利用蛋白标签纯化酿酒酵母RAVE-V_1复合物

RAVE(regulator of the H+-ATPase of the vacuolar and endosomal membranes)是调节液泡ATP酶(V-ATP酶)装配与拆卸过程的调节酶,由Rav1p、Rav2p和Skp1p 3个亚基构成。在酿酒酵母细胞中,当葡萄糖耗尽时,V-ATP酶分解成V1、V0两部分,此时,RAVE与V1以复合物的形式存在于细胞质中。本研究利用同源重组技术,构建在基因RAV2的3'端定点插入FLAG标签的重组菌株BY4742 RAV2-FLAG,通过亲和层析原理纯化RAVE-V1复合物,为后续利用电子显微镜对其进行三维结构研究奠定坚实的基础。结果表明:FLAG标签添加到Rav2p的C端可以成功纯化出RAVE-V1复合物;结合质谱鉴定首次发现了Leu1p与RAVE存在相互作用关系,这使得对RAVE的研究转向一个全新的方向;此外,本研究方案对其他调节蛋白及与之相互作用的蛋白组的分离纯化具有借鉴意义。     

酿酒酵母rav2基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

RAVE(regulator of the H+-ATPase of the vacuolar and endosomal membranes)复合物由Ravl p,Rav2p和Skplp 3个亚基组成.将酿酒酵母中的rav2基因克隆到表达载体pETDuet-1中,构建重组质粒pETDuet-R2,并转化入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达.通过IPTG诱导,SDS-PAGE分析重组菌在诱导后表达出目的蛋白.目的蛋白经Ni-NTA凝胶纯化后再经质谱进一步验证确定为酿酒酵母的Rav2p蛋白.目前国际上还没有有关Rav2p的结构和性质以及RAVE亚基之间相互关系的研究.重组质粒pETDuet-R2的成功构建以及Rav2p的可溶性表达为研究RAVE亚基之间的相互作用以及V-ATP酶的活性调节机理打下基础.     

草地贪夜蛾V-ATPase亚基A、B、C和D基因的克隆与分析

【目的】克隆获得草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda V-ATP酶（Vacuolar-type proton,ATPase）V1结构域A、B、C和D亚基的cDNA序列,分析其在草地贪夜蛾不同生长阶段的表达情况,为筛选新型农药的靶点奠定基础。【方法】利用PCR技术获得草地贪夜蛾V-ATP酶V1结构域A、B、C和D亚基基因的ORF区域,采用qRT-PCR技术检测各基因在草地贪夜蛾不同发育时期的表达水平。【结果】A、B、C和D亚基基因均在不同鳞翅目昆虫中高度保守。A-D亚基在草地贪夜蛾各生长阶段均有表达,在幼虫阶段和成虫阶段的表达量均较高,表明V-ATP酶可能影响幼虫生长发育和成虫交配繁殖。卵期和蛹期表达量低,这与卵期和蛹期昆虫各项生命活动低有关。各亚基在各发育时期的表达量存在差异,说明V-ATP酶A、B、C和D发挥不同的功能。【结论】从草地贪夜蛾中克隆了V-ATP酶V1结构域A、B、C和D亚基4个基因在草地贪夜蛾不同发育阶段表达量具有差异,推测其对草地贪夜蛾的生长、发育和繁殖具有重要的调控作用。     

肠出血性大肠杆菌Ⅲ型分泌系统ATP水解酶escN基因突变株的构建

目的:利用λ噬菌体的Red重组系统敲除肠出血性大肠杆菌O157∶H7的Ⅲ型分泌系统ATP水解酶Esc N,构建大肠杆菌esc N基因缺失突变株。方法:以O157∶H7为模板,PCR扩增目的基因两侧的同源臂序列,分别酶切连接于p UC19-kan质粒上,PCR获得中间嵌合卡那霉素抗性基因(带有FRT位点)的同源线性片段,利用质粒p KD46和p CP20介导的重组技术敲除esc N基因,并去除抗性标记;PCR及测序验证目的基因缺失后,测定缺失株及野生菌株的生长曲线。结果:敲除了肠出血性大肠杆菌O157∶H7的esc N基因,突变株与野生株的生长曲线相近。结论:构建了Ⅲ型分泌系统缺陷菌株,为进一步研究Ⅲ型分泌系统因子在肠出血性大肠杆菌致病过程中的作用奠定了基础。     

