迟缓爱德华氏菌感染斑马鱼的模型构建及病理分析

【目的】本研究旨在建立迟缓爱德华氏菌感染斑马鱼的模型,以提供疾病模型用于病理学、药理学和药物学研究。【方法】通过不同途径对斑马鱼进行人工感染,模拟自然感染状态,并研究迟缓爱德华氏菌对斑马鱼的致病机理,包括死亡率、行为变化、生化指标和病鱼机体抗氧化能力的变化情况。【结果】比较3种感染途径,显示腹腔注射的致病力最强。迟缓爱德华氏菌感染后,斑马鱼表现出眼球突出、肛门出血、溃疡和腹水等症状。病理检查显示,感染后的斑马鱼发生急性炎症,可见肝细胞广泛坏死脱落,肝小叶萎缩,周围见吞噬细胞聚集。从患病斑马鱼体内分离出TX菌株,并通过特异性引物聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)鉴定为迟缓爱德华氏菌,确定该菌的半致死浓度LD50为3.65×102菌落形成单位(colony forming units, CFU)尾。与对照组相比,注射感染组的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活力降低22.26%,丙二醛(malondialdehyde, MDA)显著升高16倍,酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)活性和碱性磷酸...     

鮰爱德华氏菌外膜微孔蛋白N基因PCR快速检测方法的建立

根据Gen Bank中鮰爱德华氏菌Edwardsiella ictaluri外膜微孔蛋白N(porin N)基因序列(Gen Bank No:NC_012779.2)设计了1对引物,预计目的片段大小为381 bp。通过对反应体系和条件的优化,并进行特异性试验、敏感性试验及人工感染组织样品检测,建立了一种快速检测鮰爱德华氏菌的PCR方法。结果表明,在所检测的鮰爱德华氏菌、迟缓爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、杀鲑气单胞菌、豚鼠气单胞菌、嗜麦芽寡养单胞菌、鲁氏耶尔森氏菌、海豚链球菌、不动杆菌、产气肠杆菌、大肠杆菌、拟态弧菌、荧光假单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌15种细菌中仅鮰爱德华氏菌扩增出特异性条带;敏感性试验结果显示,该方法最小核酸检出量为9.35×10-3ng·μL-1;同时对人工感染的病料肝脏、细菌基因组DNA、细菌菌液及菌落进行扩增,结果显示4种材料均能检测出大小为381 bp的基因片段。本研究所建立的方法特异强、灵敏度高,适用于鮰爱德华氏菌感染病例的高效、快速检测。     

迟缓爱德华氏菌中甘油醛-3-磷酸脱氢酶的胞外分泌调控

【目的】迟缓爱德华氏菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)是糖酵解途径中关键酶之一,前期研究证实是一种广谱性抗原,可作为水产养殖细菌病免疫防治中疫苗的开发靶点。本文探究迟缓爱德华氏菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶的胞外分泌机制。【方法】通过Western blot和ELISA方法考察迟缓爱德华氏菌经典分泌系统缺失株GAPDH胞外分泌情况;使用ELISA方法对迟缓爱德华氏菌突变体文库的GAPDH胞外分泌进行了大规模筛查,并结合q RT-PCR对筛查得到的插入失活株进行了表达分析。【结果】经典分泌系统与GAPDH的胞外分泌存在一定相关性。突变体文库的大规模筛查得到两株GAPDH分泌量明显增加的插入失活株Δesr A和Δesr C,这两个基因的失活会导致GAPDH的胞外分泌量显著上调。【结论】迟缓爱德华氏菌GAPDH的胞外分泌受Esr A和Esr C负调控。     

迟缓爱德华氏菌对Hep-2细胞的侵袭特性

用细胞裂解计数法及超薄切片电镜观察法分析了迟缓爱德华氏菌侵袭ＨＥｐ－２细胞的基本特性。在１５株来源各异的迟缓爱德华氏菌中,有６株细菌具有对ＨＥｐ－２细胞的侵袭能力。细菌侵入细胞后,主要位于空泡内。侵入细胞内的迟缓爱德华氏菌不仅可在细胞内增殖,而且可从细胞内释放出来。用细胞松弛素破坏微丝后可抑制其侵袭作用,而且表现出剂量依赖关系,而在秋水仙素破坏微管后不影响其侵袭力。这表明在迟缓爱德华氏菌对ＨＥｐ－     

