大肠杆菌ybfE基因的三种原核质粒表达水平的对比及蛋白纯化

[目的]构建大肠杆菌功能未知基因ybf E的pET16b、pET32a和p GEX-4T-1三种原核表达系统,通过对比表达水平筛选出最优表达体系,并纯化表达的可溶性Ybf E融合蛋白。[方法]使用pET16b、pET32a和p GEX-4T-1表达质粒构建pET16b-ybf E、pET32a-ybf E和p GEX-4T-1-ybf E原核表达载体,分别转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达Ybf E融合蛋白,对三种表达系统的表达水平进行对比,并对pET16b-ybf E和pGEX-4T-1-ybf E表达体系的裂菌上清中的可溶性Ybf E融合蛋白液分别使用镍柱和GST蛋白纯化柱纯化。[结果]构建了pET16b-ybf E、pET32a-ybf E和p GEX-4T-1-ybf E原核表达体系,并使用IPTG诱导表达Ybf E融合蛋白。ybf E在p GEX-4T-1载体内的表达水平最高,接下来依次为pET16b和pET32a。pET16b-ybf E和p GEX-4T-1-ybf E表达的可溶性Ybf E融合蛋白纯化后浓度分别为86μg/m L和724μg/m L。[结论]成功构建了ybf E基因的三种原核表达系统,筛选出最佳表达体系,可溶性Ybf E融合蛋白得到纯化。     

大肠杆菌ybfE基因的三种原核质粒表达水平的对比及蛋白纯化北大核心

[目的]构建大肠杆菌功能未知基因ybf E的pET16b、pET32a和p GEX-4T-1三种原核表达系统,通过对比表达水平筛选出最优表达体系,并纯化表达的可溶性Ybf E融合蛋白。[方法]使用pET16b、pET32a和p GEX-4T-1表达质粒构建pET16b-ybf E、pET32a-ybf E和p GEX-4T-1-ybf E原核表达载体,分别转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达Ybf E融合蛋白,对三种表达系统的表达水平进行对比,并对pET16b-ybf E和pGEX-4T-1-ybf E表达体系的裂菌上清中的可溶性Ybf E融合蛋白液分别使用镍柱和GST蛋白纯化柱纯化。[结果]构建了pET16b-ybf E、pET32a-ybf E和p GEX-4T-1-ybf E原核表达体系,并使用IPTG诱导表达Ybf E融合蛋白。ybf E在p GEX-4T-1载体内的表达水平最高,接下来依次为pET16b和pET32a。pET16b-ybf E和p GEX-4T-1-ybf E表达的可溶性Ybf E融合蛋白纯化后浓度分别为86μg/m L和724μg/m L。[结论]成功构建了ybf E基因的三种原核表达系统,筛选出最佳表达体系,可溶性Ybf E融合蛋白得到纯化。     

转录因子LRF蛋白POZ结构域的表达与纯化

[目的]旨在原核表达转录因子LRF的POZ结构域,纯化获得GST-POZ融合蛋白。[方法]以SD大鼠海马组织c DNA为模板,利用PCR扩增带有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的LRF基因的POZ结构域,并将其插入到原核表达载体p GEX-4T-1中,将构建成功的p GEX-4T-1-POZ原核表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导融合蛋白表达,再利用MagneGST particles亲和纯化GST-POZ融合蛋白,最后通过Western Blot鉴定融合蛋白。[结果]p GEX-4T-1-POZ原核表达质粒构建成功;在37℃条件下,浓度为0. 2 mmol/L的IPTG诱导7 h能够使重组蛋白大量表达,经MagneGST particles纯化后的GST-POZ重组蛋白能够被识别LRF的抗体特异性识别。[结论]纯化后的GST–POZ重组蛋白能够用于后续的生物学研究。     

大西洋鲑鱼Ⅳ型抗冻蛋白的表达与纯化

[目的]构建Ⅳ型抗冻蛋白(AFPⅣ)大肠杆菌表达系统,纯化诱导表达的可溶性AFPⅣ,并进行质谱鉴定。[方法]构建pET22b-His6-AFPⅣ重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),并优化IPTG诱导条件,通过亲和层析进行分离纯化,收集样品并冻干保存,对Ⅳ型抗冻蛋白样品进行质谱(MALDI-TOF-TOF)鉴定。[结果]构建了pET22b-His6-AFPⅣ重组质粒,IPTG诱导表达产生可溶性AFPⅣ,且最佳诱导浓度为0.2 mmol/L,诱导时间4h,纯化后AFPⅣ浓度为136μg/ml。[结论]成功构建了AFPⅣ原核表达系统,优化了IPTG诱导条件,重组AFPⅣ得到纯化,并获得冻干样品5 mg,经质谱鉴定确认为AFPⅣ。     