溶葡球菌酶在乳酸克鲁维酵母中重组表达、诱变、优化及酶学研究

根据模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans)的溶葡球菌酶基因序列以及乳酸克鲁维酵母密码子偏好性设计引物扩增溶葡球菌酶基因表达片段,构建溶葡球菌酶(lysostaphin,Lys)基因表达载体(p KLAC1-Lys),转化乳酸克鲁维酵母(K.lactis GG799),实现了Lys基因的分泌表达。对重组菌株(K.lactis GG799/p KLAC1-Lys)进行NTG随机化学诱变,优化表达条件,筛选获得高表达菌株,并通过Ni-NTA亲和层析纯化蛋白并研究其酶学性质。结果表明:通过诱变重组溶葡球菌酶乳酸克鲁维菌株,Lys酶比活性提高了约5.2倍(约8 000U/L)。最适接种量为40g/L,诱导过程中每24h添加一次终浓度为20g/L的半乳糖和NH_4NO_3可提高酶比活性,最适表达p H为7.0~7.5,最适反应p H为7.0~8.0,最适反应温度为37℃。实验表明,低于40℃,p H 3~6之间时,重组溶葡球菌酶较稳定。Sr~(2+)对其酶活性有明显的促进作用,Ba~(2+)、Ca~(2+)、Zn~(2+)、Cu~(2+)、Mn~(2+)、Mg~(2+)对其有明显的抑制作用。     

重组大肠杆菌共表达亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶发酵条件优化

在摇瓶中对共表达亮氨酸脱氢酶(Leu DH)和甲酸脱氢酶(FDH)的重组大肠杆菌(E.coli)的发酵条件进行优化。首先考察基础培养基中碳、氮源种类和浓度及初始p H等因素对重组大肠杆菌生长和产酶的影响,实验结果表明甘油和酵母膏为最佳碳源和氮源,最适质量浓度均为10 g/L,培养基最适初始p H为8.0。然后对诱导条件进行优化,确定最适的诱导时机为菌体密度(OD600)达到0.6时,最适的诱导温度、诱导剂IPTG浓度和诱导时间分别为25℃、0.2 mmol/L和20 h。在优化后的培养条件下,菌体密度(OD600)可达8.6,Leu DH和FDH酶比酶活分别达1 543.3和2 572.4 U/L,是优化前的2.0和3.1倍。     

粉红黏帚霉糖化酶基因的克隆、表达及酶学性质分析

用黑曲霉(Aspergillusniger)G1为宿主菌表达粉红黏帚霉(Gliocladiumroseum)糖化酶。运用PCR技术从粉红粘帚霉中扩增得到一个疑似糖化酶基因序列(约1.8 kb),并将其连接到载体p Gm上组建成重组质粒p Gm-3440。将重组质粒转化到黑曲霉G1菌株中,经amd S筛选及PCR验证获得表达糖化酶的黑曲霉重组工程菌。重组菌的发酵结果显示,糖化酶基因在黑曲霉中得到了分泌表达,用国标法(QB/T 1803-1993)测得重组糖化酶活性达292 U/m L。进一步对其酶学性质进行分析发现,该重组酶最适温度和p H分别为50℃和5.0,该酶的耐热性较差,p H稳定性较好。     

幽门螺旋杆菌重组尿素酶B亚基的纯化及其免疫学性质的研究

目的:幽门螺旋杆菌(Hp)尿素酶是Hp重要的定制因子和致病因子,Hp尿素酶活性位点位于Hp尿素酶B亚基(UreB),研发基于UreB的Hp疫苗是一种很有前景的防治Hp感染的策略。方法:主要利用基因克隆技术从幽门螺旋杆菌标准菌株SS1(Hp SS1)获得Hp尿素酶B亚基基因,并构建含有重组Hp尿素酶B亚基(rUreB)基因的重组表达载体pET-rUreB及其重组菌株;重组菌株经蛋白表达和优化后,利用Ni-NTP镍离子亲和层析和DEAE Sepharose FF阴离子交换层析纯化重组尿素酶B亚基(rUreB),并进一步通过腹腔注射免疫BALB/c小鼠,研究rUreB的免疫学性质。结果:通过基因克隆技术成功获得了Hp尿素酶B亚基基因,并成功构建了重组表达载体pET-rUreB及其重组菌株BL21(DE3)/pET-rUreB,经蛋白表达优化及纯化,可获得高纯度(96.5%)的重组蛋白rUreB。重组蛋白rUreB辅以弗氏佐剂腹腔注射免疫BALB/c小鼠,经间接ELISA鉴定小鼠能够产生针对天然Hp尿素酶和UreB的高滴度特异性抗体,且能够显著性抑制Hp尿素酶的活性。结论:重组Hp尿素酶B亚基能够在大肠杆菌表达系统中获得较高水平的表达,具有较高的免疫学特异性,其抗体能够有效抑制Hp尿素酶活性。为研究基于尿素酶的防治Hp感染的Hp疫苗奠定了一定的实验基础。     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7 z1445基因缺失株的构建

