FUT8基因RNAi慢病毒载体的构建及对MCF-7细胞增殖的影响

旨在构建FUT8基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体并观察其对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响。针对FUT8基因设计3组短发夹RNA序列,退火合成双链DNA,通过连接线性化的p GC-LV-GFP载体,构建mi RNA慢病毒载体质粒,并将其转化至感受态细胞DH5α;测序验证正确后进行FUT8基因慢病毒载体的包装及病毒滴度测定,将获得的重组慢病毒p GC-sh FUT8转染MCF-7细胞,利用Real time-PCR、Western blot分别验证转染后MCF-7细胞中FUT8 m RNA及蛋白的表达,MTT法及克隆形成实验检测sh FUT8对MCF-7细胞增殖能力的影响。测序证实成功构建针对FUT8基因的RNAi慢病毒载体;慢病毒载体经293T细胞包装成功,测定病毒悬液滴度5×108 TU/m L;荧光显微镜下观察各转染组细胞GFP的表达,转染效率达90%以上;Real-time PCR、Western blot结果显示干扰组FUT8的m RNA及蛋白表达水平较对照组显著降低,其中p GC-sh FUT8-2序列对FUT8基因的干扰效率可达80%,干扰效果最佳,FUT8沉默后MCF-7细胞增殖能力下降。     

TOX3基因RNAi慢病毒载体的构建及对乳腺癌ZR-75-1细胞增殖的影响

旨在构建TOX3基因RNAi慢病毒载体并观察其对人乳腺癌ZR-75-1细胞增殖能力的影响。针对TOX3基因设计干扰靶序列,构建载体,测序正确后进行慢病毒包装及滴度测定。转染ZR-75-1细胞,荧光显微镜下观察表达GFP的细胞数目,实时荧光定量PCR及Western blot实验验证转染后ZR-75-1细胞中TOX3 mRNA和蛋白的表达。MTT及平板单克隆实验检测TOX3对ZR-75-1细胞增殖能力的影响。结果显示,各组载体序列正确,病毒滴度均2×108 TU/mL,表达GFP细胞数目均可达95%以上。各干扰组TOX3 mRNA及蛋白表达水平均降低,其中TOX3-shRNA-3组干扰效果最佳,转染后ZR-75-1细胞的增殖和单克隆形成能力下降。成功构建TOX3基因的RNAi慢病毒载体,沉默TOX3后ZR-75-1细胞的增殖能力下降。     

SGK3基因RNAi慢病毒载体的构建及其对乳腺癌MB-474细胞增殖和凋亡的影响

旨在构建SGK3基因RNAi慢病毒表达载体,观察其对人乳腺癌细胞MB-474增殖和凋亡的影响。构建靶向SGK3的shRNA序列慢病毒载体,将其转染至人乳腺癌MB-474细胞以沉默SGK3基因,Real-time PCR、Western bloting方法检测MB-474细胞SGK3 mRNA及蛋白表达,MTT法和流式细胞术检测SGK3基因沉默对MB-474细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响。测序结果显示,成功构建4组SGK3基因RNAi慢病毒表达载体,经293T细胞包装,病毒滴度为(3-8)×108 TU/m L;将慢病毒转染MB-474细胞后,Real-time PCR、Western bloting结果显示,干扰组SGK3的表达水平较对照组均降低,且PGC-LV3-SGK3-1序列对其干扰效果最佳,SGK3基因沉默可抑制MB-474细胞增殖、促进凋亡,但其对细胞周期进程无明显影响。成功构建靶向SGK3基因的RNAi慢病毒载体,SGK3基因沉默可影响乳腺癌细胞增殖和凋亡等生物学行为。     