小反刍兽疫病毒F基因缺失体的克隆、表达及鉴定

旨在研究小反刍兽疫病毒(PPRV)囊膜与宿主细胞的融合机制,构建F基因缺失体,并且在原核细胞内表达。鉴于F基因中包含的两段保守序列HR1和HR2在融合过程中具有关键性作用,分别构建p ET30a-HR1和p ET30a-HR2原核表达载体,将测序正确的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞内进行IPTG诱导表达,在最优表达条件下大量表达,并利用镍琼脂糖凝胶纯化蛋白。结果显示,获得的重组蛋白与预期大小一致且以可溶性方式表达,纯化的蛋白纯度大于90%;重组蛋白与抗His标签抗体和抗PPRV Nigeria 75/1株阳性血清均能发生反应,证明重组蛋白具有反应原性。     

原核表达载体pET30a/ATRX-C_(2193-2492)的构建与诱导表达

[目的]构建大鼠ATRX抗原端氨基酸序列的原核表达载体,为进一步制备ATRX多克隆抗体以及探讨ATRX蛋白在HPV16致宫颈癌中的作用奠定基础。[方法]以IF-GFP-ATRX质粒为模板,PCR扩增获得ATRX-C_(2193-2492)基因片段,并克隆至p ET30a(+)空载体上,转化E.coli BL21感受态细胞,构建原核表达载体p ET30a/ATRX-C_(2193-2492),经PCR、双酶切以及测序鉴定。将构建好的质粒p ET30a/ATRX-C_(2193-2492)转化,经IPTG诱导表达,利用镍离子亲和层析法纯化6His-ATRX-C_(2193-2492)蛋白。[结果]成功获得900 bp的ATRX-C_(2193-2492)基因片段并构建了原核表达载体p ET30a/ATRX-C_(2193-2492),且该载体能在E.coli中诱导表达分子量约34 k Da蛋白产物。[结论]原核表达载体p ET30a/ATRX-C_(2193-2492)能成功诱导表达分子量约34 k Da的ATRX-C_(2193-2492)蛋白,该蛋白纯化产物能为后续ATRX多克隆抗体的制备提供实验基础。     

猪丹毒丝菌SpaA蛋白的表达与纯化

[目的]在大肠杆菌中表达猪丹毒丝菌spaA基因并纯化重组蛋白。[方法]利用PCR扩增猪丹毒丝菌临床分离株spaA基因,构建重组质粒p GEX-4T-1-spaA,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达融合蛋白GST-SpaA,并优化表达条件。最后采用GST琼脂糖纯化树脂纯化,SDS-PAGE和Western Blotting检测。[结果]成功扩增spaA基因,获得重组表达菌株BL21(DE3)/p GEX-4T-1-spaA;在菌体OD_(600)为0. 9时,加入IPTG至终浓度0. 1 mmol/L,34℃诱导6 h的条件下表达效果最好。经SDS-PAGE检测和纯化后得到大小为97 kDa的GST-SpaA; Western Blotting检测结果表明,GST-SpaA具有良好的免疫原性。[结论]成功在大肠杆菌中表达了SpaA蛋白,经纯化得到具有免疫原性的重组蛋白,为后续研制猪丹毒丝菌SpaA蛋白亚单位疫苗奠定基础。     

FGF20原核表达载体构建及在大肠杆菌中优化表达

[目的]构建人FGF20原核表达载体并在大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)中优化表达。[方法]从胃癌细胞中经RT-PCR扩增FGF20基因并构建p ET28b-FGF20载体,转化E.coli,IPTG诱导表达。对诱导OD值、IPTG浓度、诱导温度、时间及溶氧量进行优化,同时采用正交试验优化培养基配方,以SDS-PAGE及Western Blot检测蛋白表达,以确定最佳表达条件。[结果]构建了p ET28b-FGF20原核表达载体,实现了FGF20蛋白的表达,确定最佳表达条件为:培养基占锥形瓶容积20%,菌体生长至OD600=0.4,加入终浓度1.0 mmol/L的IPTG,37℃诱导6 h。培养基最佳成分为:蛋白胨11 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠10 g/L、葡萄糖0 g/L。[结论]实现了FGF20在大肠杆菌中的优化表达,为其基因工程药物生产及药用研究奠定了基础。     

