人干细胞生长因子Ca2+依赖糖识别结构域缺失突变体的重组表达及生物学活性的初步探讨

本作已有的研究结果证明,完整的人干细胞生长因子(hSCGF)没有种属特异性,即可以作用于小鼠骨髓造血细胞。这一点与在Ca^2 依赖糖识别结构域(CRD)缺失了78个氨基酸残基的截短分子(hSCGFβ)有所不同。本研究从hSCGF全长cDNA中完全删除了CRD结构域编码序列,进一步探讨CRD结构域的生物学功能。由于该突变体序列GC含量较高．因此将该缺失突变体序列克隆在GST融合表达载体中进行融合表达。通过低温(28℃)诱导,表达产物主要以可溶蛋白的形式存在。利用亲和层析纯化CRD结构域完全缺失的hSCGF突变体融合蛋白,通过检测重组突变分子的协同刺激造血活性有无改变来初步探讨CRD结构域在hSCGF分子中的生物学功能。研究结果表明,去掉完整CRD结构域的突变分子仍然具有造血刺激活性。据此推断CRD结构域在hSCGF分子中可能对于受体配体结合起辅助作用。     

铝与钙调蛋白相互作用及其作用位点的研究

用500MHzNMR研究了铝与钙调蛋白的相互作用,主要研究了铝对钙调蛋白中芳香氨基酸残基(Tyr,His,Phe)构象变化的影响。实验结果表明,铝在钙饱和的钙调蛋白上存在着特异性的结合位点,结合位点数目至少为两个,第一结合位点可能位于钙调蛋白的N端结构域,第二结合位点靠近Ca~(2+)的Ⅲ结合域。Al~(3+)结合引起脱钙的钙调蛋白的构象变化不同于与Ca~(3+)结合引起的构象变化。Al~(3+)在CaM上的结合位点与Ca~(2+)的并不相同。柠檬酸等有机酸对铝的毒性有保护作用,这种保护作用是由于柠檬酸分子对铝的络合。     

用定点自旋标记的方法研究天青蛋白疏水区的结构及其与P53蛋白的相互作用

定点自旋标记技术结合电子顺磁共振(ESR)波谱技术已成为检测蛋白质结构的有力工具.本文使用该方法研究了天青蛋白疏水区的结构特征及其与p53蛋白的相互作用.围绕天青蛋白疏水区构建了6个突变体,并对其进行自旋标记.溶液中标记位点的自旋谱线表明,45及63位自旋探针的运动受到很大限制,而59及65位的标记探针是在一个宽松的环...     

Tb~(3+)作为荧光探针研究钙调蛋白与拮抗药物的相互作用

本文报导以Tb~(3+)作为荧光探针,研究钙调蛋白(CaM)与其拮抗药物分子间相互作用的机制.所用方法简便、快速、灵敏.CaM的内源荧光研究表明,Tb~(3+)类似于Ca~(2+),也能诱导CaM分子构象发生改化,由于CaM分子中Ca~(2+)的第Ⅲ、Ⅳ结合位点上各有一个Tyr线基,如(?)280nm激发,则发生从Tyr向Tb~(3+)的能量转移,从而导致Tb~(3+)在490和545nm处的特征荧光发射大大加强.本文检测了药物分子与Tb~(3+)-CaM结合对该荧光发射的影响.实验表明,TFP与CaM的高亲和位点处于CaM分子C-末端部位,即含第Ⅲ、Ⅳ结构域的半分子上:丙拮抗药物酸枣仁皂甙A则优先结合在含第Ⅰ、Ⅱ的结构域的另一半分子(?).     

钙调神经磷酸酶B亚基及钙调素的EPR研究

根据顺磁离子Mn~(2+)的取代特性,用EPR方法研究了钙调神经磷酸酶B亚基与其4个Ca~(2+)的结合位点,以及它们亲和力的细微差别。并同时进行了钙调素的对比研究。实验和Scatchard作图表明,B亚基有4个Ca~(2+)结合位点,2个高亲和力结合位点,其解离常数为4×10~(-6)mol/L;2个低亲和力结合位点,解离常数为9×10~(-5)mol/L。钙调素也有2个Ca~(2+)高亲和力结合位点,其解离常数为8×10~(-6)mol/L,2个低亲和力结合位点,解离常数为7×10~(-5)mol/L。钙调神经磷酸酶B亚基和钙调素Mn~(2+)结合位点的EPR研究对B亚基和钙调素在共同调节钙调神经磷酸酶中的作用提供了有用的信息。     