慢病毒介导的RNA干扰ppGalNAc-T2基因表达抑制Jurkat细胞增殖和迁移

在肿瘤中,黏蛋白O-糖基化有着重要的生物学功能.控制O-糖基化起始合成的是多肽∶N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族,研究该酶家族对阐明O-糖基化在肿瘤中的作用机制有重要的意义.探讨了靶向干扰ppGalNAc-T2基因表达对白血病Jurkat细胞株增殖及迁移的影响.首先合成ppGalNAc-T2特异shRNA干扰及对照序列,将其连接至慢病毒干扰载体YH1;重组载体经双酶切、测序鉴定正确后与包装质粒共转染293T细胞,获得的病毒颗粒经过滤纯化后感染Jurkat细胞,流式细胞分选仪进行细胞分选以获得ppGalNAc-T2基因稳定干扰表达的Jurkat细胞,然后使用RT-PCR和Western blot方法对各组别细胞中ppGalNAc-T2基因表达情况进行分析,以确定ppGalNAc-T2基因表达被有效干扰;进一步利用MTT实验和Transwell实验分析ppGalNAc-T2基因干扰表达对Jurkat细胞增殖及迁移的影响.结果表明,成功构建了靶向干扰ppGalNAc-T2基因表达的慢病毒载体,感染Jurkat细胞后能稳定干扰ppGalNAc-T2基因表达.MTT和Transwell实验研究发现,下调ppGalNAc-T2基因表达对Jurkat细胞增殖和迁移有抑制作用.     

短发夹RNA慢病毒载体稳定抑制NLRP3表达的HepG2细胞的构建

目的:构建针对NLRP3基因的短发夹RNA(sh RNA)慢病毒表达载体,在Hep G2细胞中鉴定该载体对NLRP3的抑制效果。方法:设计针对NLRP3基因的sh RNA序列,将其插入慢病毒表达载体p WPT-U6-sh RNA-CMV-GFP中,将载体与包装质粒ps PAX2、p MD2.G共转染293T细胞,进行病毒包装;得到的病毒原液浓缩后系列稀释为9个浓度递减的病毒液,分别转染293T细胞后进行滴度测定;用获得的慢病毒液感染人肝癌细胞系Hep G2,获得稳定沉默NLRP3的细胞株;利用实时定量PCR和Western印迹检测稳定细胞株中NLRP3的沉默效应。结果:构建了具有沉默效应的慢病毒干扰载体;稀释法测定干扰病毒滴度为2×108TU/m L;实时定量PCR和Western印迹实验均证实慢病毒转染后,细胞株中NLRP3表达水平明显降低。结论:构建了人NLRP3基因特异性慢病毒干扰载体,获得NLRP3基因稳定干扰的Hep G2细胞株。     

体外RNA干扰下调DEPTOR表达对人多发性骨髓瘤细胞增殖和凋亡能力的影响

目的:研究探讨应用RNA干扰技术构建人DEPTOR基因的shRNA慢病毒载体,鉴定在多发性骨髓瘤RPMI-8226细胞上的沉默效果,并评价DEPTOR对人多发性骨髓瘤细胞增殖和凋亡能力的影响.方法:设计4个DEPTOR siRNA序列,化学合成后退火形成双链,克隆到酶切的hU6-MCS-CMV-EGFP(GV115)-shRNA慢病毒载体.重组质粒经PCR测序鉴定后,脂质体介导下转染293T细胞,Western blot检测DEPTOR的表达,筛选出干扰效果最佳的GV115-shRNA.将筛选的GV 115-shRNA与慢病毒包装质粒共转染293T细胞生成病毒,收集病毒上清并浓缩,测定浓度.将病毒颗粒感染多发性骨髓瘤RPMI-8226细胞,应用Real-time PCR方法从mRNA水平及Western blot方法从蛋白水平检测DEPTOR的沉默效果.运用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测骨髓瘤细胞增殖能力的变化;流式细胞仪检测细胞凋亡;用Western blot分析cleaved caspase-3和cleaved PARP的变化.结果:构建的慢病毒载体shRNA的PCR鉴定和测序正确,成功筛选出最有效抑制DEPTOR表达的shRNA2序列,包装病毒后滴度达到1×109TU/ml.慢病毒感染RPMI-8226细胞后可表达EGFP,Real-time PCR和Western blot检测DEPTOR的表达明显下降.下调DEPTOR基因可显著减慢骨髓瘤细胞的生长速度(P＜0.05),肿瘤细胞的凋亡率上升(P＜0.01).DEPTOR shRNA上调cleaved caspase-3、cleaved PARP和Bax表达,下调Bcl-2及PI3K/Akt信号通路的表达(P＜0.01).结论:成功构建了DEPTOR shRNA重组慢病毒载体,其转染多发性骨髓瘤RPMI-8226细胞后显著抑制了DEPTOR的表达.DEPTOR shRNA可以有效地诱导骨髓瘤细胞的凋亡,并抑制肿瘤细胞的增殖.PI3K/Akt信号通路可能参与了其凋亡过程.     