菠菜SoHb基因的原核表达及功能分析

为了进一步揭示菠菜非共生血红蛋白(SoHb)的功能,通过RT-PCR的方法从菠菜根中克隆了SoHb基因编码区全长序列,并将其克隆到原核表达载体pET32a上,构建原核表达载体p ET32a-SoHb,并转化大肠杆菌BL21 star(DE3)获得原核表达工程菌株。通过IPTG法诱导该重组质粒在大肠杆菌中得到高效表达,融合蛋白分子质量约为38 kDa,且在上清液和包涵体中均有表达,可溶性部分经Ni2+NTA亲和柱纯化,获得纯化的融合蛋白。与空载体相比,重组菌对硝化胁迫的抗性增加。以纯化的融合蛋白为抗原免疫昆明小鼠,制备多克隆抗体,并对其进行了Western blot检测。实验结果为进一步研究菠菜SoHb基因功能奠定了基础。     

羊口疮病毒119蛋白表达、纯化和多克隆抗体的制备

[目的]克隆表达羊口疮病毒ORFV119蛋白,以纯化重组蛋白为免疫原制备鼠多克隆抗体,并鉴定抗体的特性。[方法]PCR扩增ORFV119基因,克隆入原核表达载体p ET-28a(+)中构建重组质粒p ET28a-119。经双酶切和测序正确后,转化感受态大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白表达情况。表达产物进行超声破碎和Ni柱纯化,之后目的蛋白免疫BALB/c小鼠,制备ORFV119多克隆抗体并对其通过中和实验进行鉴定。[结果]成功构建重组质粒p ET28a-119,在大肠杆菌BL21中ORFV119融合蛋白以部分可溶形式表达。可溶性目的蛋白纯化后作为免疫原制备鼠多克隆抗体,抗体效价达1∶12 800,中和实验显示该多抗具有保护作用,可减轻宿主细胞在病毒感染时的病变效应(中和效价66 ND50/m L)。[结论]成功诱导表达、纯化ORFV119蛋白并制备其多克隆抗体,为深入研究ORFV感染、发病机理及羊口疮疾病的临床诊断奠定基础。     

GST-Ets-1融合蛋白的表达与纯化

[目的]旨在原核表达Ets-1基因,纯化获得GST-Ets-1融合蛋白。[方法]以SD大鼠脑垂体cDNA为模板,利用PCR扩增含有Bam HI和Not I酶切位点的Ets-1基因;然后将其克隆到pGEX-4T-1原核表达载体中,将正确的重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3);用IPTG诱导表达,再利用Magne GST particles亲和纯化GST-Ets-1融合蛋白;最后通过Western blot鉴定此融合蛋白。[结果]成功构建pGEX-4T-1-Ets-1原核表达载体;30℃条件下,0.2 mmol/L的IPTG能诱导出大量的可溶性GST-Ets-1蛋白;经Magne GST particles纯化的GST-Ets-1蛋白可被识别ETS-1的抗体特异识别。[结论]纯化的GST-Ets-1蛋白可用于后续的生物学研究。     

莱茵衣藻缺铁应答基因Femu2p的克隆及原核表达

[目的]克隆莱茵衣藻缺铁应答基因Femu2p,构建重组表达载体p GEX-6p-1-Femu2p,优化条件使其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。[方法]提取莱茵衣藻CC425的总RNA后,利用RT-PCR和两次重叠延伸PCR相结合的方法获得Femu2p的全长编码区,构建原核表达载体p GEX-6p-1-Femu2p,并将其转入大肠杆菌DL21(DE3)中,利用IPTG诱导融合蛋白的表达并优化表达条件。[结果]Femu2p的全长编码区为2 904 bp,编码967个氨基酸,理论分子量为100.4 k Da,理论等电点为8.86。序列分析结果显示该蛋白属于包含多个C2H2类型锌指结构域的Ran BP2家族。IPTG诱导融合蛋白表达的最佳条件为:IPTG浓度0.25 mmol/L,诱导温度16℃,诱导时间8 h。[结论]成功克隆了Femu2p基因的全长编码区,并使其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。     

