Ⅰ型人免疫缺陷病毒(HIV-1)逆转录酶在大肠杆菌中的表达及其初步纯化

Ⅰ型人免疫缺陷病毒(HIV-1)逆转录酶(RT)在抗病毒感染及AIDS治疗药物的设计中是一个重要的靶分子,并且可作为工具酶应用于逆转录PCR等分子生物学研究中。本研究将HIV-1RT基因经PCR扩增并修饰后克隆入大肠杆菌表达载体pBV220,所获重组子所表达的HIV-1RT蛋白占菌体总蛋白的8％左右,且经[~3H]dTTP掺入法证实该重组HIV-1RT具有RT聚合酶活性。用Q-Sepharose层析柱对重组HIV-1RT蛋白进行了初步纯化,所获纯化样品的RT聚合酶比活性(1.7×10~4U/mg)比纯化前的裂解上清提高612倍。     

HIV P66蛋白的表达、纯化及活性检测

此研究的目的是体外表达HIV-1逆转录酶P66亚单位蛋白,并得到纯度较高且具有活性的重组蛋白。首先通过PCR方法从含HIV-1 HXB2标准株全基因的质粒中扩增出全长p66基因,插入表达载体pTWIN1,构建pTWIN-p66质粒。再将该质粒转化到表达菌BL21,在IPTG诱导下表达P66蛋白。表达产物经几丁质柱一步纯化后得到P66蛋白纯品。纯化的P66蛋白分别催化B95-8细胞总RNA、RT试剂盒中对照RNA进行逆转录;同时以试剂盒中的M-MLV RT为对照进行相同的逆转录,PCR后电泳比较活性。结果显示我们构建的pTWIN-p66质粒在IPTG诱导下在原核细胞中P66亚单位蛋白表达量较高,经一步纯化后蛋白凝胶扫描纯度达88%,并具有较好的逆转录活性。与M-MLV RT体外活性比较,两者活性相当。该研究为进一步开发国产HIV确证诊断试剂及抗AIDS药物的研究打下了初步基础。     

HIV-1 CAP2NC蛋白的表达及体外自组装

构建并表达HIV-1 CAP2NC蛋白,探索其体外自组装条件。通过PCR技术扩增HIV-1(NL4-3毒株)CAP2NC基因片段,并将其连接到原核表达载体pTO-T7,获得重组质粒pTO-T7-CAP2NC,然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经疏水层析纯化后获得重组蛋白CAP2NC。SDS-PAGE结果表明,重组蛋白CAP2NC可在大肠杆菌可溶高效表达,经纯化后纯度约为95%。ELISA检测表明重组蛋白CAP2NC可被HIV-1衣壳蛋白特异性单克隆抗体识别,具有较好反应活性。重组蛋白透析后在非原性SDS-PAGE中呈现为多种聚体形式。分子筛排阻层析分析CAP2NC蛋白透析后可进行组装,负染电镜进一步观察显示CAP2NC蛋白在RNA存在条件下,可形成空心管状颗粒,其形态结构与HIV-1病毒衣壳体外自组装形成的类似。上述结果表明HIV-1 CAP2NC蛋白具有体外自组装的性质,为进一步在体外研究非成熟病毒样颗粒结构奠定基础。     

莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶的原核表达纯化及其生物学活性

利用基因重组技术及简易的纯化方法快速制备莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)。设计带有酶切位点的引物, PCR获得MMLV-rt基因片段; 再通过定点突变将目的基因的五个可溶性位点进行突变, 测序正确后, 插入到表达载体pET15b中构建成重组表达质粒pET15b-MMLV-rt; 表达产物的纯品通过金属离子(Ni3+)配体亲和纯化系统得到。用SDS-PAGE分析所纯化产物的大小和纯度, 再用RT-PCR 对其活性进行鉴定。构建的重组表达质粒pET15b-MMLV-rt 经IPTG诱导得到N端带有6His的RT融合蛋白, 通过Ni3+的亲和层析得到纯品蛋白, SDS-PAGE分析表明其纯度可达96%, RT-PCR实验表明具有较高的生物学活性。由此得出利用原核表达及简易的纯化系统可获得纯度为96%的逆转录酶纯品, 为大规模生产该酶提供了可靠的保证。     

莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶的原核表达纯化及其生物学活性

利用基因重组技术及简易的纯化方法快速制备莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)。设计带有酶切位点的引物, PCR获得MMLV-rt基因片段; 再通过定点突变将目的基因的五个可溶性位点进行突变, 测序正确后, 插入到表达载体pET15b中构建成重组表达质粒pET15b-MMLV-rt; 表达产物的纯品通过金属离子(Ni3+)配体亲和纯化系统得到。用SDS-PAGE分析所纯化产物的大小和纯度, 再用RT-PCR 对其活性进行鉴定。构建的重组表达质粒pET15b-MMLV-rt 经IPTG诱导得到N端带有6His的RT融合蛋白, 通过Ni3+的亲和层析得到纯品蛋白, SDS-PAGE分析表明其纯度可达96%, RT-PCR实验表明具有较高的生物学活性。由此得出利用原核表达及简易的纯化系统可获得纯度为96%的逆转录酶纯品, 为大规模生产该酶提供了可靠的保证。     

GST-HRB融合蛋白的表达与纯化

构建GST-HRB重组质粒,进行融合蛋白的表达、纯化及鉴定.利用PCR扩增及基因重组技术,以pcDNA-3.1-HRB为模板扩增出HRB全基因序列,并将其插入带有GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签的原核表达载体pGEX-6P-1中,构建GST-HRB融合蛋白表达质粒.然后,将重组质粒GST-HRB转化至大肠杆菌Rosseta进行融合蛋白的表达.利用GST琼脂糖珠进行融合蛋白的纯化,最后应用SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定纯化的融合蛋白.结果表明,成功构建pGEX-6P-1-HRB原核表达载体,表达及纯化了GST-HRB融合蛋白.     

表达HIV-1 gag重组鸡痘病毒的构建与筛选

构建并筛选表达HIV-1 gag蛋白的重组鸡痘病毒,并对其进行鉴定。首先设计引物通过PCR技术扩增HIV-1 gag基因,将其连接到pMD18-T载体上,测序正确后将其克隆入本实验室自行构建的鸡痘病毒穿梭载体pTKET中,获得重组质粒pTKET-HIV gag。然后将其与鸡痘病毒FPV282E4株共转染原代鸡胚成纤维细胞(CEF)进行同源重组,以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为筛选标记,通过噬斑筛选获得重组病毒,应用PCR,RT-PCR,Western blot方法对重组病毒进行鉴定和遗传稳定性分析。结果:通过10次噬斑筛选,PCR检测表明目的基因已整合到重组鸡痘病毒基因组中,RT-PCR,Western blot结果表明HIV-1 gag在感染细胞内成功表达且具有抗原性。连续传代20次,PCR,RT-PCR,Western blot均能检测到外源基因的整合、转录和表达,且未能扩增出FPV-TK基因,表明重组病毒遗传稳定性良好,而且病毒已经纯化。结论:成功获得表达HIV-1gag的重组鸡痘病毒,为进一步免疫试验研究奠定基础。     

静水椎螺乙酰胆碱结合蛋白在Bac-to-Bac系统中的表达、纯化与结晶

表达、纯化静水椎螺(Lymnaea stagnalis)乙酰胆碱结合蛋白(Ls-AChBP)并得到晶体。将静水椎螺乙酰胆碱结合蛋白cDNA序列克隆到表达载体pFastBac1上,构建了重组表达质粒pFastBac1-Ls-AChBP-His,经重组子筛选,得到重组杆状病毒质粒Bacmid,采用CellfectinⅡ脂质体,把带有外源基因的杆状病毒质粒Bacmid转染到昆虫细胞中,经镍柱和凝胶色谱柱对重组蛋白进行纯化得到五聚体,并用机器人进行结晶筛选获得其蛋白晶体。重组蛋白Ls-AChBP在Bac-to-Bac表达系统中得到高效表达并被纯化,结晶筛选得到晶体。     