CHD5基因RNAi慢病毒载体的构建及其对结直肠癌细胞生物学功能的影响

目的:研究人类肿瘤相关基因CHD5基因miR-shRNA慢病毒对结直肠癌Lovo细胞的影响。方法:利用软件设计对CHD5基因干扰有效的序列,合成靶序列,退火形成双链DNA,酶切后与载体相连接。将重组慢病毒载体pPRIME-TET-GFP-CHD5与慢病毒包装质粒pCMV-VSV-G,pRSV-Rev,pMDLg-pRRE共转染293FT细胞,将包装重组慢病毒感染人类结直肠癌Lovo细胞。通过荧光定量PCR和Western blot验证CHD5基因在细胞中的表达情况,应用MTT检测CHD5低表达对Lovo细胞增殖的影响。结果:成功构建pPRIME-TET-GFP-CHD5重组质粒,经酶切及序列测定正确,包装的病毒滴度为3.1×106TU/ml。用制备的病毒上清感染Lovo细胞后,荧光定量PCR和Western blot分析结果显示该慢病毒可分别在转录和蛋白质水平上抑制Lovo细胞CHD5基因的表达,并使得Lovo细胞增殖失控。结论:成功构建CHD5慢病毒表达载体,表达的慢病毒可有效的感染Lovo细胞,提高Lovo细胞的增殖能力。     

miR-125b慢病毒表达载体的构建及其对卵巢癌SKOV3细胞增殖和迁移的影响

构建并鉴定miR-125b慢病毒过表达载体,研究miR-125b对卵巢癌细胞增殖和迁移的影响及其可能机制。将PcR扩增的rniR-125b前体序列与经过酶切后的GP—SupersilencingVector进行连接,产生miR-125b重组慢病毒表达载体。将重组慢病毒载体质粒、pGag／Pol、pRev和pVSV-G共转染293T细胞,包装产生慢病毒。使用收获的病毒颗粒感染卵巢癌SKOV3细胞,嘌呤霉素筛选稳定感染细胞株;实时荧光定量PCR（Real．timeqPCR）检测miR-125b在SKV03细胞中的表达;Westernblot检测其潜在靶基因HER-2的表达：MTT实验和Transwell侵袭实验分别观察miR-125b过表达后SKOV3细胞增殖和迁移能力的改变。该研究成功构建miR-125b陧病毒过表达载体,感染卵巢癌SKOV3细胞后,能够过表达miR-125b,并抑制SKOV3细胞的增殖及迁移,降低潜在靶基因HER-2的表达。该研究证叽miR-125b能够抑制SKOV3细胞的增殖及迁移,并可能通过降低潜在靶基因HER-2的表达而实现。     

敲低CXCR4表达抑制胃癌细胞HGC27的增殖

目的:初步探索CXCR4与胃癌细胞HGC27增殖的关系。方法:构建携带CXCR4短发夹RNA(shRNA)的慢病毒载体质粒,并转染至293T细胞中,48 h后收集上清感染HGC27细胞,用Western印迹鉴定其干扰CXCR4蛋白表达的效果,采用CCK8实验检测敲低CXCR4表达对HGC27细胞增殖的影响。结果:双酶切鉴定和基因测序表明敲低CXCR4慢病毒载体质粒构建成功;慢病毒感染后有效抑制HGC27细胞中CXCR4蛋白水平,敲低CXCR4表达对HGC27细胞增殖有显著的抑制作用。结论:CXCR4参与了胃癌细胞HGC27的增殖,提示CXCR4有望成为一个新的胃癌治疗靶点。     