定点突变Ca~(2+)平衡位点对粘质沙雷氏菌脂肪的影响

为了研究粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)脂肪酶lip A中的Ca~(2+)对酶活力的影响,采用定点突变的方法对平衡Ca~(2+)的位点D388进行定点突变,对突变体进行诱导表达后,纯化目的蛋白并进行酶学性质分析。与野生酶相比,突变酶的最适温度由40℃降低到25℃,最适p H值由8.5降到8.0,T_(1/2)值比野生酶提高了2℃。由此可知,该Ca~(2+)对脂肪酶lip A酶学性质有着至关重要的作用。     

跨膜Ca~(2+)梯度对肌质网Ca~3+-ATP酶调节的特异性

我们曾报道跨膜Ca~(2+)梯度可通过膜脂影响肌质网Ca~(2+)-ATP 酶的构象和活性。本文就跨膜Ca~(2+)梯度对肌质网Ca~(2+)-ATP 酶的调节是否具有特异性作进一步研究。结果表明这种特异性表现在两方面:一是跨膜Ca~(2+)梯度对肌质网Ca~(2+)-ATP 酶功能的调节不能归结于跨膜Ca~(2+)浓度梯度所导致的膜电位的作用,离子载体FCCP 可消除跨膜电位但并不影响肌质网Ca~(2+)-ATP 酶的活力;二是其它二价金属离子如Sr~(2+)的跨膜梯度对肌质网Ca~(2+)-ATP 酶活力基本无影响。荧光偏振系列探剂n-AS 测定的结果表明跨膜Ca~(2+)与Sr~(2+)梯度对嵌有Ca~(2+)-ATP 酶的脂酶体的中部流动性的影响有较大差异。而Ca~(2+)-ATP 酶的Ca~(2+)结合位点正处于脂双层中部,这进一步提示膜脂参与了跨膜Ca~(2+)梯度对Ca~(2+)-ATP 酶的调节作用。     

半乳糖凝集素糖结合的新模式：一个糖结合域的双重配体结合

半乳糖凝集素家族通过糖识别结构域(CRD)可以专一性识别和结合含β-半乳糖的多糖配体来发挥其生物学功能.到目前发现的CRD对β-半乳糖的识别模式是非常保守的,在结构已知的半乳糖凝集素结构中,一个CRD只能结合一个多糖配体分子.最近,通过对人源半乳糖凝聚素-3 CRD与对硝基TF二糖(TFN)复合物的晶体结构解析首次发现,一个CRD可以同时结合2个TFN分子.与这2个TFN分子有双向结合的残基突变体E165A结构分析显示,一个残基的突变引起的结构上的微小变化会使结合位点2丧失结合糖底物的能力,而位点1的配体结合却不受影响.这表明,结合位点1对糖底物保守的识别和结合是基本的、主要的,而结合位点2对于糖有条件的结合,是额外的、次要的.序列比对和立体化学分析显示,参与新位点2结合的关键残基在其他半乳糖凝集素分子中都是保守的,而它们参与糖配体结合并不常见,表明它们作用的发挥是有条件的.可能在复杂寡聚结构的情况下,如有多重分支结构,双重结合位点将有利于对这类配体分子的辨识和结合,已有一系列研究报道,具有分支结构的寡糖与半乳糖分子的亲和势明显高于单价糖配体,与上述分析相一致.对这类双重位点糖结合的可能生物学意义进行了讨论.     

钙调蛋白的结构与功能(下)

四、钙调蛋白的构象 CaM分子本身无酶的活性,在无Ca~(2+)情况下,也无生物活性。自从1973年Teo等人鉴定它是一种钙结合蛋白以来,人们用各种物理、化学手段发现Ca_(2+)的结合引起蛋白强烈的构象变化,Ca~(2+)·CaM复合物才能与靶蛋白结合形成一个活性全酶,因此CaM构象问题是其调控机制的中心问题。 1.研究构象的方法 (1)圆二色性与紫外差谱的研究 Klee测定CaM的远紫外CD谱,在EGTA存在下,椭圆度[Q]_(221nm)=-11500度·cm~2/分·克分子,相当35％螺旋,50％无规卷曲,20％β-折迭。而在0.3mM Ca~(2+)存在下,[Q]_(221nm)增加约20％,相当于α螺旋增加5—8％,无规卷曲相     

