番茄红素β-环化酶基因的玉米转化及 后代遗传分析

利用农杆菌介导法将番茄红素β-环化酶基因(Lycb)转入由玉米自交系天塔五号植株,分析基因在T0转化及后代的遗传情况,结果表明,在27株T0转基因植株中,PCR初步检测后8株呈阳性;将T1代转基因植株以株系为单位用200mg/L草铵膦抗性筛选后,收获抗性植株种子。T2代转基因植株进一步进行PCR、RT-PCR和田间草铵膦涂抹检测,结果表明,PCR、RT-PCR为阳性的6个株系植株均具有草铵膦抗性。选取6株阳性植株提取叶片总类胡萝卜素,经HPLC分析其β-胡萝卜素含量显著高于野生型,表明目的基因Lycb成功的转入玉米,并得到了稳定遗传。     

抗草铵膦除草剂转基因油菜新种质的创制及鉴定北大核心CSCD

草铵膦是一种在世界范围内广泛使用的内吸型除草剂。目前,我国还未研发出具有自主知识产权的抗草铵膦除草剂油菜品种。本研究通过油菜下胚轴遗传转化方法成功将1个新型草铵膦抗性基因Syn1-RePAT转化到甘蓝型油菜中,通过筛选获得了27株阳性单株。利用Southern blot技术筛选出其中的单拷贝T-DNA插入株系,并通过后代分离比检测对重要株系进行了拷贝数验证。利用Inverse-PCR技术对OV40-7、OV40-15、OV40-16和OV40-17等转化体进行T-DNA侧翼序列分析与比对,分离获得了各转基因株系的插入位点信息。对不同转化体株系设计特异性引物,通过PCR技术检测外源基因序列在T1~T3代材料的整合稳定性。RT-PCR和qRT-PCR表达分析证实,Syn1-RePAT转基因在多个转化株系的不同世代稳定超量表达。对T1代转化体进行功能鉴定,各转化体对草铵膦具有良好的抗性,至少可耐受6倍田间推荐施用剂量的草铵膦。本研究所创建的新型抗草铵膦油菜种质资源极具应用前景,为我国抗草铵膦良种培育工作提供了有力支持。     

抗虫抗除草剂转基因玉米HiII-NGc-1的遗传稳定性分析

目的基因和目标性状遗传稳定性是转基因植物新品种选育和产业化的重要前提。以进入农业部环境释放的抗虫抗除草剂双价转基因玉米Hi II-NGc-1为试验材料,采用PCR、RT-PCR和免疫试纸条技术检测转基因玉米连续3代目的基因cry NGc和bar整合及表达的遗传稳定性,采用心叶期除草剂草铵膦抗性鉴定和心叶期/穗期亚洲玉米螟抗性鉴定实验详细分析了目标性状的遗传稳定性。研究结果表明:Cry NGc和PAT蛋白在Hi II-NGc-1中连续3代遗传稳定,高世代稳定耐受正常5倍大田除草剂草铵膦使用浓度,心叶期和穗期高抗亚洲玉米螟性状稳定,具有潜在的产业化应用价值。转基因玉米Hi II-NGc-1目的基因和目标性状遗传稳定性的明确为开展下一步生物安全评价奠定了基础,对复合性状转基因抗虫抗除草剂玉米新品种的选育和产业化具有重要意义。     

除草剂草铵膦对转基因抗草铵膦棉花生长发育的影响

【背景】草铵膦是继草甘膦之后又一种高效、广谱、低毒的非选择性除草剂,有望成为我国转基因抗除草剂棉花的主要靶标之一。目前,在抗草铵膦棉花的不同生育期使用草铵膦是否影响棉花生长发育尚不清楚。【方法】分别在抗草铵膦棉花子叶期、3~4片真叶期、现蕾期、盛花期喷施草铵膦,单次施药量分别为900和1800 g·hm-2,每个处理小区面积25.6 m2。分析草铵膦对花粉育性、棉花生长、产量及纤维品质的影响。【结果】喷施草铵膦对棉花盛花期的花粉活力、株高、茎直径、产量因子、纤维品质等各项参数均无显著性影响,在子叶期使用1800 g·hm-2的高剂量浓度处理时,籽指水平显著低于空白对照处理。【结论与意义】转基因抗草铵膦棉花对900、1800g·hm-2的草铵膦具有较好的耐受性。本研究为转基因抗草铵膦棉花的环境安全性评价提供了依据。     