RNA干扰NUP88基因对人乳腺癌MCF-7细胞生长及侵袭力的影响

目的： 构建重组慢病毒介导的NUP88-shRNA载体,通过RNAi技术分别观察沉默NUP88后对MCF-7增殖,粘附,侵袭和转移情况的影响,为乳腺癌的临床基因治疗寻找新的靶点。方法： 构建NUP88重组慢病毒表达载体,包装后检测滴度,以最佳复感染指数转染乳腺癌MCF-7细胞,利用RT-PCR和Western blot检测各组MCF-7细胞中mRNA和蛋白的表达效率;MTT法和流式细胞仪检测法,检测NUP88基因被干扰后对MCF-7细胞增殖和凋亡的影响;细胞侵袭实验检测NUP88基因被干扰后对MCF-7侵袭力的影响。结果 四组病毒及一组阴性对照均构建成功,滴度均为4E+8TU/ml;RT-PCR和Western blot检测,结果表明：经NUP88-shRNA转染的MCF-7细胞组NUP88 mRNA和蛋白质的表达与经阴性转染组和空白MCF-7细胞组相比,差异明显具有统计学意义（P<0.01）;测定NUP88-shRNA1组沉默效率最高,沉默率可达到86%;MTT法结果表明：实验组经NUP88-shRNA1慢病毒转染后细胞增殖程度显著减少,与空白组和对照组相比有显著性差异（P<0.05）。流式细胞仪检测三组MCF-7细胞凋亡结果表明：实验组经慢病毒转染后细胞凋亡率显著增加,与对照组和空白组相比有显著性差异（P<0.05）;细胞侵袭实验表明：在肿瘤细胞常规培养24h后,实验组与空白组和阴性对照组比较,穿膜细胞数量明显减少,具有显著性差异（P<0.05） 结论： NUP88重组慢病毒可以通过RNAi成功抑制MCF-7中NUP88基因的表达,并能显著抑制其增殖及远处的侵袭能力。     

一种具有G418抗性筛选标记的慢病毒RNA干扰表达载体的构建及应用

目的:构建具有新霉素抗性筛选标记的RNA干扰慢病毒表达载体,并检测它对乙型肝炎病毒x基因(HBx mRNA表达的抑制作用。方法:从pcDNA3.0载体中扩增新霉素抗性基因并插入删除嘌呤霉素编码序列的pLKO载体中;将改构的RNA干扰载体包装成慢病毒后感染肝癌细胞HepG2,并检测感染细胞对G418的抵抗作用;为验证改构RNA干扰载体的有效性,设计了2条针对HBx的RNA干扰序列以及针对编码萤光素酶cDNA的干扰序列并插入该载体,将含新霉素筛选标记的HBx的RNA干扰载体与辅助质粒在293T细胞中包装成慢病毒并感染过表达HBx的HepG2(嘌呤霉素抗性)细胞,运用G418筛选出稳定混合克隆,提取细胞总RNA,运用RT-qPCR检测其在HepG2细胞中对HBx RNA表达的抑制作用。结果:构建的载体与辅助质粒包装出的慢病毒感染肝癌细胞后,细胞获得G418抗性;HBx RNA干扰序列克隆入该载体可有效抑制肝癌细胞中过量表达的HBx mRNA。结论:构建了具有新霉素抗性筛选标记的RNA干扰慢病毒表达载体,运用该载体可有效筛选出抑制目的基因表达的G418抗性的稳定细胞株。     

