀释法的符合率只有35．7％,琼脂稀释法万古霉索MIC高于仪器法,仪器法检测的2株万古霉素中介耐药的菌株经琼脂稀释法和K-B法证实为敏感株。有6株对万古霉索的MIC为4mg／L,按美国NCCLS／CLSI2006年的标准被确定为万古霉素中介耐药株。结论万古霉素对金黄色葡萄球菌具有较强的体外抗菌活性,未发现耐药株,但MIC值较大。仪器法检测金黄色葡萄球菌对万古霉素的敏感性结果不可靠。按NCCLS／CLSI2006年的标准临床上能检测到对万古霉素中介耐药的金黄色葡萄球菌临床分离株。     

颗粒裂解肽抗菌结构域在大肠杆菌中表达水平的分析

为实现颗粒裂解肽抗菌结构域的高效表达并避免其对宿主菌的毒性,研究设计了共表达阴离子配体重组生产阳离子抗菌肽的方法。结果证明该方法可有效提高阳离子抗菌肽的表达产量。同时研究分析了颗粒裂解肽不同抗菌结构域在同一原核表达载体pACYCDuet-1中表达水平的实验数据。通过计算机程序对mRNA二级结构的模拟分析,计算并比较出其二级结构生成自由能之间的差异,提出了预测颗粒裂解肽抗菌结构域在E.coli中表达水平的几点依据,参考这些依据可以对不同抗菌肽基因进行改造以获得高效表达。     

一株金黄色葡萄球菌噬菌体的裂解谱特异性和分子分类研究

[目的]从医院污水中分离金黄色葡萄球菌噬菌体,观察其形态,确证裂解谱特征并研究生物学和基因学特性,为噬菌体的临床应用奠定实验基础.[方法]将金黄色葡萄球菌ATCC25923作为宿主菌,采用双层琼脂平板法从医院污水中分离纯化噬菌体,电镜下观察形态并测定其最佳感染复数、一步生长曲线及裂解谱;全基因组测序并进行基因结构分析和...     

抗金黄色葡萄球菌IgY的酶解稳定性及活性研究

目的:考察抗金黄色葡萄球菌特异性IgY的酶解稳定性和酶解产物的活性。方法:以灭活的金黄色葡萄球菌免疫产蛋母鸡,抗体经水稀释及盐析分离纯化。抗体在不同条件下经胃蛋白酶或胰蛋白酶消化。抗体及酶解产物的特异性和活性分别用ELISA法和凝集法检测,酶解产物用SDS-PAGE和Western-blotting鉴定。结果:免疫产生的抗体具有特异性,能与金黄色葡萄球菌凝集而抑制其生长。分离纯化后抗体纯度与标准IgY相近。IgY在pH<4时完全酶解;pH等于4时部分酶解生成Fab片断,具有特异性和凝集活性;pH>4时,抗体稳定,不发生酶解。结论:抗金黄色葡萄球菌特异性IgY及其酶解生成的Fab片断,具有特异性和抑菌活性,有望代替抗生素用于细菌感染性疾病的治疗。     

金黄色葡萄球菌前噬菌体PT1028ORF001基因的生物信息学分析及原核表达

[目的]对金黄色葡萄球菌前噬菌体的PT1028ORF001基因进行生物信息学分析,并进行原核表达,为金黄色葡萄球菌前噬菌体基因的功能研究提供参考数据。[方法]将金黄色葡萄球菌ATCC 25923菌株功能未知的基因通过BLAST比对,从中发现了一个噬菌体PT1028的基因序列,将该基因命名为PT1028ORF001。使用Protparam、Prot Comp9. 0、NCBI保守结构域数据库、TMpred、Net Phos 3. 1 Server、PSIPRED、SWISS-MODEL等在线生物信息软件,分析PT1028ORF001蛋白的理化性质、亚细胞定位、保守结构域、跨膜区域、磷酸化修饰位点、二级结构和三维结构。用自行设计的引物扩增PT1028ORF001基因,扩增产物经酶切回收后与原核表达载体p ET-32a相连接,构建重组表达质粒,将该重组质粒转化E. coli TG1内,经菌落PCR鉴定后,增菌培养并提取质粒,再转化E. coli BL21 (DE3),经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE检测分析。[结果]PT1028ORF001蛋白由569个氨基酸组成,相对分子质量为64 671. 34 Da,等电点为8. 07,负电荷氨基酸残基总数为71个,正电荷氨基酸总数为73个,分子式:C2894H4530N762O885S16,原子总数9087个,是一种稳定的亲水蛋白质,定位于细胞膜上,与功能未知的DUF927蛋白超家族具有高度同源性,第202-223、240-258位氨基酸分别形成一个典型的跨膜区,潜在的磷酸化修饰位点共71个,二级结构中ɑ螺旋占比最高(40. 60%),其次是无规则卷曲(39. 89%),三维空间结构与二级结构预测结果相符。成功构建了表达载体p ET-32a(+)-PT1028ORF001,经IPTG诱导后重组蛋白获得了表达,蛋白相对分子质量为82. 4 k Da。[结论]PT1028ORF001基因的生物信息学分析结果以及该基因的成功克隆与表达,为深入研究该蛋白及其他金黄色葡萄球菌前噬菌体基因的功能奠定了一定基础。     