干旱响应转录因子DREB1A基因导入水稻光温敏核不育系的研究

以成熟胚诱导的愈伤组织作为农杆菌转化的受体材料,将诱导型启动子rd29A驱动的拟南芥DREB1A基因导入粳型光温敏核不育系水稻4008S,共获得67株再生苗.再生苗经0.75 mg/L除草剂草铵膦涂布筛选,有62株再生苗表现出对草铵膦抗性.PCR检测抗性苗中DREB1A基因,结果全为阳性.挑选部分进行Southem检测.结果表明目的基因已经整合到水稻基因组中.在干旱胁迫下,转基因水稻当代(T1代)植株的电导率显著低于非转基因对照植株(P＜0.05),脯氨酸含量显著高于对照植株(P＜0.05),证明DREBIA基因能提高水稻对干旱胁迫的耐受性.     

抗草丁膦和抗草甘膦转基因油菜的抗性基因向野芥菜的流动

通过人工去雄授粉和田间隔行种植试验,研究了抗草丁膦和抗草甘膦转基因油菜(Brassica napus)中的bar基因和EPSPS基因向野芥菜(B. juncea var. gracilis)流动的可能性。结果表明在人工授粉的情况下,以野芥菜为母本,分别以两种转基因油菜为父本,亲和性指数都很高,达13以上,与野芥菜自交或开放授粉条件下的亲和性指数没有明显差异,说明两种转基因油菜和野芥菜的亲和性较好。经两次除草剂筛选,人工杂交获得的所有F₁对相应的除草剂都表现出了明显的抗性,且经PCR检测扩增出了各自的特异性条带,说明人工杂交获得的所有F₁都携带了相应的抗性基因。F₁的适合度研究表明,两种F₁种子萌发率和母本都没有明显差异,营养生长明显好于母本。但花粉活力和结实率明显下降,携带抗草丁膦基因F₁的花粉活力和每角果粒数分别是32.4%和0.59粒,携带抗草甘膦基因F₁的花粉活力和每角果粒数分别是35.1%和0.58粒。经两次除草剂筛选和PCR检测,表明野芥菜和抗草丁膦油菜或与抗草甘膦油菜田间隔行种植分别能产生0.02%和0.014%的携带抗性基因的F₁杂种。以上结果表明抗除草剂转基因油菜的抗性基因具有向野芥菜流动的可能性,且bar和EPSPS基因向野芥菜流动的可能性类似,但对其可能引起的环境后果需要做进一步地深入研究。     

转基因玉米2HVB5的性状鉴定及遗传稳定性分析

为了明确转基因玉米2HVB5的目标性状及遗传稳定性,对回交转育郑58的BC₅S₁、BC₅S₂代转基因玉米2HVB5分别进行了Southern blot、ELISA、室内和田间生物活性测定、靶标除草剂草铵膦耐受性分析及农艺性状调查。结果显示,2HVB5中目的基因cry2Ah-vp和bar都是以单拷贝的形式整合到玉米基因组并稳定遗传,Cry2Ah-vp和PAT蛋白在2HVB5植株的不同时期、不同组织部位均有表达,其中在叶片中的表达量相对较高,分别达到2-3.5 μg/g FW（鲜重）和8-17 μg/g FW（鲜重）。室内生物活性检测结果表明,2HVB5转基因玉米对东方粘虫和棉铃虫有很高的抗性,接虫后4-5 d幼虫死亡率达100%,对草地贪夜蛾有明显的体重抑制。田间抗虫性鉴定结果也表明,2HVB5转基因玉米对东方粘虫和棉铃虫均达到高抗水平,平均抗性级别分别为1.19-1.29和0.60-0.73。2HVB5转基因玉米可耐受田间使用中剂量4倍量的草铵膦,农艺性状与对照郑58相比无显著差异。转基因玉米2HVB5遗传稳定,高抗虫耐除草剂,可用于玉米害虫尤其是夜蛾科害虫的防治,具有产业化应用前景。     

