浓香型白酒大曲微生物群落结构研究进展

大曲通常作为发酵剂用于酿造传统中国白酒,其提供各类微生物菌系和酶系启动白酒发酵,影响白酒风味和独特风格。近年来,对大曲微生物群落结构的研究成为研究热点,研究人员对大曲微生物群落结构、基因功能和功能微生物等进行了广泛而深入的研究,对大曲微生物组成、变迁规律和功能的认识逐渐清晰。本文综述了浓香型大曲微生物群落结构分析方法、主要微生物组成、重要功能微生物和微生物溯源,为研究大曲微生物群落结构、优化大曲生产工艺和改善白酒品质提供一定的理论依据。     

酱香型大曲微生物群落特征与理化指标的相关性研究

本研究以4种酱香型大曲为研究对象,探究微生物因子对大曲理化性质的影响,并结合冗余分析方法研究其关联性。不同区域和工艺条件的酱香大曲样品的磷脂脂肪酸指纹图谱和酿造特性参数相关性研究揭示了大曲中微生物中优势菌群为真菌和革兰氏阳性菌;微生物群落特征受峰值温度和区域环境影响显著;糖化力等与产率直接相关理化指标参数和真菌和革兰氏阳性菌的量及比例呈正相关。将冗余分析与磷脂脂肪酸技术相结合,应用于大曲体系,为开展同类工作提供了方法和思路。     

大曲挥发性组分与其微生物群落相关性的分析

大曲是中国传统白酒生产中重要的糖化发酵剂,其质量优劣直接关系到酒的质量和产量。本研究以传统大曲为研究对象,采用免培养技术结合多元统计方法对大曲中的微生物和风味物质进行了相关性分析。结果表明:基于磷脂脂肪酸酸分析技术在不同类型大曲中共检出碳原子总数从14到20的PLFA 17种,主要包括直链饱和脂肪酸、支链饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不和脂肪酸。主成分分析表明大曲微生物都以真菌含量占绝对优势,大曲中细菌微生物主要以革兰氏G~+为主,其c16:0、18:2ω6,9和18:1ω9占总PLFA的90%以上。运用冗余分析,证实了挥发性特征组分与G~+菌量呈显著正相关。     

大曲发酵酒醅微生物区系的初步研究

用大曲发酵生产白酒是我国酿酒工业的重要特点之一,但对其窖池内发酵酒醅的微生物种类组成及其变化规律的调查研究,以往做得不多。我们曾对西安大曲窖池内酒醅反复多次取样分析,进行过多菌种液态白酒发酵研究。现将酒醅微生物区系调查结果报告如下。     

大曲贮存过程中原核微生物群落结构及风味成分演替规律

【目的】研究大曲贮存过程中原核微生物群落结构及风味成分变化规律,阐述大曲贮存阶段的必要性和重要性,并探索不同微生物种属之间的相互关系,为更好地控制大曲品质提供微生物和风味方面的参考依据。【方法】通过Mi Seq高通量测序剖析大曲成熟过程中原核微生物群落结构变化;利用共存(Co-occurrence)模式方法分析不同种属微生物之间的相关关系,预测其相关性;利用SPME-GC-MS分析贮存过程中大曲风味成分的变化规律。【结果】采用Mi Seq测序方法共得到3 710个OTUs,除不能有效比对的序列外共鉴定出29个门和160个种属。其中,乳杆菌属、芽孢杆菌属、明串珠菌属、高温放线菌属、乳球菌属等是大曲中的优势菌群。随大曲贮存时间推移,贮存前期不断积累酸、醇类物质,后期酯类及含氮类等重要风味物质不断形成,而4-甲基苯酚等异味物质的含量却不断降低。相关性分析结果表明,乳酸菌与乳酸、乙酸等酸类物质之间存在显著的相关性,芽孢杆菌与酸类及含氮化合物之间存在显著的相关性。【结论】大曲贮存过程中,原核微生物结构不断发生调整,风味物质向更优质白酒风味进行变化。除环境因素外,原核微生物的代谢活动对风味物质的形成具有重要的影响,因此大曲贮存是白酒酿造过程中必不可少的环节。     