四川白鹅CD4基因胞外去信号肽区的可溶性表达及纯化

根据Gen Bank公布的四川白鹅T细胞表面分子CD4基因序列设计特异性引物,扩增其胞外去信号肽区基因,将其构建成原核重组表达质粒go CD4-p ET-32a(+),并在大肠杆菌原核表达系统中进行可溶性表达并纯化,为进一步应用与研究提供基础。通过从成年四川白鹅胸腺组织中提取RNA,经反转录合成c DNA为模板扩增CD4基因胞外去信号肽区,并构建原核表达载体go CD4-p ET-32a(+)。在大肠杆菌Rosetta(DE3)p Lys S系统中进行原核表达,通过改变表达温度、培养基、诱导剂IPTG浓度、诱导时间以及抗性浓度等条件,最终获得可溶性表达并经NINTA亲和层析获得纯化蛋白。结果显示,鹅CD4胞外区蛋白只有在16℃的TB培养基中目的蛋白his-go CD4可表达,鉴定结果与预期相符,诱导表达成功且多以不可溶的包涵体形式存在。研究发现改变IPTG浓度对表达产物存在形式影响较大,最终筛选出以0.4 m M的IPTG条件作为可溶性表达的最佳诱导浓度。NI-NTA亲和层析获得纯化蛋白并经Western-blot验证。     

鲍曼不动杆菌MsrA蛋白原核表达载体的构建、纯化及氧化应激条件下的表达

目的以鲍曼不动杆菌甲硫氨酸亚砜还原酶A(methionine sulfoxide reductase A,MsrA)构建p ET28a-MsrA并表达、纯化原核表达重组质粒,观察在氧化应激条件下MsrA的表达水平,为其抗氧化功能的研究提供依据。方法设计并合成分别带NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点的MsrA引物,用PCR方法扩增MsrA基因,构建p ET28a-MsrA重组质粒并转化大肠杆菌,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导重组MsrA蛋白表达,经Ni2+亲和层析分离纯化。利用荧光定量PCR方法,观察在氧化应激条件下MsrA蛋白的表达量。结果构建了编码MsrA蛋白的重组质粒p ET28a-MsrA,SDS-PAGE显示在相对分子质量约22 000处有一明显条带的重组MsrA蛋白,并利用Ni2+亲和层析柱纯化获得纯度较高的MsrA蛋白。氧化应激也可快速诱导MsrA蛋白的表达。结论成功构建了p ET28a-MsrA重组质粒及表达纯化系统,且氧化应激条件下MsrA蛋白表达上调。     

棉铃虫乙醇脱氢酶原核可溶性表达条件的优化

[目的]提高棉铃虫乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)在大肠杆菌中可溶性蛋白的表达量。[方法]研究了诱导温度和诱导剂IPTG浓度对可溶性His-ADH融合蛋白表达量的影响。设置15℃、20℃、25℃、30℃、37℃五个不同温度和0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L五个不同的IPTG诱导剂浓度分别进行原核诱导表达。基于SDS-PAGE和灰度扫描来评价可溶性融合蛋白的表达水平。[结果]表达的目的融合蛋白相对分子质量约为53 k Da,与预测的分子量大小一致,Western Blot分析表明能与His单克隆抗体特异性结合;可溶性融合蛋白的最佳诱导条件为温度25℃、IPTG浓度0.6 mmol/L。[结论]表达优化最终条件为温度25℃(相对表达量为2.21)、IPTG浓度0.6 mmol/L(相对表达量为1.14)。低温有利于可溶性蛋白的形成,诱导剂IPTG浓度并不是越高越好。     