目的:利用Red重组系统敲除肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7的z1445基因,构建大肠杆菌z1445基因缺失突变株。方法:以O157∶H7为模板,PCR扩增目的基因两侧的同源臂序列,分别经酶切后连接到p UC19-kan质粒的卡那霉素抗性基因kan两侧,PCR获得中间嵌合kan基因(带有FRT位点)的同源线性片段,利用质粒p KD46敲除z1445基因,利用质粒p CP20去除抗性标记基因;PCR鉴定及测序验证目的基因缺失后,测定缺失株及野生株的生长曲线。结果:敲除了z1445基因,突变株与野生株的生长曲线接近。结论:构建了z1445基因缺陷型菌株,为进一步分析z1445基因在O157∶H7与宿主的相互作用中发挥的作用提供了材料。     

一株产碱性蛋白酶菌株的筛选鉴定及酶学特性研究

【目的】从丝茅草中筛选得到产蛋白酶菌株并研究驯化过程中微生物群落结构,以及探究该菌株的生长特性和蛋白酶的酶学特性。【方法】通过高通量测序探究来源于丝茅草的菌株在不同培养条件下细菌种类及丰度,通过选择性培养基来筛选能够分解酪素并产生蛋白酶的菌株,通过单因素试验方法确定环境因子对菌株生长和蛋白酶活性的影响。【结果】微生物群落结构在基础培养基和牛肉膏蛋白胨培养基中不同。通过含酪素的选择性培养基里筛选到1株产蛋白酶菌株H-16,经生理生化试验和16S r DNA鉴定知该菌株属于Escherichia marmotae,菌株H-16能产生分子量为70 k Da左右的单亚基蛋白酶。胰蛋白胨、蔗糖、30°C或35°C、p H 7分别为菌株生长的最适氮源、碳源、温度和p H。菌株H-16分泌的蛋白酶最适p H为6–8,在50°C及6%盐度以下酶活性几乎不受影响。此外,Cu(II)和Ag(I)等金属离子能够抑制蛋白酶的活性。【结论】该菌株H-16为嗜中温菌株,能够产生碱性蛋白酶。     

高产二羟基丙酮重组菌株的构建

旨在构建一株过量表达编码膜系甘油脱氢酶的sld AB基因的重组菌株,以提高二羟基丙酮产量。以氧化葡萄糖酸杆菌ATCC621H的基因组DNA为模板,运用PCR方法扩增得到基因sld AB,并连接到p BBR1MCS-2质粒上,构建表达载体p BBR1MCS-2-sld AB。通过电转化将载体p BBR1MCS-2-sld AB转化进入氧化葡萄糖酸杆菌ATCC621H内,得到重组菌株GOX205。结果显示,重组菌株构建成功,其甘油脱氢酶的酶活力较之于出发菌株提高了26%。在甘油初始浓度100 g/L的甘油发酵培养基中,较之于出发菌株,GOX205的生长状况良好,发酵52 h时DHA浓度达到94.1 g/L,较之于出发菌株提高了19.7%,甘油残量降低了15.1 g/L。     

毕赤酵母GS115中N-乙酰转移酶在大肠杆菌中的克隆表达与性质研究

为了研究P.pastoris Mpr1的生理特性,在E.coli JM109胞内中成功表达来源于P.pastoris GS115的Mpr1酶,并利用响应面分析法对诱导温度、IPTG诱导浓度、起始诱导OD进行发酵优化,酶活达到(610.3±9.5)m U/m L。酶学性质显示,Mpr1酶的最适反应p H范围为7.0-7.5,最适反应温度是30℃。通过分析重组表达Mpr1菌株和对照菌株的培养过程,显示重组菌株的生长能力显著增强,原因是Mpr1降低了细胞内的ROS水平。     