EGFL7 基因RNAi慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的：构建人类表皮生长因子域7（EGFL7）基因RNA干扰（RNAi）重组慢病毒表达载体。方法：参照小分子干扰RNA 的设 计原则,应用OligoDesigner 3.0 软件设计三条靶向人EGFL7 基因的RNA干扰序列（hEGFL7-RNAi）,并将其分别插入含有绿色 荧光蛋白（GFP）的慢病毒载体pLV3 中,获得重组质粒,与包装质粒pRsv-REV、pMDlg-pRRE 和pMD2G共同转染293T细胞,包 装产生重组慢病毒,培养72 h后,应用qRT-PCR 检测慢病毒感染人脐静脉内皮细胞（HUVEC）后靶基因mRNA 的水平,以评价 其基因沉默效果。结果：筛选出3 条人EGFL7 基因的RNAi 序列,分别包装出重组慢病毒,其滴度分别为1× 108、2× 108和5× 108TU/mL,将其转染入HUVEC 后,EGFL7mRNA表达均受到明显抑制(P<0.05)。结论：成功筛选出三条针对人EGFL7基因的 RNAi有效靶序列,并成功构建重组慢病毒表达载体,证明该序列可沉默HUVECs 中EGFL7 基因的表达。     

慢病毒介导的靶向c-Met可诱导shRNA稳定乳腺癌MDA-MB-231细胞系的构建及生物活性鉴定

目的:探讨适当敲除c-Met后对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响。方法:设计3条针对c-Met基因不同位点的短发夹RNA(shRNA)片段,将其连接到TA载体上,瞬时转染MDA-MB-231细胞,采用RT-PCR、Western印迹检测c-Met mRNA及蛋白表达情况,挑选沉默效率最佳的shRNA。以scramble为阴性对照,MDA-MB-231细胞为空白对照,挑选沉默效率最佳的TA-shRNA,并将其与pSD400慢病毒载体连接,利用293T细胞进行慢病毒组装,收集病毒液并感染MDA-MB-231细胞,将嘌呤霉素与MDA-MB-231细胞共培养,筛选稳定表达shRNA的细胞株。利用多西环素对稳定细胞系进行诱导,Western印迹检测稳定细胞系c-Met蛋白的表达量,MTT法检测敲低c-Met对稳定细胞系增殖的影响。结果:测序结果表明模板序列与设计序列正确,并筛选出沉默效率最高的shRNA为shRNA1,慢病毒包装后筛选出稳定细胞株,适当敲除MDA-MB-231细胞c-Met基因后细胞的增殖明显低于对照组。结论:构建了针对c-Met基因可诱导shRNA的乳腺癌稳定细胞系,为探讨适当敲除c-Met基因后乳腺癌细胞对化疗、放疗敏感性检测奠定了基础。     

慢病毒介导CD36基因沉默细胞株的构建及其对caveolin-1蛋白表达的影响

CD36作为重要的清道夫受体密切参与了巨噬细胞对氧化低密度脂蛋白的摄取作用,为了进一步研究CD36的功能,本文利用慢病毒介导的shRNA干扰技术,构建了CD36基因沉默巨噬细胞(J774A.1)株,并以此为模型分析了CD36在caveolin-1蛋白表达过程中的作用。首先,针对CD36基因序列设计合成5条shRNA片段,并构建得到pLKO.1-CD36-shRNA慢病毒干扰载体,测序鉴定后与psiCHECK-Ⅱ-CD36载体共转染入293T细胞中,筛选出有效的CD36-shRNA。将慢病毒干扰载体与病毒包装质粒共转染入293T细胞,包装得到慢病毒颗粒,之后感染J774A.1细胞,经嘌呤霉素筛选后得到CD36基因沉默稳转细胞株。Western blotting及激光共聚焦检测结果表明CD36基因沉默效率达90%,并且伴随着CD36的基因沉默,与之结合的DiI-oxLDL也随之大幅降低,证明构建成功具有良好生物学活性的CD36基因沉默细胞株。最后,抑制剂处理及oxLDL给药刺激实验结果表明,CD36的基因沉默能够显著降低JNK及ERK的磷酸化水平,进而抑制了caveolin-1的蛋白表达,表明CD36能够经由JNK及EKR信号传导调节caveolin-1的蛋白表达。     