棉铃虫乙醇脱氢酶原核可溶性表达条件的优化北大核心

[目的]提高棉铃虫乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)在大肠杆菌中可溶性蛋白的表达量。[方法]研究了诱导温度和诱导剂IPTG浓度对可溶性His-ADH融合蛋白表达量的影响。设置15℃、20℃、25℃、30℃、37℃五个不同温度和0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L五个不同的IPTG诱导剂浓度分别进行原核诱导表达。基于SDS-PAGE和灰度扫描来评价可溶性融合蛋白的表达水平。[结果]表达的目的融合蛋白相对分子质量约为53 k Da,与预测的分子量大小一致,Western Blot分析表明能与His单克隆抗体特异性结合;可溶性融合蛋白的最佳诱导条件为温度25℃、IPTG浓度0.6 mmol/L。[结论]表达优化最终条件为温度25℃(相对表达量为2.21)、IPTG浓度0.6 mmol/L(相对表达量为1.14)。低温有利于可溶性蛋白的形成,诱导剂IPTG浓度并不是越高越好。     

肺炎支原体铁吸收调节蛋白基因的克隆表达与纯化

[目的]克隆肺炎支原体铁吸收调节蛋白(Fur)基因并纯化Fur蛋白,为研究其生物学功能奠定基础。[方法]利用Clustal Omega分析肺炎支原体Fur蛋白及其同源序列并用MEGA6.0构建进化树,通过PCR扩增Fur基因并对其进行双酶切,然后连接到p ET28a,得到重组载体p ET28a-Fur,将其转化大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG诱导Fur蛋白表达,并通过亲和层析纯化Fur蛋白。[结果]多序列比对和进化树分析表明Mp含有一个Fur蛋白。克隆得到大小为477 bp的Fur基因,编码159个氨基酸。得到重组表达质粒p ET28a-Fur,该质粒能在大肠杆菌中能高效表达,并纯化得到重组Fur蛋白。[结论]成功克隆获得Mp Fur基因,在大肠杆菌中高效表达并获得高纯度Fur蛋白。     

炭疽芽胞杆菌A16R株FtsE蛋白的可溶性表达和纯化

目的:构建炭疽芽胞杆菌FtsE蛋白的原核表达载体,实现其在原核表达系统中的可溶性表达,并纯化融合蛋白。方法:用PCR方法从炭疽芽胞杆菌A16R株扩增得到ftsE基因片段,酶切后连接到pET28a原核表达载体,构建重组表达质粒pET28a-ftsE,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,筛选可溶性诱导表达与纯化融合蛋白的条件,以获得高纯度融合蛋白。结果:构建了FtsE蛋白的融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;在20℃下,经0.1 mmol/L IPTG诱导3 h表达的产物主要是可溶性蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化获得了高纯度的FtsE融合蛋白,经Western印迹检测,目的蛋白表达正确。结论:实现了炭疽芽胞杆菌FtsE蛋白原核表达系统的可溶性表达并获得了高纯度融合蛋白,为后续研究奠定了基础。     

三七法呢基焦磷酸合酶原核表达载体的构建及其表达

在克隆得到三七法呢基焦磷酸合酶(FPS)cDNA的基础上,构建原核表达载体pET32a(+)/FPS,并转化大肠杆菌BL21(DE3)受体菌,在37℃,1 mmol/L IPTG浓度条件下,诱导表达FPS融合蛋白,对诱导表达条件进行了优化.结果表明:成功构建了原核表达载体pET32a(+)/FPS,并在大肠杆菌中成功表达FPS蛋白,分子量约为40 kD,为进一步开展FPS的蛋白纯化和功能分析奠定了基础.     

胰高血糖素样肽-1融合蛋白在原核系统中的表达

[目的]构建点突变的GLP-1Gly8,并与人血清白蛋白(HSA)结构域Ⅰ融合,延长GLP-1的半衰期。[方法]采用常规PCR扩增白蛋白结构域Ⅰ片段,利用SOE-PCR扩GLP-1Gly8基因并将两个基因拼接,得到的HSA-GLP-1Gly8融合基因经Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到p ET30a表达载体,重组质粒p ET30a-HSA-GLP-1Gly8转入E.coli BL21(DE3)宿主菌中进行IPTG诱导表达。[结果]PCR扩增分别获得140 bp的GLP-1Gly8基因499 bp的HSA的片段及经融合后的HSA-GLP-1Gly8基因。表达载体p ET30a-HSA-GLP-1Gly8在E.coli BL21(DE3)宿主菌中经IPTG诱导,过表达了分子量约为22 k Da的融合蛋白。[结论]成功构建了p ET30a-HSA-GLP-1Gly8原核表达载体,融合蛋白在BL21(DE3)菌中以包涵体的形式过表达。