迟缓爱德华菌抗独特型单克隆抗体的制备及鉴定

迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda)是肠杆菌科爱德华菌属的一种条件致病菌,可引起败血病,危害鲆、鲤等经济养殖鱼类。但是,经过20余年的研究,虽有各种灭活疫苗和组分疫苗的试验,却无针对该菌病的商品化疫苗的使用报道。抗独特型抗体疫苗技术已成功用于肿瘤、细菌、病毒、寄生虫的防治,具有安全、易大规模生产等优点。鉴于药物防治鱼菌病的局限性,作者在制备了抗迟缓爱德华菌单克隆抗体的基础上,制备抗该菌的抗独特型单克隆抗体,用该菌抗独特型抗体免疫牙鲆, 为预防该菌病提供一种安全有效的新方法。       

美洲黑石斑迟缓爱德华氏菌分离、鉴定及致病性研究

养殖美洲黑石斑(Centropristis striata)发生以“内脏白点”为主要临床症状的暴发性死亡, 为明确美洲黑石斑患病原因, 对患病鱼进行了病原分离、鉴定及致病性研究, 以期为防治美洲黑石斑迟缓爱德华氏菌病提供参考依据。患病的美洲黑石斑的症状主要表现为鳃和内脏组织如脾脏及肾脏上布满白点。从患病鱼的病灶处分离纯化到一株优势致病菌株(ZS201807), 通过对该菌株形态特征、生理生化特性和16S rDNA基因测序等综合分析, 鉴定该菌为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)。人工感染实验证实此菌株可引起健康美洲黑石斑发病并表现出与自然发病相似的症状。利用组织切片和电镜超薄切片技术对患病美洲黑石斑鱼的肝脏、脾脏、鳃丝等6种组织进行组织病理学分析。组织病理结果显示, 脾和肾是感染较严重的主要靶器官, 脾脏组织内大量红细胞浸润, 出现严重瘀血; 鳃丝毛细血管扩张; 肾小管管腔狭窄, 肾小球肿大, 上皮细胞肿胀, 细胞空泡化。超微病理显示, 病鱼脾脏和头肾组织有大量杆状细菌积聚。药敏试验发现该菌对环丙沙星(5 μg/片)、四环素(30 μg/片)、恩诺沙星(5 μg/片)等14种药物敏感; 对青霉素(10 U/片)、阿奇霉素(15 μg/片)、丁胺卡那(30 μg/片)等13种药物耐受。证实此次养殖美洲黑石斑发病死亡的病原菌为迟缓爱德华氏菌。     

迟缓爱德华氏菌对Hep-2细胞的侵袭特性

用细胞裂解计数法及超薄切片电镜观察法分析了迟缓爱德华氏菌侵袭Hep—2细胞的基本特性。在15株来源各异的迟缓爱德华氏菌中,有6株细菌具有对Hep—2细胞的侵袭能力。细菌侵入细胞后,主要位于空泡内。侵入细胞内的迟缓爱德华氏菌不仅可在细胞内增殖,而且可从细胞内释放出来。用细胞松弛素破坏微丝后可抑制其侵袭作用,而且表现出剂量依赖关系,而用秋水仙素破坏微管后不影响其侵袭力。这表明在迟缓爱德华氏菌对Hep—2细胞的侵袭过程中,细胞骨架中有微丝的参与,未发现微管的参与。     

通过葡萄糖醛酸酶-半乳糖苷酶-色氨酸酶(GGT)试验快速检定大肠杆菌的

本文报告用纸片法检查376株细菌产生葡萄糖醛酸酶、半乳糖苷酶和色氨酸酶的能力(GTT试验),97%的大肠杆菌,47.4%的志贺氏菌,41.1%的沙门氏菌能产生葡萄糖醛酸酶。肠杆菌科的其它细菌,包括枸橼酸杆菌,产气肠杆菌,阴沟肠杆菌,蜂窝哈夫尼亚菌,肺炎克雷伯氏菌,爱德华氏菌,沙雷氏菌属,变形杆菌,摩根氏菌属,司徒氏普鲁菲登斯菌(一株例外),雷极氏普鲁菲登斯菌和小肠结肠炎耶氏菌均不产生葡萄糖醛酸酶,假单胞菌属中的绿脓杆菌、粪产碱杆菌以及弧菌科的类志贺邻单胞菌也为阴性。132株大肠杆菌中,90.9%的菌株,其     