LIN28基因对人胰腺癌细胞PANC1和SW1990增殖和迁移的影响

该文目的为研究LIN28基因对人胰腺癌细胞增殖和迁移的影响,揭示其在胰腺癌发生发展中的作用。实验发现,胰腺癌细胞中LIN28的表达模式与细胞增殖和迁移能力有关,将干扰质粒LIN28 sh RNA转染入LIN28高表达的PANC1细胞,将过表达载体3×Flag-LIN28转染入低表达的SW1990细胞中,采用RT-PCR和Western blot实验验证基因沉默或过表达的效果,并运用CCK-8法分析细胞的增殖能力并绘制细胞生长曲线,Transwell实验检测细胞迁移率。结果显示,下调LIN28后,PANC1细胞中LIN28基因的表达量明显降低,细胞增殖减慢,迁移减少;而上调LIN28后,SW1990细胞中LIN28基因的表达量明显增高,细胞增殖加快,迁移增加。由此说明,沉默LIN28基因可以抑制PANC1细胞增殖和迁移,过表达LIN28基因可以促进SW1990细胞增殖和迁移,这为阐明LIN28在胰腺癌演化过程中的机制奠定了实验基础。     

小鼠RNA干扰RelA基因慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建小鼠Rel A基因的RNA干扰慢病毒载体,转染小鼠成骨样细胞并鉴定。方法:针对小鼠Rel A基因序列,设计特异性的sh RNA序列,应用基因重组技术插入慢病毒载体GV-248。得到的重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选得到阳性克隆并扩大培养。所得质粒进行测序分析确定载体构建成功。重组质粒载体及包装辅助质粒转染293T细胞,得到目的病毒并测定相应病毒滴度。慢病毒转染MC3T3-E1细胞后,Real-time PCR及Western blot检测MC3T3-E1细胞Rel A基因及成骨相关基因ALP、OCN、RANKL的表达。结果:成功构建小鼠Rel A基因的RNA干扰慢病毒载体,感染MC3T3-E1细胞后,Rel A基因的表达明显受到抑制,同时RANKL基因表达水平明显下降,ALP、OCN基因表达水平明显上升。结论:成功构建了小鼠Rel A基因的RNA干扰慢病毒载体。当小鼠成骨细胞Rel A基因表达被干扰,NF-κB通路被抑制后,小鼠成骨细胞成骨相关基因ALP、OCN的表达明显上升,成骨功能增强;同时RANKL的表达明显下降,其介导的破骨细胞骨吸收功能减弱。     

小鼠RNA干扰基因RelA慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建小鼠RelA 基因的RNA 干扰慢病毒载体,转染小鼠成骨样细胞并鉴定。方法：针对小鼠RelA 基因序列,设计特异 性的shRNA 序列,应用基因重组技术插入慢病毒载体GV-248。得到的重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5-alpha,筛选得到阳性克隆 并扩大培养。所得质粒进行测序分析确定载体构建成功。重组质粒载体及包装辅助质粒转染293T 细胞,得到目的病毒并测定相 应病毒滴度。慢病毒转染MC3T3-E1 细胞后,Real-time PCR 及Western blot 检测MC3T3-E1 细胞RelA 基因及成骨相关基因 ALP、OCN、RANKL的表达。结果：成功构建小鼠RelA 基因的RNA干扰慢病毒载体,感染MC3T3-E1 细胞后,RelA 基因的表达 明显受到抑制,同时RANKL基因表达水平明显下降,ALP、OCN基因表达水平明显上升。结论：成功构建了小鼠RelA 基因的 RNA 干扰慢病毒载体。当小鼠成骨细胞RelA基因表达被干扰,NF-资B 通路被抑制后,小鼠成骨细胞成骨相关基因ALP、OCN的 表达明显上升,成骨功能增强;同时RANKL 的表达明显下降,其介导的破骨细胞骨吸收功能减弱。     