中国转基因大豆的产业化策略

大豆是事关人民生活和经济社会发展的重要农产品之一,提高大豆生产水平和增加自给能力,是中国农业生产必须解决的重大问题。由于中国耕地资源不足的限制,科技创新是提升大豆生产能力的唯一出路。转基因育种是推动大豆生产发展的颠覆性技术,对美国、巴西和阿根廷等世界主产国大豆产业的发展发挥了重要作用。经过20多年的科技创新,中国转基因耐除草剂和抗虫育种技术已经成熟,这些产品的产业化种植可显著降低大豆生产成本和提升单产水平。基于中国转基因大豆技术发展进度和大豆生产的国情特点,我们提出了采用如下策略科学有序推进产业化工作。一是,在产品应用时间上,按照单一耐草甘膦除草剂、多个基因耐草甘膦和草铵膦等多种除草剂,以及耐除草剂与抗虫等复合性状等产品,依次推进相关种子的产业化;二是,在产品区域布局上,按照靶标杂草和害虫的地理分布特点顶层设计各种耐除草剂和抗虫大豆产品的种植区域;三是,在生物安全管理上,研发应用抗性杂草和害虫种群监测与治理技术,延长转基因产品的使用寿命。同时,还要加强野生大豆资源的保护工作,降低转基因大豆基因漂移对野生大豆生物多样性的影响。     

抗虫耐除草剂玉米GH5112E-117C定性PCR检测方法

转基因抗虫耐除草剂玉米GH5112E-117C是由北京奥瑞金公司研发的转mG2-aroA基因和mcry1Ah基因抗虫耐除草剂玉米新品系,对玉米螟、粘虫等鳞翅目害虫具有抗性、耐草甘膦除草剂的转基因玉米,在我国具有重要产业化应用前景。本文研发了GH5112E-117C转基因玉米的定性PCR检测方法,该方法能特异性地检测转基因抗虫耐除草剂玉米GH5112E-117C,在每个反应引物浓度为0.2 μmol/L、Taq DNA 聚合酶0.625 U、DNA模板50 ng,退火温度为58℃的条件下,检测灵敏度可稳定达到0.1%。该方法为转基因抗虫耐除草剂玉米GH5112E-117C的精准检测提供了一种新的技术手段,为农业转基因监管提供技术支撑。     

以草甘膦为筛选标记的大豆转基因体系的建立及抗除草剂转基因大豆的培育

抗草甘膦转基因大豆能显著提高大豆生产效率,具有重大的应用前景.本实验室前期研究建立了农杆菌介导、草胺膦为筛选剂的大豆转基因体系,转化效率在4%以上.在此基础上,利用G6-EPSPS和G10-EPSPS 2个具有自主知识产权的草甘膦抗性基因,通过优化转化体系,成功建立了以草甘膦为筛选剂的大豆遗传转化体系,转化效率达1%以上.浓度梯度实验发现,当草甘膦的筛选浓度为100 mg/L时,虽然丛生芽的再生率下降了50%～60%,但最终转化效率不受影响.进一步通过基因表达分析、Western blot、Southern blot和除草剂抗性鉴定等方法对转基因大豆进行了分子检测和验证,最后获得了分子特征明确、对草甘膦抗性稳定的抗草甘膦转基因大豆后代.结果对国内抗草甘膦转基因大豆转基因方法研究及抗除草剂新品种选育具有意义.     