迟缓爱德华氏菌EcoRⅠ核糖体自动化分型与聚类分析

【目的】对26株迟缓爱德华氏菌进行自动化核糖体分型,并进行聚类分析。【方法】采用RiboprinterTM全自动微生物鉴定系统对分离自斑点叉尾鮰、日本鳗、多宝鱼、比目鱼、斑醴等宿主体内的迟缓爱德华氏菌进行核糖体分型,以限制性内切酶Eco RⅠ处理、切割菌株DNA;运用Bio Numerics软件分析图像数据。【结果】迟缓爱德华氏菌核糖体图谱与数据库中已有信息进行比对,ATCC15947和BYK00685的比对相似值0.85,分别为0.95及0.90。条形码经软件分析共产生21种核糖体条带,聚类分析分为3个群。条带之间呈现明显的地域性差异和宿主差别。来自北方及南方的菌株除少数几株以外,各自聚集为一个群;所有人源株则分布在第三群。【结论】自动化核糖体分型可以方便快捷地用于不同物种的菌株分型与流行病学追踪溯源。     

迟缓爱德华菌luxS基因在不同生长时期表达水平的差异

摘要:【目的】探索迟缓爱德华菌LuxS/AI-2型密度感应系统关键基因luxS的分布及在不同生长时期的表达特征和生物功能。【方法】克隆迟缓爱德华菌luxS基因,利用生物信息学工具和网络数据库分析该基因序列的特征及编码蛋白的基本特征和保守结构;原核表达LuxS蛋白,纯化后制备抗LuxS的抗体,运用Western-blot技术分析LuxS在不同毒力、不同来源迟缓爱德华菌中的分布情况及在不同生长时期的表达水平;利用抗体中和方法,分析抗LuxS抗体对迟缓爱德华菌生长的影响,探索LuxS是否为信号分子AI-2的特 异依赖模式。【结果】克隆到迟缓爱德华菌luxS基因,长度为516 bp,序列分析结果表明,该基因在迟缓爱德华菌属中高度保守;对多株迟缓爱德华菌LuxS蛋白的检测结果表明,该基因在该菌属中普遍存在;对不同生长时期LuxS蛋白的检测结果表明,LuxS蛋白的表达量在迟缓期较低,进入对数生长期逐渐增加,在对数生长后期最大,稳定后期逐渐减少;抗体中和生长试验结果表明,1%抗血清(效价1:40000)能延长迟缓爱德华菌生长的平台期,但对细菌生长无显著影响。【结论】LuxS/AI-2介导的密度感应系统在迟缓爱德华菌中普遍存在;关键基因luxS的序列高度保守,在不同生长时期表达量不一致,在对数生长后期达到峰值。     

黄颡鱼“裂头病”病原二重PCR检测方法的建立及应用

"裂头病"是黄颡鱼养殖业的主要病害之一,其病原为鮰爱德华氏菌或迟钝爱德华氏菌。以GenBank所收录鮰爱德华氏菌与迟钝爱德华氏菌16S rRNA基因为模板,优化设计两对特异性引物,经多重PCR反应体系优化及特异性与敏感性检测,建立了检测鮰爱德华氏菌和迟钝爱德华氏菌的二重PCR检测方法。结果显示,阳性对照样品的琼脂糖凝胶电泳条带同时检测到鮰爱德华氏菌和迟钝爱德华氏菌,扩增产物大小分别为470 bp及268 bp,灵敏度为1.38 ng/μL。此法用于检测江西南昌地区多个养殖场所患"裂头病"黄颡鱼脑部DNA,11份患病黄颡鱼的脑部组织均检出鮰爱德华氏菌,表明该地区黄颡鱼所患"裂头病"的病原菌为鮰爱德华氏菌,此结果与常规细菌分离鉴定的检测结果一致。所建二重PCR检测法敏感度高,特异性强,检测成本低,对黄颡鱼"裂头病"的快速诊断与流行病学调查有较好的应用价值。     

抗迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda)单克隆抗体的制备及双抗夹心ELISA检测方法的建立

以迟缓爱德华菌株2CDM001为抗原,利用杂交瘤技术制备了迟缓爱德华菌的单抗8D11、8H4、2F4、18C12、16E2、20D3、19G2、5F7、4E6、7C5、18H9。在特异性方面,单抗8H4和2F4特异性较差,与美人鱼弧菌ATCC33539、鮰爱德华菌ATCC33202等参考菌株均出现不同程度的交叉反应,而其余9株单抗特异性强,与实验中用到的除迟缓爱德华菌外的参考菌株均不结合;但与迟缓爱德华菌分离株的检测结果表明,仅有20D3和8H4可与所有分离株结合,其余单抗不能与实验中所有迟缓爱德华菌发生反应。由于单抗8H4与美人鱼弧菌ATCC33539有交叉反应,因此选单抗20D3和兔源多抗建立迟缓爱德华菌的双抗夹心ELISA检测方法,该方法特异性强,灵敏度达到5×10~7CFU/mL。本研究扩充了迟缓爱德华菌单克隆抗体库,为迟缓爱德华菌单克隆抗体的进一步应用提供更多参考数据和可选择的材料。     