Noggin基因沉默表达载体的构建及效果评价

目的构建慢病毒介导的Noggin RNAi干扰序列,并分析这些干扰序列对Noggin基因的沉默效果。方法针对目的基因Noggin的m RNA设计四条干扰序列,并将这些序列连接到Lenti-KD慢病毒载体,将重组质粒瞬时转染HEK-293T包装细胞,获得重组慢病毒。将重组病毒感染MC3T3-E1细胞,利用puromycin进行筛选,获得稳定表达细胞系。通过实时荧光定量PCR和Western blot技术分析不同干扰序列的干扰效果。结果实时荧光定量PCR结果显示,四种干扰序列对Noggin基因的表达都有一定的沉默效果,但只有sh Noggin-1(P0.01)对其表达影响显著。Western blot结果显示,四种干扰序列中只有sh Noggin-1(P0.01)对Noggin的表达蛋白具有显著的降低作用。结论获得了一种Noggin基因的干扰序列,该序列能够干扰Noggin基因m RNA的稳定性,从而影响蛋白的表达。该干扰序列可以用于部分敲除Noggin基因,从而用于研究Noggin基因的功能。     

慢病毒载体介导RAB27A基因过表达对人HepG2肝癌细胞增殖的影响

目的：构建RAB27A基因慢病毒表达载体,并研究RAB27A 对人HepG2肝癌细胞增殖能力的影响。方法：以pEGFP-C1-RAB27A质粒为模板,PCR扩增出融合绿色荧光蛋白的RAB27A基因全长,酶切后插入穿梭载体pENTR/U6,再应用Gateway技术,基因重组到表达载体pHAGE-EF1α-puro-DEST上,构建得到重组慢病毒表达载体pHAGE-GFP-RAB27A-puro。测序鉴定序列正确后,将其与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转HEK-293T细胞进行慢病毒包装。收集并浓缩培养上清以获得慢病毒颗粒感染HepG2细胞。荧光显微镜下观察HEK-293T细胞和慢病毒感染HepG2细胞绿色荧光强度;Western blot检测稳定感染HepG2细胞株RAB27A 蛋白表达水平;CCK8和平皿克隆形成实验检测稳定过表达RAB27A的HepG2细胞增殖活力的变化;流式细胞术检测稳定过表达RAB27A的HepG2细胞周期分布情况。结果：经双酶切及测序结果证实重组慢病毒表达载体构建正确;浓缩后病毒滴度较高;重组慢病毒感染HepG2细胞后,细胞外源RAB27A的蛋白表达水平显著上调,HepG2细胞的增殖活力和克隆形成能力受到明显抑制（P<0.01）,S期细胞分布比例明显降低（P<0.01）。结论： RAB27A 基因重组慢病毒表达载体构建成功,外源过表达RAB27A 基因可显著抑制HepG2细胞增殖能力。RAB27A在肝细胞癌发生发展和迁移中扮演了重要角色。     

SW620细胞RACK1稳定RNA干扰细胞系的构建与鉴定

目的:为研究RACK1在结肠癌发生发展中的作用,构建结肠癌RACK1基因稳定RNA干扰(RNAi)细胞系。方法:根据人Gnb211 c DNA序列,运用干扰原则选择5个干扰位点并合成相应干扰片段,定向克隆入p Lentilox3.7干扰载体鼠U6启动子后并测序验证。用干扰及对照质粒分别转染HEK293T细胞48小时后,RT-PCR鉴定干扰效率,选出干扰效率较高的质粒包装慢病毒感染人结肠癌细胞SW620,流式无菌分选出荧光阳性的细胞扩增培养,RT-PCR及Western blotting鉴定慢病毒干扰效率。使用慢病毒构建的SW620 RACK1稳定RNAi细胞系及对照组进行MTT实验初步研究RACK1对SW620增殖的影响。结果:酶切和测序证实RACK1sh RNA质粒构建正确,产生能同时表达绿色荧光蛋白(EGFP)和RACK1 sh RNA的慢病毒载体质粒。慢病毒转导SW620并流式无菌分选扩增培养后,与空载体组相比,2个RNAi组均不同程度抑制RACK1表达,RACK1sh RNA5抑制作用最明显,RACK1干扰组细胞增殖得到了抑制。结论:SW620细胞RACK1稳定RNAi细胞系构建成功,为深入研究RACK1在结直肠癌发生发展中的作用奠定了基础。