荧光定量PCR法定量白酒固态发酵过程中产土味素的链霉菌

【目的】荧光定量PCR法具有特异性高、灵敏度高等优点,在定量复杂环境中微生物数量方面得到广泛应用。本文采用荧光定量PCR方法对固态白酒发酵过程产土味素链霉菌进行定量分析并验证其准确性。【方法】通过优化大曲和酒醅中微生物基因组提取方法,并建立相应的大曲和酒醅两种基质条件下的荧光定量PCR标准曲线,并对方法的精度和准确度进行验证分析。采用荧光定量PCR方法对大曲和酒醅中产土味素链霉菌进行定量分析。【结果】结果表明大曲中产土味素链霉菌数量在105数量级,并且清茬曲中此类链霉菌数量最高。酒醅发酵起始阶段产土味素链霉菌数量在104数量级,而后随着发酵的不断进行,酒醅中此类链霉菌数量有所减少。【结论】荧光定量PCR方法能够对白酒固态发酵过程中产土味素链霉菌准确进行定量分析,对采用此方法定量其他微生物具有借鉴意义。     

福矛高温大曲中芽孢杆菌16S rDNA-RFLP及系统发育分析

目的:从福建建瓯黄华山酿酒有限公司高温大曲中分离出89株芽孢杆菌,通过初步筛选鉴定并进行微生物多样性研究.方法:对其16S rDNA进行PCR - RFLP分析和系统发育研究.结果:初步筛选得到的18株芽孢杆菌被HhaⅠ和MspⅠ酶切聚类分为四大组.通过系统发育分析样品中有6株Bacillus subtilis,4株Bacillus cereus,2株Bacillus sonorensis,2株Bacillus licheniformis,以及Bacillus pumilus、Bacillus oleronius、Bacillus coagulans和Bacillus thuringiensis各1株.结论:研究显示该高温大曲中可培养芽孢杆菌具有微生物多样性.     

伏曲酵母菌的分类鉴定及来源分析的研究

目的:统计分析酵母菌的来源,为大曲微生物物种及其来源变化提供基础资料.方法:利用Biolog微生物自动分析系统进行精确鉴定,并通过统计分析得出微生物菌种的来源.结果:从伏曲样品中分离纯化出7株酵母菌J-1,2,3,4,5,6,7,利用Biolog微生物自动鉴定系统进行鉴定,确定其分别为白吉利丝孢酵母A、无名假丝酵母菌、汉逊德巴利酵母C、海隐球酵母菌、东方伊萨酵母菌、解脂耶罗威亚酵母菌、皱落假丝酵母菌.这些物种主要来源于原料本身和空气,原料为了人室大曲提供了J-1,2,3三种酵母菌,其比例为25.45%、19.23%和7.5%.结论:空气巾含有大曲中所有的酵母菌的种类,曲房空气中的酵母菌数量和种类均较多.     

浓香型白酒酒醅微生物分子生物学研究

作为我国四大香型白酒之一,浓香型白酒的酿造过程一直深受人们的关注。在浓香型白酒的酿造过程中,窖泥微生物、酒醅微生物、大曲微生物以及环境微生物这三者构成了其特有的酿酒微生物群落。在整个浓香型白酒的酿造过程中,各个微生物群落在酿酒环境中相互作用从而造就了浓香型白酒复杂的风味。由此可见,要想提高浓香型白酒的质量,需要从浓香型白酒酿造过程中的微生物群落研究着手。本文重点对浓香型白酒的酒醅微生物分子生物学进行研究,以期从中获得能够提高浓香型白酒质量的方法。     