苹果黑腐皮壳菌CAP超家族蛋白VmPR1c的降解功能域和降解途径

真菌与寄主互作过程中常分泌多种效应蛋白,但植物病原真菌CAP超家族蛋白是否参与致病过程尚不明确。基于苹果黑腐皮壳菌Valsa mali基因组CAP同源基因研究发现VmPR1c敲除后突变体致病性明显下降,但VmPR1c蛋白在表达过程中被降解。本研究借助BLAST、NCBI CDD web server、SignalP 4.1、TMHMM 2.0等进行序列分析,利用缺失突变法及在蛋白表达过程中加蛋白酶抑制剂分别对该蛋白的降解功能域和降解途径进行了探索。C端区段缺失突变结果显示,突变涉及CAP结构域中的α-helix结构和CBM区域时,Western blot条带呈现明显加深;涉及CTE区域及CAP结构域中的半胱氨酸时,Western blot条带则呈现不同程度地减弱。替换VmPR1c的信号肽或突变其信号肽切割位点序列,Western blot条带均有不同程度地加深。分别对CTE和NTE中的脯氨酸进行点突变后,蛋白降解更加严重。在蛋白表达过程中加入蛋白酶体抑制剂MG132和溶酶体抑制剂chloroquine,与对照VmPR1c ^△SP-GFP相比,Western blot结果无明显变化,表明VmPR1c蛋白序列C端区域中的CTE、信号肽及其切割位点序列以及CAP结构域中的α-helix结构介导其降解,其中CTE和NTE中的脯氨酸对该蛋白具保护作用。此外,VmPR1c的降解不通过蛋白酶体和溶酶体途径。     

真核生物α-甘露糖苷酶生物信息学分析

α-甘露糖苷酶(α-mannosidase,α-Man)是真核生物蛋白质N-聚糖修饰的关键酶,其对甘露糖残基的修剪过程是糖蛋白N-糖链复杂化的必要步骤,对蛋白质的合成及正确构象的折叠起决定性作用。根据α-Man的功能特异性,其一般被分为糖基水解酶38家族(glycosyl hydrolase 38 family,GH38)、糖基水解酶47家族(glycosyl hydrolase 47 family,GH47)两个家族。利用生物信息学分析GH38家族与GH47家族在进化上的关系和氨基酸序列保守性以及不同物种内质网Ⅰ型甘露糖苷酶(endoplasmic reticulum ManⅠ,ERManⅠ)的理化性质、结构特点、功能特征后发现,GH47家族比GH38家族在进化上更早且保守性更好;α-Man基因在不同物种中长度存在明显差异,物种越高等基因平均长度越长;真核生物ERManⅠ均为亲水性不稳定蛋白质,其氨基酸序列存在跨膜螺旋并含有信号肽,且蛋白质空间构像为桶状,包含Ca~(2+)结合位点。文中对α-Man的生物信息学分析可以为研究α-Man在生命过程中的作用提供重要的信息。     

顺丁烯二酰亚胺氮氧自由基的合成及自旋标记的血清白蛋白

本文报道制备顺丁烯二酰亚胺氮氧自由基纯品的方法。本方法为Hamilton-McConnell法的改进。在温和条件下,该化合物以共价键形式自旋标记到血清白蛋白的硫氢基和氨基等活性基团上。为利用自旋标记顺磁共振技术研究蛋白质分子的构象,提供了必要前提。经顺丁烯二酰亚胺氮氧自由基自旋标记的牛和羊血清白蛋白,由于标记位点和标记物所处的周围环境不同,给出了两类ESR波谱:即强固定化作用型和弱固定化作用型。用0.5 mMHgCl_2预处理牛血清白蛋白,阻断其硫氢基以后再自旋标记,仅给出弱固定化型波谱。从而进一步证明强固定化作用型波谱主要来自标记在蛋白质深层中的硫氢基;弱固定化作用型波谱则来自标记在靠近蛋白质表层的非硫氢基团上。通过对羊血清白蛋白自旋标记以后,再用8M尿素破坏其氢键的试验,发现原样品中强固定化型的谱线消失,仅剩下三条弱固定化型谱线。表明自旋标记物对蛋白质构象变化的反应是十分灵敏的。文中,对两类ESR波谱用自旋哈密尔顿理论进行了描述。     