人源Fank1蛋白质FN3结构域多肽的原核表达，纯化及晶体筛选

目的纯化人源Fank1（fibronectin type Ⅲ and ankyrin repeat domain1）蛋白质N端FN3（fibronectin typeⅢ,Ⅲ型纤黏连蛋白）结构域蛋白,用于晶体生长的三维结构分析。方法将FN3结构域基因片段克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,将菌落PCR和测序鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL21（DE3）后获得表达菌株。该菌株经IPTG诱导高效表达出带有GST标签的可溶性的融合蛋白,经过Glutathione Sepha-rose^TM 4B亲和层析、Hiload16／60 superdex200分子筛层析纯化后,蛋白纯度达到95％以上。结果纯化蛋白采用悬滴气相扩散法得到棒状晶体。结论成功制备了高纯度FN3蛋白,获得FN3蛋白质晶体,为进一步的三维结构解析及Fank1功能研究奠定了基础。     

重组蓖麻毒素A链蛋白的可溶性表达、纯化与抗原性分析

用PCR方法从克隆质粒pUC19-RTA中扩增出蓖麻毒素A(RTA)链基因,序列分析正确后,亚克隆到原核表达质粒pET-His中,构建重组表达质粒pET-HisRTA,再转化到E.coliBL21(DE3)plysS中获得表达工程菌株BL21/pET-HisRTA。该工程菌在30℃经0.4mmol／LIPTG诱导4h后获得可溶性表达的目的蛋白,约占菌体总蛋白的18.45％,SDS-PAGE分析显示表达的蛋白区带与RTA相对分子量相符,约32kDa左右。表达产物经Ni-NTA亲和层析法一步纯化,蛋白纯度约达97.53％,并可得到约18mg/L重组RTA蛋白。Western印迹和间接ELISA结果证明,重组RTA蛋白与抗天然蓖麻毒素多抗可发生特异性的抗原抗体反应,具有良好的抗原性,这为制备RT特异性抗体及建立RT的检测方法奠定了基础。     

重组斑马鱼 p8蛋白的原核表达及纯化

目的：在大肠杆菌中重组表达斑马鱼p8蛋白并纯化。方法：PCR扩增斑马鱼p8蛋白基因编码区,连接到带有6×His标签的原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-p8并转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导表达;优化表达条件后用Ni^2＋柱纯化重组蛋白。结果：构建了pET-28a-p8重组质粒;目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,亲和纯化后,SDS-PAGE显示相对分子质量为预期的12．8×10^3。结论：获得了斑马鱼p8融合蛋白,为其生物学功能研究奠定了基础。     

沙门菌外膜蛋白D的原核表达及多克隆抗体制备

目的:在大肠杆菌中表达沙门菌外膜蛋白(OMP)D,纯化后制备兔抗OMPD抗体。方法:用PCR方法从鼠伤寒沙门菌中扩增出ompD基因,并插入融合表达载体pET-28a(+)的多克隆位点,构建重组表达质粒pET28a(+)-ompD;以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性重组菌株,经IPTG诱导目的蛋白表达,在变性条件下对目的蛋白进行亲和层析纯化;以表达的OMPD蛋白免疫家兔,制备抗OMPD的多克隆抗体并进行鉴定。结果:扩增了ompD基因,测序证实正确后亚克隆于表达载体pET-28a(+)中,经PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,经诱导在大肠杆菌中表达出相对分子质量为40×103的目的蛋白并进行纯化;纯化的OMPD免疫家兔后,能有效地刺激特异性抗体的产生,抗血清的效价达到1∶10000以上,且具有良好的特异性。结论:构建ompD基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;制备出兔抗OMPD抗体,效价及特异性均良好,为进一步制备肠黏膜高亲和力疫苗奠定了基础。     