基于宏基因组学解析不同质量等级中温大曲微生物组的异质性

【目的】中温大曲是浓香型白酒酿造中的糖化发酵剂和生香剂，目前其质量评价主要依赖于感官和理化特征。已有研究采用扩增子测序初步探索了大曲质量等级与微生物群落组成之间的关联性，但是微生物群落功能对大曲质量的影响尚缺乏深入研究。【方法】本研究采用宏基因组学解析和对比了不同质量等级大曲的微生物群落组成和潜在功能的差异，结合理化性质，聚焦分析了酶活、乳酸和乙酸代谢相关的关键酶基因丰度。【结果】两种等级大曲的真菌群落组成差异显著。一级大曲含有更高相对丰度的丝状真菌，主要分布在曲霉属(Aspergillus, 21.6%)、罗萨氏菌属(Rasamsonia, 6.8%)、拟青霉属(Paecilomyces, 5.0%)和篮状菌属(Talaromyces, 4.4%)等。一级大曲中与环境信息处理和细胞过程相关途径的基因相对丰度普遍显著高于二级大曲。一级大曲中薄层菌属(Hymenobacter)和曲霉属等提供了更高基因丰度的α-淀粉酶，使其具有显著较高的液化力。二级大曲则含有更高相对丰度的横梗霉属(Lichtheimia, 11.8%)、根霉属(Rhizopus, 13.4%)和毕赤酵母属(Pichia, 7.2%)以及乳酸菌类微生物，如伴生乳杆菌属(Companilactobacillus)、魏斯氏菌属(Weissella)和黏液乳杆菌属(Limosilactobacillus)等。二级大曲中与代谢相关途径的基因相对丰度显著较高，如碳水化合物代谢、能量代谢和核苷酸代谢等。二级大曲中较多的乳酸菌类群有利于提高乙醇脱氢酶基因丰度，同时，糖多孢菌属(Saccharopolyspora)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、曲霉属和高温放线菌属(Thermoactinomyces)等提供了更多的羧酸酯酶基因丰度，分别使其具有较高的发酵力和酯化力。此外，二级大曲中较多的乳酸菌还可能产生更多的乳酸脱氢酶，降解乳酸，且更高基因丰度的乙酸代谢相关酶类可促进乙酸分解代谢，使得二级大曲酸度显著低于一级大曲。【结论】本研究在基因水平上研究了不同质量等级大曲酶活和酸度差异的微生物基础，可为建立完善的大曲质量评价体系以及理性地调控群落功能提供理论支撑。     

酒醅及大曲微生物分离报告

“酱香”是一种深受消费者欢迎的白酒香型。但“酱香”是很复杂的物质,虽经大量工作,其主体香气成分至今尚未揭晓。尽管如此,白酒的酱香是微生物在特定条件下发酵而成的产物,却是确定无疑的。为了解在制曲及酒醅在场地堆积和入池发酵过程中微生物种类及其消长情况,我们于一九八○年在湖南省常德市酒厂,对酱香型的武陵酒第六轮发酵的酒醅及武陵大曲进行了系统的微生物分离测定。同时在我们研究所内,对一九七九年蒐集的五种高温大曲也进行了微生物类群及含量的分离测定。取得了武陵酒第六轮酒醅发     

浓香型大曲原核微生物群落的PCR-SSCP解析

采用PCR-SSCP(单链构象多态性)技术对浓香型大曲发酵过程中原核微生物群落结构的变化情况进行了研究, 结果表明: (1)发酵各时期曲样的群落结构相似, 同时也具有多态性; (2)不同微生物群落具有协同和制约的复杂生态学效应; (3)各时期曲样微生物多样性指数均在1.69~2.01之间, 群落结构相对较稳定; (4)各曲样微生物群落相似性位于0.67~1.00之间, 邻近时期样品间的相似性程度较高。     

茅台酒大曲微生物的研究

为了了解各种微生物在大曲中的作用及其代谢产物对酒香味的影响,我们对茅台酒制曲过程中的样品进行了多次微生物分离。共分得细菌47株,霉菌29株,酵母菌19株,共95株。通过初步鉴定和生理生化特性测定,选择有代     

大曲中产果胶酶微生物的分离鉴定及其产酶活力评价

为深入研究大曲中微生物的组成及其产果胶酶特性,本研究对泸州老窖酿酒大曲中微生物进行分离鉴定,得到细菌15株(其中包括6株高温菌株),真菌5株(其中包括3株高温菌株)。以桔皮粉为唯一碳源发酵诱导菌株产果胶酶并采用3,5-二硝基水杨酸法(DNS)测定酶活,筛选出了两株酶活力最高的菌株,分别为细菌Q-B2和真菌Q-F5。利用16S r DNA以及ITS鉴定高产果胶酶菌株种属,证明与Q-B2及Q-F5最相近种属分别为鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum)和嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)。本研究为加深对大曲中微生物的组成认识提供理论依据。进一步探索本实验中分离所得微生物产果胶酶的性质,对P-Q-B2 (Q-B2所产果胶酶)的酶学性质进行测定,结果显示,P-Q-B2的最适pH为3,最适温度为50℃,在pH为3以及5～11的区间内,剩余酶活力都在40%以上;该酶在30～50℃具有良好的热稳定性,证明其在实际生产中具有良好的应用潜力。     