转金属硫蛋白及其突变体αα基因烟草的T1代性状分析

转金属硫蛋白MT及其突变体αα的烟草自交得到T1代,转基因植株的重金属抗性和除草剂抗性在后代中得到保持,不同的转基因株系在含有除草剂的培养基中萌发时表现出不同的抗性分离比,说明外源基因在植物染色体内可能有不同的整合拷贝数。两种转基因烟草在含有不同浓度Cd的培养基中萌发时表现出高的重金属抗性,其中转αα基因烟草对Cd的抗性优势在T1代种子萌发实验中更加明显。以MT cDNA为探针进行Southern blot杂交,在T0代和T1代同时检测到两种转基因烟草外源基因的存在,证明外源基因确实整合到烟草基因组内并稳定传递到后代。Western blot结果证明了外源基因在烟草第二代的表达,纯合株系仍需要进一步的筛选。     

转金属硫蛋白及其突变体αα 基因烟草的Tl代性状分析

转金属硫蛋白MT及其突变体αα的烟草自交得到T1代,转基因植株的重金属抗性和除草剂抗性在后代中得到保持.不同的转基因株系在含有除草剂的培养基中萌发时表现出不同的抗性分离比,说明外源基因在植物染色体内可能有不同的整合拷贝数.两种转基因烟草在含有不同浓度Cd的培养基中萌发时表现出高的重金属抗性,其中转αα基因烟草对Cd的抗性优势在T1代种子萌发实验中更加明显.以MTcDNA为探针进行Southernblot杂交,在T0代和T1代同时检测到两种转基因烟草外源基因的存在,证明外源基因确实整合到烟草基因组内并稳定传递到后代.Westemblot结果证明了外源基因在烟草第二代的表达.纯合株系仍需要进一步的筛选.     

转LEA基因烟草的耐盐性分析

目的:验证柽柳LEA基因的功能,为通过基因工程手段培育耐盐植物提供基础资料。方法:对转LEA基因烟草当代(T0)和子一代(T1)分别进行不同浓度的NaCl胁迫处理,研究转基因烟草的耐盐性。结果:转基因烟草T0代组培苗耐受NaCl的临界浓度为230mmol/L,而对照耐受NaCl的临界浓度为130mmol/L以下;T1代幼苗耐受NaCl的临界浓度为150mmol/L,对照耐受NaCl的临界浓度为100mmol/L以下;在临界浓度转基因烟草的T0代、T1代根系发育良好,生长量明显高于非转基因对照烟草。结论:柽柳LEA基因的转化提高了烟草的耐盐性。     

转基因大豆豆粕外源基因和蛋白在SD大鼠体内消化吸收分析

为了评估转基因抗草甘膦除草剂大豆的食用安全性,以20%的比例将转基因抗草甘膦除草剂大豆GTS40-3-2和其亲本非转基因大豆A5403豆粕分别添加到基础饲料中喂养两代Sprague-Dawley(SD)大鼠,采用定性、定量PCR和ELISA方法检测转基因大豆成分相关基因和蛋白在长期饲喂的大鼠体内代谢残留状况。结果表明,大鼠喂养转基因大豆豆粕后,除了大鼠肠粪和盲肠内容物检测到有转基因成分的残留,肠道菌群和实质脏器均未发现相关基因和蛋白。结果提示,长期饲喂转基因抗草甘膦除草剂大豆GTS40-3-2与亲本A5403大豆豆粕对SD大鼠具有同样的食用安全性。     

连续单一除草剂应用情况下的转基因直播稻田杂草群落动态

【背景】转基因抗除草剂水稻种植将导致连年连续使用单一目标除草剂,势必会影响杂草群落结构的变化,但其变化规律至今还不十分明确。【方法】于2011~2013年,连续3年在直播种植抗草铵膦转基因Bar68-1水稻田中,使用灭生性除草剂草铵膦,持续观察期间杂草群落结构变化,并与常规选择性除草剂丙草胺—苄嘧磺隆（丙·苄）的应用情况进行对比,以揭示由于种植转基因抗除草剂水稻而使用单一除草剂对稻田杂草群落结构的影响。【结果】草铵膦和丙·苄连续使用后,杂草的物种丰富度和总杂草密度均逐年显著降低。随草铵膦使用年限增加,控草效果持续提高并达到优良水平,而常规选择性除草剂丙·苄的长期使用,致使多年生杂草双穗雀稗演替为群落的优势种,杂草密度呈逐年增加的趋势,导致生物多样性指数显著降低。【结论与意义】抗除草剂转基因水稻种植,在抗性杂草演化之前,不会因单一灭生性除草剂的应用而导致杂草群落迅速朝不良方向演替。长期的群落演替还需要进一步研究观察。     