金黄色葡萄球菌肠毒素A的基因克隆、表达及活性试验

利用PCR从金黄色葡萄球菌标准株（Staphylococcus aureus, ATCC13565）中克隆了金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)的基因,序列测定结果与报道完全一致。构建了表达载体pETSEA并获得高效表达,重组蛋白（rSEA）在37℃诱导时以包涵体形式存在,降低温度则出现可溶表达,可溶性rSEA占总rSEA的55%。可溶性rSEA经Ni²⁺亲和层析纯化,达电泳纯。通过同源模建对rSEA对SEA进行结构比较,结果表明尽管rSEA比野生型SEA多了9个氨基酸但其结构并没有明显的变化。单核细胞增殖试验进一步证明了该结论：将rSEA与SEA同外周血单个核细胞共同培养,两者均能有效地促进其增殖。将rSEA与体内激活的脾细胞共培养,则能增强脾细胞的体外抑瘤活性。     

金黄色葡萄球菌丝氨酸类蛋白酶B的表达及活性鉴定

目的:以金黄色葡萄球菌基因组DNA为基础,在枯草芽孢杆菌中得到具有剪切功能的金黄色葡萄球菌丝氨酸类蛋白酶B。方法:以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板,PCR扩增得到SplB基因,同源重组到表达载体pHTSHIS上,再转化枯草芽孢杆菌;优化诱导条件发酵枯草芽孢杆菌,离心后超滤浓缩上清液,再经镍柱分离纯化;利用SDS-PAGE、Lowry法对蛋白的相对分子质量、浓度等进行分析,对蛋白的酶切活性进行鉴定。结果:金黄色葡萄球菌基因组DNA经PCR扩增得到与预计大小相符的DNA片段,通过同源重组构建了表达载体pHTS-SplB-His;选取诱导前菌液D_(600nm)为2.0、IPTG浓度为0.5 mmol/L、诱导4 h的最优条件发酵枯草芽孢杆菌,表达大量金黄色葡萄球菌丝氨酸类蛋白酶B;蛋白浓缩后,经镍柱分离纯化得到纯度较高且具有剪切功能的金黄色葡萄球菌丝氨酸类蛋白酶B。结论:采用枯草芽孢杆菌进行发酵表达,可提高金黄色葡萄球菌丝氨酸类蛋白酶B的表达量,并且能够得到具有剪切功能的蛋白。本研究可为外源蛋白在枯草芽孢杆菌中的发酵技术提供重要参考。     

炭疽杆菌噬菌体裂解酶基因在大肠杆菌中的表达及鉴定

利用PCR方法扩增炭疽杆菌噬菌体裂解酶 (γlysin)基因 ,克隆至大肠杆菌表达载体pET2 2b中 ,经菌落PCR筛选、序列测定和酶切鉴定证实表达载体pET22b-γlysin构建成功 ,并在EscherichiacoliBL21(DE3)中获得了高表达。目的蛋白约占菌体总蛋白的40% ,5L发酵罐中的产酶水平高达 15g L。菌体经超声破碎 ,制备无细胞抽提液 ,StreamlineSP和SPHP柱层析以及SephacrylS-100凝胶过滤三步纯化 ,得到分子量为 2 7kD单一条带的目的蛋白 ,薄层扫描分析显示其纯度大于 95 %。目的蛋白的收率为19.1% ,纯化倍数为350。生物活性鉴定重组的γ噬菌体裂解酶具有特异性 :可快速裂解炭疽杆菌 ,比活为 1400u mg左右 ;而对大肠杆菌、枯草杆菌及蜡样芽孢杆菌没有裂解活性。     

用裂解气相色谱分析法鉴别带有不同前噬菌体的溶原性金黄色葡萄球菌

α和β为两株温和性噬菌体,金黄色葡萄球菌1157为不带前噬菌体的非溶原性菌株,分别或同时经α、β溶原化后,得到溶原性菌株1157(α),1157(β)及1157(α、B),前两者分别带有前噬菌体α或β,后者带α和β,为双溶原性株,4株菌用居里点裂解器-岛津GC-R1A计算机气相色谱仪进行分析,以目视法及计算数据分析法均能较好地鉴别1157,1157(α),1157(β)和1157(α、β)各菌株。