泸型酒酒醅中梭菌群落的研究

正泸型酒(又称浓香型白酒)的生产以高粱为主要原料,以大曲为糖化发酵剂,采用泥窖进行多菌种混合循环固态发酵,窖池中存在的微生物主要包括酵母、霉菌、细菌、古菌等,这些独特而复杂的窖内微生物群落是泸型酒独特风味形成的关键~([1])。梭菌对于泸型酒中己酸乙酯、丁酸乙酯等典型风味物质的形成具有重要作用,虽然已对窖泥进行了群落结构和演替规律的研究,但对酒醅中的这类微生物的变化及其功能则研究甚少。本期刊登了马     

低温大曲酵母菌分离和计数培养方法优化

低温大曲是清香型白酒酿造的核心因素之一,为酿造过程提供了物系、酶系和菌系。酵母菌是白酒发酵过程中最重要的功能微生物类群,研究大曲中的酵母菌种类和含量具有重要意义,对大曲质量评价也具有重要参考价值。但用常规酵母菌分离技术和培养基从大曲中分离酵母菌时易受优势丝状真菌（霉菌）的干扰,霉菌常常很快长满培养皿,将酵母菌覆盖,难以对酵母菌进行定量计数、观察和分离纯化。本研究根据酒醅发酵过程中随乙酸和乳酸含量的升高,霉菌含量急剧降低而酵母菌含量逐渐升高的现象,用常规培养基YPD为基础培养基,测试了添加不同量的乙酸、乳酸和丙酸（后者为常用食品防腐和防霉剂）,以及不同比例的乙酸乳酸组合物,对低温大曲中霉菌的抑制效果和对酵母菌生长的影响进行探究,发现在灭菌后的YPD中添加3.3mL/L乙酸、2.0mL/L丙酸或在乙酸乳酸1:3的情况下添加2.0mL/L乙酸,30℃培养3-5d之内可有效抑制低温大曲中的霉菌,实现对酵母菌的有效分离、计数和纯化培养,而单加乳酸对霉菌,特别是黄曲霉的抑制效果差。随后测试了以前我们从清香型白酒大曲和酒醅发酵过程中分离的13属18种酵母菌在这些培养基上的生长情况,发现这些酵母菌中的绝大多数,尤其是大曲和酒醅中的优势酵母菌种,均可以在这些加酸培养基上良好生长。综合考虑培养基的成本、配制的简便性及分离效果等因素,本研究推荐将灭菌后添加3.3mL/L乙酸的YPD固体培养基作为低温大曲酵母菌分离和定量计数的优化培养基。     

大曲来源淀粉利用型乳酸菌的筛选及其淀粉利用特性

【背景】乳酸菌是面包、馒头等发酵食品中的重要功能微生物,对改善质地和风味均具有重要作用。淀粉利用能力高的乳酸菌,因其能够在生面粉中更好地定殖而具有重要的应用价值。【目的】筛选获得淀粉水解型乳酸菌并研究其淀粉利用特性。【方法】以浓香型白酒大曲为筛选源,采用淀粉基质碳源对大曲中乳酸菌进行定向富集,结合淀粉发酵能力筛选高淀粉利用能力菌株,并对筛选得到的优良菌株展开淀粉酶表达及其酶活力研究。【结果】以贮存3-6个月的大曲为优秀筛选源,以生面糊传代富集方法可较快筛选出具有良好淀粉利用能力的乳杆菌,主要物种为植物乳杆菌和类食品乳杆菌。对其中一株具有淀粉利用能力的类食品乳杆菌LBM12001的淀粉水解特征和淀粉酶活力展开研究,该菌株淀粉水解能力达10 g/L,并且其在面糊中具有良好的定殖能力;酶活力测定表明,其α-淀粉酶和麦芽糖淀粉酶为胞外酶;麦芽糖淀粉酶水解淀粉的最适pH值为3.5,比酶活为1 240 U/mg。【结论】建立起从我国传统白酒发酵大曲中高效筛选淀粉水解型乳酸菌的富集筛选方法,以及菌株的水解能力评价方法,获得的胞外麦芽糖淀粉酶分泌型乳杆菌在酸面团、馒头等需进行生面粉发酵食品的生产中具有重要应用前景。     