一株产耐酸性α-淀粉酶菌株的鉴定及其酶学性质研究

随着现代淀粉工业的发展,寻找耐酸性新型α-淀粉酶成为研究热点。实验室分离到一株高产耐酸性α-淀粉酶菌株AF1。通过形态学观察法、生理生化特征与16Sr DNA序列分析鉴定出AF1菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。对其酶学性质进行初步研究发现,该酶最适作用温度为75℃,p H为5.0;在温度60℃以下,p H 5.0~7.0范围内酶活比较稳定;Cu2+对酶活有明显抑制作用,K+、Li+、Fe3+则对酶活有轻微抑制作用,Na+、Ca2+、Ba2+、Mg2+和EDTA则对酶活没有明显影响。可见,本研究中的α-淀粉酶是一种不依赖于Ca2+的耐酸性α-淀粉酶,在淀粉加工过程中,不仅不用加Ca2+以维持酶的活性,同时可以不用p H调节,实现在弱酸性条件下淀粉液化和糖化同步进行,从而精简工序,节约成本。     

大豆液泡膜H~+-ATPase的纯化和重组

通过不连续蔗糖密度梯度离心得到的液泡膜微囊 ,先由胆酸钠和 OG分步破膜抽提、经阴离子交换柱 ( Q- Sepharose)层析分离 .纯化后的酶含 V型 H+ - ATPase的主要亚基 ,与大豆磷脂重组 ,获得了有较高泵活性的脂酶体 .脂酶体的质子泵活性受 Valinomycin激活 ,说明它是致电性的 ,受NO-3 ,DCCD以及特异性的 V型 ATPase抑制剂 Bafilomycin的抑制 .脂酶体的泵活性不受 F型和P型 ATPase抑制剂抑制 ,表明质子转运是由 V型 H+ - ATPase引起的 .     

重构酿酒酵母N-糖基化途径生产人源化糖蛋白

【目的】为了在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中生产人源化的糖蛋白,必须对N-糖基化途径进行基因工程改造。作者通过敲除一些酵母N-糖基化途径中的特异性糖基转移酶,得到一株可以用于继续表达人类糖基转移酶的重组菌,并通过生长适应性进化技术回复其细胞生长能力。【方法】首先运用酵母遗传学和分子生物学技术敲除酿酒酵母的α-1,3-甘露糖基转移酶基因(ALG3)、α-1,6-甘露糖基转移酶基因(OCH1)和α-1,3-甘露糖基转移酶基因(MNN1)。采用蔗糖酶(invertase)活性染色实验初步检测N-糖链的变化,然后通过高效液相色谱和甘露糖苷酶酶切实验对其糖链结构进行鉴定。重组菌通过在高温条件下进行生长适应性进化,筛选出生长能力回复突变的菌株。【结果与结论】构建了Δalg3Δoch1Δmnn1菌株得到人类糖基化中间体Man5GlcNAc2,并对上述三缺陷型菌株进行适应性进化提高其细胞生长能力和环境适应能力。此外,作者还发现,该重组菌存在少量Man6GlcNAc2结构的糖链。经体外α-1,2-甘露糖苷酶切处理后,糖链Man5GlcNAc2和Man6GlcNAc2均转化为Man3GlcNAc2,表明形成Man3GlcNAc2之后的甘露糖之间均通过α-1,2-糖苷键连接。Δalg3Δoch1Δmnn1菌株的构建获得了生产人源化糖蛋白的酿酒酵母表达系统,为进一步糖基化改造和工业应用提供了良好的基础。     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7前噬菌体CP-933Y缺失突变株的构建

目的:利用Red重组系统敲除肠出血性大肠杆菌O157∶H7前噬菌体片段CP-933Y,进而构建CP-933Y缺失突变株。方法:以肠出血性大肠杆菌O157∶H7菌株为模板,加入酶切位点PCR扩增前噬菌体CP-933Y上、下游各600 bp的同源臂序列;酶切后分别连接到p UC19-kan质粒的卡那霉素(包含FRT位点)抗性基因两侧,构建中间是卡那霉素抗性基因标记含有目的基因上、下游同源序列的线性片段;导入含有p KD46质粒的O157∶H7菌株中,利用Red编码的同源重组酶使该片段与目的基因上、下游发生同源重组,卡那霉素抗性基因置换菌株中CP-933Y前噬菌体片段,最后导入p CP20质粒去除卡那霉素抗性标记基因。结果:经PCR及测序验证,O157∶H7菌株中前噬菌体片段CP-933Y被敲除,敲除株与野生株具有相似的生长曲线。结论:构建了大肠杆菌O157∶H7前噬菌体CP-933Y缺失株,为进一步研究前噬菌体CP-933Y的功能奠定了基础。     