顺丁烯二酰亚胺氮氧自由基的合成及自旋标记的血清白蛋白

本文报道制备顺丁烯二酰亚胺氮氧自由基纯品的方法。本方法为Hamilton-McConnell 法的改进。在温和条件下,该化合物以共价键形式自旋标记到血清白蛋白的硫氢基和氨基等活性基团上。为利用自旋标记顺磁共振技术研究蛋白质分子的构象,提供了必要前提。经顺丁烯二酰亚胺氮氧自由基自旋标记的牛和羊血清白蛋白,由于标记位点和标记物所处的周围环境不同,给出了两类ESR 波谱:即强固定化作用型和弱固定化作用型。用0.5mMHgCl_2预处理牛血清白蛋白,阻断其硫氢基以后再自旋标记,仅给出弱固定化型波谱。从而进一步证明强固定化作用型波谱主要来自标记在蛋白质深层中的硫氢基;弱固定化作用型波谱则来自标记在靠近蛋白质表层的非硫氢基团上。通过对羊血清白蛋白自旋标记以后,再用8M尿素破坏其氢键的试验,发现原样品中强固定化型的谱线消失,仅剩下三条弱固定化型谱线。表明自旋标记物对蛋白质构象变化的反应是十分灵敏的。文中,对两类ESR 波谱用自旋哈密尔顿理论进行了描述。     

肌球蛋白轻链激酶CaM结合位点突变体的构建

目的:平滑肌肌球蛋白轻链激酶(myosin light chainkinase,MLCK)具有激酶活性和非激酶活性,在平滑肌收缩过程中起着关键酶调控的作用.为探寻MLCK的非激酶活性区域对MLCK活性的影响,本实验利用分子生物学技术构建了肌球蛋白轻链激酶CaM结合位点突变体,并纯化出重组的MLCK表达的蛋白质,为深入研究MLCK的非激酶活性在调节平滑肌收缩过程中的分子机制提供了实验基础.方法:利用野生型MLCK全长的cDNA序列设计CaM结合位点的突变引物,利用PCR技术进行定点突变,获得CaM结合位点的突变体(△CaM/MLCK).在大肠杆茵中表达重组CaM结合位点的突变体(△CaM/MLCK),通过亲和层析及凝胶过滤进行分离纯化重组蛋白,SDS-PAGE检测表达及纯化的重组蛋白.结果:构建重组MLCK钙调蛋白结合位点突变体(△CaM/MLCK),△CaM/MLCK在大肠杆菌中以可溶形式大量表达并得到纯化.结论:成功构建重组MLCK钙调蛋白结合位点突变体(△CaM/MLCK)并获得纯化的表达蛋白质.     

细菌视紫红质蛋白的赖氨酸和丝氨酸残基在其膜环境中的自旋标记研究

用化学修饰和自旋标记ESR技术研究了bR中丝氨酸和赖氨酸残基的构象,结果表明PH对bR分子构象的影响是很明显的,在酸性条件下带有自旋探针的丝氨酸(Ⅰ-bR)和赖氨酸(Ⅱ-bR)的ESR波谱参数迥然不同,这与丝氨酸和赖氨酸残基位点微环境中的电荷效应有关.顺磁增宽剂能猝灭膜表面的自由基,而剩余的强固定化ESR信号显示出bR分子内部的‘刚性’构象.用2%Triton X—100处理可大大增加bR分子的‘柔性’,其ESR波谱特征与bR分子失去部分α螺旋结构和改变了它的某些运动方式有关.     

细菌视紫红质蛋白的赖氨酸和丝氨酸残基在其膜环境中的自旋标记研究

用化学修饰和自旋标记ESR技术研究了bR中丝氨酸和赖氨酸残基的构象,结果表明PH对bR分子构象的影响是很明显的,在酸性条件下带有自旋探针的丝氨酸(Ⅰ-bR)和赖氨酸(Ⅱ-bR)的ESR波谱参数迥然不同,这与丝氨酸和赖氨酸残基位点微环境中的电荷效应有关.顺磁增宽剂能猝灭膜表面的自由基,而剩余的强固定化ESR信号显示出bR分子内部的‘刚性’构象.用2%Triton X—100处理可大大增加bR分子的‘柔性’,其ESR波谱特征与bR分子失去部分α螺旋结构和改变了它的某些运动方式有关.     