人Trim5α嵌合体蛋白与HIV-1gag蛋白体外分子间相互作用的鉴定

目的:表达和纯化人TRIM5α嵌合体蛋白［TRIM5α-H(R328-332)］,并探讨该蛋白和HIV-1gag间的相互作用。方法:将构建的TRIM5α嵌合体pET-28a-TRIM5α-H(R328-332),转化大肠杆菌BL21(DE3) ,获得重组表达质粒pETTRIM5α-H(R328-332),30℃下经IPTG诱导,该融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。获得的重组的蛋白再经过纯化,SDS-PAGE分析重组蛋白,并用免疫共沉淀技术和ELISA等检测重组蛋白与HIV-1 gag间的相互作用。结果:构建的重组质粒在大肠杆菌中获得表达,重组TRIM5α-H(R328-332)蛋白经纯化复性后,通过免疫共沉淀和ELISA等技术,证明TRIM5α-H(R328-332)蛋白能够与HIV-1gag间的相互作用。 结论:在大肠杆菌表达系统中成功表达了重组TRIM5α-H(R328-332)蛋白,并且证实其在体外与HIV-1gag有结合作用。[摘要]　目的:表达和纯化人Trim5α嵌合体蛋白[Trim5α H(R328-332)],并探讨该蛋白和HIV-1gag间的相互作用。方法:将构建的Trim5α嵌合体pET 28a Trim5α H(R328-332),转化大肠杆菌BL21(DE3) ,获得重组表达质粒pETTrim5α H(R328-332),30℃下经IPTG诱导,该融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。获得的重组的蛋白再经过纯化,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白,并用免疫共沉淀技术、His pull down和ELISA等检测重组蛋白与HIV-1gag间的相互作用。结果:构建的重组质粒在大肠杆菌中获得表达,经纯化后的重组Trim5α H(R328-332)蛋白纯度可达90%以上。通过免疫共沉淀、GST pull down和ELISA等技术,证明Trim5α H(R328-332)蛋白能够与HIV-1gag间的相互作用。 结论:本实验在大肠杆菌表达系统中成功表达了重组Trim5α H(R328-332)蛋白,并且证实其在体外与HIV-1gag有结合作用。     

HIV-1 Gag多表位嵌合基因的构建及表达蛋白的抗体制备

旨在通过构建Gag的抗原多表位融合基因及在原核系统的高表达,为HIV诊断及可能的疫苗制备提供试验基础。选定HIV-1 Gag基因中3个片段包含较多抗原表位的区域,设计带有酶切位点的引物,用PCR的方法从HIV-1HXB2全基因扩增编码这3个片段的基因序列,通过质粒提取、酶切、测序方法鉴定基因片段的正确性,SDS-PAGE和Western blotting测定融合蛋白的表达,并免疫动物制备相应抗体。结果显示,构建的HIV-1 Gag多表位嵌合基因的原核表达质粒,酶切和测序结果表明基因序列正确,基因全长576bp。在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达的重组蛋白分子量为27kD,以包涵体的形式存在。纯化目的蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体IgG。ELISA和免疫荧光方法检测显示制备的多克隆抗体能具有特异性反应。成功构建和高表达了HIV-1 Gag多表位融合蛋白,纯化蛋白制备的抗体与HIV-1Gag有特异性结合。为进一步研究HIV-1奠定了试验基础。     

pGEX-4T-3-MFGF21表达载体的构建、表达与纯化

目的:构建小鼠FGF21(fibroblast growth factor 21,FGF21)重组表达载体pGEX-4T-3-MFGF21,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,纯化后获得小鼠FGF21融合蛋白。方法:提取小鼠肝脏总RNA后,经RT-PCR扩增获得目的片段,将其克隆至pMD19-T进行保存。以T载体为模板,扩增MFGF21 mat-peptide,构建重组原核表达载体pGEX-4T-3-MFGF21。将重组质粒转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3)中,在不同IPTG浓度、温度及转速下对表达载体进行诱导表达,优化表达条件,表达产物经SDS-PAGE电泳以鉴定是否为可溶性表达,采用亲和层析法纯化各表达产物后,进行Western blotting鉴定。结果:成功构建重组表达载体pGEX-4T-3-MFGF21,对其进行可溶性表达后成功纯化出GST-MFGF21,经Western-blotting鉴定为目的蛋白。结论:成功构建pGEX-4T-3-MFGF21,得到纯化的GST-MFGF21蛋白。     

重组斑马鱼CD36蛋白的原核表达及纯化

目的：在大肠杆菌中重组表达斑马鱼CD36蛋白胞外区38～432氨基酸残基段并纯化。方法：PCR扩增斑马鱼CD36蛋白的基因编码区,连接到带有6~His标签的原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET28a-CD36,并转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导表达,优化表达条件后用Ni^2＋柱进行纯化。结果：构建了pET28a-CD36重组质粒;目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,亲和纯化后,SDS-PAGE显示相对分子质量为预期的46．8×10^3。结论：获得了斑马鱼CD36融合蛋白,为其生物学功能研究奠定了基础。     