pLNCX-pemt2重组载体的构建及pemt2基因在大鼠肝癌CBRH-7919细胞中的表达

为进一步研究 pemt2对肝癌细胞生长抑制的作用机制提供方便的实验模型 ,构建了p LNCX- pemt2重组体 .将目的基因 pemt2连接入含有 neo抗性基因的真核细胞表达载体 p LNCX中 ,构建 p LNCX- pemt2重组子 ,并用磷酸钙沉淀法将其转入大鼠肝癌 CBRH- 791 9细胞中 ,应用PCR、Western印迹及 [3 H]SAM参入等技术对其转染、表达及活性进行鉴定 .转染 p LNCX- pemt2的大鼠肝癌细胞 ,PEMT2成功表达 (分子量为 2 2 .5k D) ;高表达克隆 PEMT2的表达量比对照组高约 5倍 ,其活性比对照组高 2 .1倍 ;细胞生长的倍增时间从 2 1 .54± 7.0 8h延长到 43.2 2± 7.1 1h.结果表明 ,p LNCX- pemt2重组体转入肝癌细胞后 ,PEMT2蛋白得到高效表达 ,明显抑制肝癌细胞生长 .     

pLNCX-pemt2重组载体的构建及pemt2基因在大鼠肝癌CBRH-7919细胞中的表达

为进一步研究 pemt2对肝癌细胞生长抑制的作用机制提供方便的实验模型 ,构建了p LNCX- pemt2重组体 .将目的基因 pemt2连接入含有 neo抗性基因的真核细胞表达载体 p LNCX中 ,构建 p LNCX- pemt2重组子 ,并用磷酸钙沉淀法将其转入大鼠肝癌 CBRH- 791 9细胞中 ,应用PCR、Western印迹及 [3 H]SAM参入等技术对其转染、表达及活性进行鉴定 .转染 p LNCX- pemt2的大鼠肝癌细胞 ,PEMT2成功表达 (分子量为 2 2 .5k D) ;高表达克隆 PEMT2的表达量比对照组高约 5倍 ,其活性比对照组高 2 .1倍 ;细胞生长的倍增时间从 2 1 .54± 7.0 8h延长到 43.2 2± 7.1 1h.结果表明 ,p LNCX- pemt2重组体转入肝癌细胞后 ,PEMT2蛋白得到高效表达 ,明显抑制肝癌细胞生长 .     

羊蹄叶过氧化物酶的纯化和酶学性质研究北大核心CSCD

采用磷酸缓冲液浸提法提取羊蹄叶POD,对影响酶提取的主要因素(料液比、浸提液p H、浸提温度和浸提时间)进行单因素实验和正交实验,用p H沉淀和丙酮沉淀对酶进行了纯化,并研究了其酶学性质。结果表明,羊蹄叶POD的最佳提取条件是料液比为1∶40,提取液p H为9,浸提温度是35℃,浸提时间为30 min。调节提取液的p H为5以及用1倍和0.8倍体积的丙酮沉淀提取液时蛋白相对沉淀量多和酶的比活性大。羊蹄叶POD以愈创木酚和H2O2为底物的Km分别是0.12 mmol/L和0.62×10-3mmol/L。Cu SO4对羊蹄叶POD活性有激活作用,而Zn SO4、Mg SO4、Ca Cl2、KCl和Na Cl对POD活性有抑制作用。研究证明羊蹄叶POD的提取和纯化方法简单有效,其酶学性质为理解羊蹄植物的生长特性和酶学应用提供依据。     

羊蹄叶过氧化物酶的纯化和酶学性质研究

采用磷酸缓冲液浸提法提取羊蹄叶POD,对影响酶提取的主要因素(料液比、浸提液p H、浸提温度和浸提时间)进行单因素实验和正交实验,用p H沉淀和丙酮沉淀对酶进行了纯化,并研究了其酶学性质。结果表明,羊蹄叶POD的最佳提取条件是料液比为1∶40,提取液p H为9,浸提温度是35℃,浸提时间为30 min。调节提取液的p H为5以及用1倍和0.8倍体积的丙酮沉淀提取液时蛋白相对沉淀量多和酶的比活性大。羊蹄叶POD以愈创木酚和H2O2为底物的Km分别是0.12 mmol/L和0.62×10-3mmol/L。Cu SO4对羊蹄叶POD活性有激活作用,而Zn SO4、Mg SO4、Ca Cl2、KCl和Na Cl对POD活性有抑制作用。研究证明羊蹄叶POD的提取和纯化方法简单有效,其酶学性质为理解羊蹄植物的生长特性和酶学应用提供依据。