血管平滑肌细胞的钙动力学

血管平滑肌细胞外的Ca~(2+)通过多种通道进入细胞内。Ca~(2+)通道的本质是镶嵌在膜脂质双分子层中的糖蛋白,神经介质和药物可影响Ca~(2+)通道的功能。靠近胞膜的肌质网和胞膜内侧面的高亲和性Ca~(2+)结合位点是血管平滑肌细胞内储存和释放Ca~(2+)的主要部位。胞浆[Ca~(2+)]增高后在钙调蛋白的介导下引起血管收缩。高血压等血管性疾病的发生与其平滑肌细胞的钙动力学异常有关。     

自旋标记法研究不同因素对嗜盐菌紫膜类脂物性的影响

本文用自旋标记方法研究了不同的pH和盐介质对光照前后嗜盐菌(H.halobium)紫膜类脂的影响.在低盐介质中,紫膜类脂序参数S的大小依次为pH2.5>pH7.0>pH12.0:旋转相关时间τ均在10~(-a)sec范围之内.pH12.0的暗适应和光适应悬液的ESR波谱十分相似,其它的ESR波谱均为暗适应>光适应.悬浮于Triton X-100中的紫膜的序参数最小,τ_e值在10~(-9)--10~(-10)sec之间;但其暗适应和光适应的ESR波谱仍有差别.在高盐介质中,紫膜类脂序参数均大于低盐介质,结构最为刚硬.实验表明类脂的序态变化与bR分子的构象改变有密切关系.     

BRD7结构功能域Bromodomain的研究以及一个新的BRD7交互作用蛋白的鉴定

溴区包含蛋白7(BRD7)是采用cDNA代表性差异分析方法克隆的一个新基因.研究证实了BRD7能够与乙酰化的组蛋白3结合,其识别位点在组蛋白3的14位氨基酸;并且证实了溴区结构域(Bromodomain)缺失型的BRD7突变体失去了与乙酰化组蛋白3的结合能力.Bromodomain是在进化上高度保守的功能结构域,该结构域在空间构象上具有鲜明的特征:包括4个左手、呈反向平行排列的“螺旋(αz,αA,αB,αC)”以及2个“连结环”(ZAloop,BCloop).通过生物信息学等综合分析,预测BRD7可能具有上述特征.依据上述分析结果,构建了BRD7的Bromodomain相关缺失突变体,通过肽段结合实验分析上述突变体与乙酰化组蛋白3结合的能力.结果表明,ZAloop与BCloop的完整性对于BRD7结合乙酰化的组蛋白3有着重要的意义.同时通过免疫荧光分析,证实了ZAloop与BCloop的完整性能够影响BRD7的亚细胞定位.最后,证实了BRD7与CBP可能存在交互作用.CBP不仅具有乙酰化转移酶活性(HATs),能够对组蛋白末端进行乙酰化修饰,并且作为一种重要的细胞转录因子广泛参与细胞的各种生物学活动.     

Ⅳ型限制酶ScoMcrA中SRA结构域介导的二聚体化对硫结合结构域功能的影响机制

【背景】部分细菌的DNA骨架会发生磷硫酰化修饰,硫结合结构域(Sulfur Binding Domain,SBD)可以特异性识别这种生理修饰。与绝大多数SBD-HNH双结构域核酸酶不同,ScoMcrA的SBD和HNH结构域中间插入了一个特异性识别5-甲基胞嘧啶(5m C)修饰DNA的SET and RING-Associated(SRA)结构域。晶体结构显示,单独的SBD是单体,而SBD-SRA是双体。【目的】探究ScoMcrA中SRA结构域的存在对SBD识别硫修饰DNA的影响及影响方式。【方法】凝胶迁移实验(Electrophoresis Mobility Shift Assay,EMSA)比较SBD、SBD-SRA对硫修饰DNA结合力的差异;对参与SBD-SRA二聚体化的关键氨基酸残基突变,并检测点突变对SBD-SRA蛋白二聚体化及结合硫修饰DNA的影响。【结果】相较于SBD结构域,SBD-SRA双结构域对磷硫酰化修饰DNA的结合能力明显增强。对SBD-SRA双体互作界面进行单点突变基本不影响其对硫修饰DNA的结合,当二聚体化界面连续的L261LGET265突变成A261AAAA265时,突变体对硫修饰DNA的结合力下降到与SBD相似的水平。【结论】根据EMSA实验结果可以初步判断,SRA结构域介导的SBD-SRA双体化能增强SBD对硫修饰DNA的结合力;L261LGET265是SRA结构域上影响SBD对硫修饰DNA结合力的关键氨基酸位点。