猪丹毒丝菌SpaA蛋白的表达与纯化

[目的]在大肠杆菌中表达猪丹毒丝菌spaA基因并纯化重组蛋白。[方法]利用PCR扩增猪丹毒丝菌临床分离株spaA基因,构建重组质粒p GEX-4T-1-spaA,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达融合蛋白GST-SpaA,并优化表达条件。最后采用GST琼脂糖纯化树脂纯化,SDS-PAGE和Western Blotting检测。[结果]成功扩增spaA基因,获得重组表达菌株BL21(DE3)/p GEX-4T-1-spaA;在菌体OD_(600)为0. 9时,加入IPTG至终浓度0. 1 mmol/L,34℃诱导6 h的条件下表达效果最好。经SDS-PAGE检测和纯化后得到大小为97 kDa的GST-SpaA; Western Blotting检测结果表明,GST-SpaA具有良好的免疫原性。[结论]成功在大肠杆菌中表达了SpaA蛋白,经纯化得到具有免疫原性的重组蛋白,为后续研制猪丹毒丝菌SpaA蛋白亚单位疫苗奠定基础。     

HIV-1整合酶核心区可溶性表达及抑制剂筛选

为了实现HIV-1整合酶蛋白核心区 (central core domain of integrase, IN-CCD) 的可溶性表达,并建立以IN-CCD为靶点的抑制剂体外筛选方法,从包含F185K突变HIV-1 IN基因的质粒中经PCR扩增得到含有F185K突变的IN-CCD基因,克隆到pET28b载体上构建重组质粒pIN-CCD,转化pIN-CCD至E. coli BL21 (DE3)中经IPTG诱导、表达,Ni-亲和层析纯化,获得IN-CCD蛋白。修饰DNA底物,以链亲和素包被的磁珠为载体捕获DNA产物,结合酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测IN-CCD的去整合活性,并筛选以IN-CCD为靶点的抑制剂。结果表明重组蛋白IN-CCD实现了高效可溶性表达,纯化后蛋白纯度达95%。建立的ELISA可以检测IN-CCD的去整合活性,且方法特异性和灵敏度好,可以实现高通量抑制剂筛选。从100个样品中筛选得到5个具有初步抑制IN-CCD去整合活性的样品。     

人抗酶抑制因子-1的克隆与原核表达

目的:克隆人抗酶抑制因子-1(ornithine decarboxylase antizyme inhibitor-1,OAZI-1)cDNA,建立在大肠杆菌中原核表达并纯化人OAZI-1蛋白的实验技术。方法:巢式RT-PCR法从人A549总RNA中扩增人OAZI-1 cDNA并构建pET-28a/OAZI-1原核表达质粒。该质粒转化大肠杆菌原核表达菌BL21(DE3)后IPTG诱导表达。诱导表达出的重组蛋白用Ni-NTA树脂亲和层析纯化。SDS-PAGE和Western法检测重组OAZI-1蛋白的表达和纯化。结果:成功克隆出编码全长人OAZI-1的cDNA序列,并构建出原核表达质粒pET-28a/OAZI-1。DNA测序分析,重组质粒中的OAZI-1 cDNA无突变,与6×His标签框架对接正确。重组质粒转化入大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中后,可用IPTG诱导表达出重组OAZI-1蛋白,该重组蛋白可用Ni-NTA树脂亲和层析纯化。结论:成功建立了人抗酶抑制因子的原核表达和纯化的实验方法,为后续OAZI-1的功能研究奠定了基础。     

F3-PE40基因的克隆、表达及纯化

通过质粒提取、PCR扩增构建F3-PE40表达载体转化大肠杆菌,然后进行表达纯化。以pEKH-F3质粒为模板,PCR扩增F3片段,将F3插入克隆质粒PQE80L,转化大肠杆菌,筛选获得含有F3的PQE80L重组载体。提取绿脓杆菌菌株染色体DNA为模板,PCR扩增绿脓杆菌外毒素A催化区（PE40）。然后将PQE80-F3和PE40重组,得到表达PQE80L-F3-PE40载体。转化至大肠杆菌DH5a,BL21,表达融合蛋白F3-PE40。大肠杆菌表达了融合蛋白F3-PE40,表达的融合蛋白量占菌体总体蛋白量的20%。成功地表达了融合蛋白F3-PE40,为进一步大规模表达、纯化F3-PE40功能奠定了基础。