导入bar基因的水稻新植株可遗传

江苏省农业科学院粮作所王才林、赵凌、宗寿余等和中科院上海生化所龚蓁蓁等9位科研人员,用花粉管通道法将bar基因导入水稻获得可遗传的转基因植株。亦即他们利用花粉管通道法将抗Basta除草剂的bar基因导入水稻品系E32,获得转基因植株。但在T0代仅表现为部分抗性,T1代全部获得了抗性,T3代全部转基因植株能充分表达对Basta除草剂的抗性。通过对转基因植株后代进行PCR分析,证实了bar基因已整合到受体植株的基因组之中,以后又经过遗传分析表明,bar基因能在有性生殖过程中传递给后代植株,并在T3代开始就可分离出抗性一致的稳定株系。目前,其…     

抗除草剂转基因大豆后代遗传分析

分析了来源于农杆菌介导的4个独立的大豆转化系的后代遗传特性。分别采用种子切片GUS染色方法和除草剂涂抹以及喷洒方法检测gus报告基因和抗除草剂bar基因在后代的表达。其中3个转化系T1代gus基因和bar基因能够以孟德尔方式3：1连锁遗传,说明这2个基因整合在大豆基因组的同一位点。这3个转化系在T2代获得了纯合的转化系,并能够稳定遗传至T5代。有一个转化系在T1代GUS和抗除草剂检测都为阴性,但通过Southern杂交证明转基因存在于后代基因组,显示发生了转基因沉默。为了证明转基因沉默是转录水平还是转录后水平,T1代植物叶片接种大豆花叶病毒（SMV）并不能抑制转基因沉默,说明该转化系基因沉默可能不是发生在转录后水平。     

转山菠菜胆碱单加氧酶基因(AhCMO)水稻创制及其耐盐性研究

胆碱单加氧酶(Choline monooxygenase,CMO)是高等植物体内合成甜菜碱的一个关键酶.利用载体pCAMBIA3300与玉米泛素(Ubiquitin)启动子构建了AhCMO基因的过表达载体.采用基因枪轰击愈伤组织细胞将AhCMO基因转化东稻3号(OryzasativaL.subsp.japonica Kato),经抗性筛选,获得再生苗18株,选取农艺性状与野生型基本一致的其中7株进行PCR与Southern杂交检测,获得3株转AhCMO基因阳性植株;RT-PCR的检测结果表明外源AhCMO基因能正常转录;草铵膦叶片涂布试验结果表明,Bar基因在转AhCMO基因水稻植株中能正常表达;对T1代转基因再生植株进行0.5%NaCl高盐处理,结果表明,4号、7号转AhCMO基因水稻耐盐性强于非转基因对照,说明外源AhCMO基因能提高东稻3号的耐盐性.     

表达γ-亚麻酸的无筛选标记转基因大豆的鉴定

对所获得的9株无筛选标记基因的T1代莆豆8008转基因大豆的T2代进行了分析。PCR和Southern杂交检测表明标记基因已不存在于转基因株系中,同时目的基因以纯合或者杂合状态存在于部分株系中,除草剂抗性分析也表明这些转基因株系已不再具有抗除草剂的能力。Northern杂交检测表明Δ6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因株系中可以转录。GC分析表明其中6个转基因植株富含GLA。     

bar基因、PAT蛋白和草丁膦的特性与安全性

在转基因技术得到认同并且给全球带来了巨大的经济和社会价值的同时,也引起了人们对其安全性的关注.目前在转基因作物中抗除草剂作物种植面积最大.本文对除草剂草丁膦及其抗性基因之一--bar基因及其产物PAT蛋白的一些特性和安全性作了阐述.bar基因及筛选剂草丁膦在植物基因工程中发挥着重要作用.bar基因无多效性,与食物中的DNA一样安全.PAT蛋白对小鼠无直接毒性,与已知毒素和过敏原无同源性、无糖基化位点,其热稳定性和消化稳定性无食物过敏原和毒素的特性,对人体和动物安全无毒性.草丁膦是一种生物除草剂,在土壤中易被快速分解,作物收获时未检出残留,对哺乳动物无毒性作用.