清香型白酒固态酿造过程中酵母种群结构和多样性分析

【目的】探索清香型白酒固态酿造过程中酵母的种群结构和生态多样性变化规律,为科学认识白酒酿造的过程与机制提供理论依据。【方法】运用WL鉴别培养基和26S rRNA D1/D2序列分析方法对清香型白酒3种典型大曲和酒醅发酵过程的酵母进行分类学研究。【结果】从清香型白酒固态酿造过程中共鉴定出10种酵母,分别为Saccharomyces cerevisiae、Issatchenkia orientalis、Pichia anomala、Saccharomycopsis fibuligera、Pichia fermentans、Trichosporon asahii、Hanseniaspora osmophila、Pichia farinosa、Pichia membranifaciens和Clavispora lusitaniae。其中T.asahii、C.lusitaniae、H.osmophila、P.membranifaciens、P.farinose和P.fermentans为首次从清香型白酒酿造过程中分离获得的酵母种类。考察3种典型大曲(清茬、红心、后火曲)和大茬、二茬酒醅发酵过程的酵母种群结构变化规律显示,3种大曲具有相同的优势菌种S.fibuligera,但三者酵母结构组成差异较大,且清茬曲含有最多的酵母数量和种类。酒醅发酵过程中的酵母种群结构与3种大曲均明显不同,大茬和二茬酒醅酵母结构也不同,两种酒醅发酵后期的优势酵母均为S.cerevisiae,而发酵前期优势酵母则分别是H.osmophila和P.membranifaciens。【结论】深入研究了清香型白酒酿造过程中微生物的分布特征和规律,对认识清香型白酒酿造过程和群体微生物的发酵机制,以及丰富我国传统酿造食品微生物的研究,具有重要的理论和实践价值。     

高温大曲中地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis CGMCC 3963)的耐高温特征

【目的】高温大曲的使用是中国酱香型白酒酿造的特征之一,耐高温的细菌是高温大曲中重要的优势功能菌,它们对酱香型白酒的酿造具有重要的价值。研究高温大曲中细菌的耐高温特征对于认识酱香型白酒的酿造特征具有一定的作用。【方法】本文以中国白酒高温大曲中筛选获得的一株具有自主知识产权的耐高温功能细菌地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)CGMCC 3963为对象,测定其耐高温特征,并首次通过细胞形态学的分析,以及转录组学等技术的应用系统研究了B.licheniformis CGMCC 3963的耐高温机制。【结果】地衣芽胞杆菌B.licheniformis CGMCC 3963能够耐受55℃高温生长。在高温条件下,该菌仍具有较旺盛的代谢生长能力,且产生大量荚膜,同时大量I类热休克蛋白基因以及聚谷氨酸合成基因的表达水平均得到明显提高。【结论】B.licheniformis CGMCC 3963在高温下,I类热休克蛋白以及以聚谷氨酸为主要成分的荚膜大量产生,对功能细菌耐高温具有重要的作用。该结果首次从分子水平认识了中国白酒酿造微生物的耐高温特征,丰富了白酒酿造微生物学的科学理论。     

利用PCR-DGGE未培养技术对中国白酒高温和中温大曲细菌群落结构的分析

采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术,研究了5种高温和中温白酒大曲细菌群落结构,通过优势条带切胶鉴定确定了大曲中优势细菌种属信息。结果表明,Weissella cibaria、Lactobacillus helveticus、L.fermentum、L.panis等乳酸菌普遍存在于5种大曲中,Ther-moactinomyces sanguinis仅存在于高温曲酱曲中,同时DGGE检测到了传统方法未能分离鉴定的Staphylococcus xylosus、Klebsiella oxytoca。不同工艺大曲细菌群落结构存在明显差异,随着制曲温度的升高,大曲细菌多样性指数有下降趋势。PCR-DGGE技术是一种能够快速有效地研究白酒大曲细菌群落结构的技术。