一种利用λRed重组技术在杀鱼爱德华氏菌基因组添加标签的方法

在杀鱼爱德华氏菌病原学研究中,在动物中制备杀鱼爱德华氏菌蛋白抗体耗时长,且获得的多克隆或多肽抗体在宿主细胞中特异性差,背景信号强。为解决这一问题,对在大肠杆菌(Escherichia coli)和沙门氏菌(Salmonella)中建立起来的λRed基因编辑方法进行调整和优化,建立了在杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)基因组基因上添加HA标签序列的方法,为使用标签抗体研究杀鱼爱德华氏菌基因功能提供便利。λRed重组系统利用同源线性DNA片段与基因组DNA进行重组。即以质粒pSU315为模板,在引物上引入目的基因的特异性序列,扩增FRT序列和抗生素抗性基因;以获得的PCR产物转化携带pKD46的杀鱼爱德华氏菌,在pKD46表达的λ噬菌体的3个重组蛋白(Exo、Beta和Gam)作用下, PCR产物与杀鱼爱德华氏菌基因组发生同源重组,获得引入了抗生素抗性的靶基因缺失或靶基因携带标签序列的菌株;接着利用pKD46的温敏型特性,消除引入的pKD46;最后向杀鱼爱德华氏菌引入文章构建的表达Flp重组酶的质粒pKD46-flp,在FLP作用下,两个FRT位点之间发生重组,...     

检测鲆鱼腹水病病原菌迟缓爱德华氏菌和溶藻弧菌的嵌套PCR方法

本文首次建立了用嵌套式聚合酶链式反应（nested-PCR）分别检测天津地区海水工厂化养殖大菱鲆和褐牙鲆腹水病病原菌迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）和溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）的方法。以E781F和E781R为引物,扩增迟缓爱德华氏菌溶血素基因中781bp的片段,再以E485F和E485R为引物,扩增其中的485bp的片段;以V899F和V899R为引物,扩增溶藻弧菌胶原酶基因中899bp片段,再以V550F和V550R为引物,扩增其中的550bp片段。以其他常见海水鱼类致病菌为阴性对照,结果均无非特异性扩增。对迟缓爱德华氏菌和溶藻弧菌的检出灵敏度分别可达10fg和1fg细菌DNA,显著优于目前的检测方法。作者应用该技术对天津地区海水工厂化大菱鲆和褐牙鲆于2006年3月至10月连续进行监测,为有效地控制该病的流行提供了技术支撑。     

具有ACC脱氨酶活性的杜仲内生细菌的分离鉴定及其抗菌活性

采用富集筛选法从杜仲根中分离到5株具有ACC脱氨酶活性的内生细菌, 利用纸片法测定它们的抑菌活性, 通过形态特征、生理生化试验和16S rRNA序列分析对分离菌株进行鉴定。结果显示, 5株杜仲内生细菌均具有较高的ACC脱氨酶活性, 其中4株菌对大肠杆菌CGMCC1.1103和枯草芽孢杆菌CGMCC1.769均有较好的抑菌活性, 通过生理生化试验和16S rRNA序列分析, 将菌株JDM-2、JDM-8、JDM-11、JDM-14和JDM-19分别鉴定为Pseudomonas koreensis、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigii)、变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)和阿氏肠杆菌(Enterobacter asburiae)。     

应用绿色荧光蛋白标记迟缓爱德华菌感染斑马鱼

目的建立斑马鱼模型研究迟缓爱德华菌的致病性及感染途径。方法应用绿色荧光蛋白标记迟缓爱德华菌,追踪观察其感染斑马鱼的动力学过程及病理组织学变化。结果病理组织学检查以肝脏水肿变性,肝细胞萎缩、坏死、脱落,脾脏散在增生性结节、充血、水肿、淋巴细胞大量缺失等病变为主;感染后,该菌先后在斑马鱼肠道、鳃和皮肤中定植。结论斑马鱼可作为研究迟缓爱德华菌致病性的动物模型。肠道、鳃和皮肤可能是迟缓爱德华菌先后感染斑马鱼的主要途径。     

氰化钾四唑盐半固体培养基

氰化钾抑制试验是鉴定肠杆菌科的重要生化试验之一。氰化钾的抗性试验主要用于鉴别弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、沙门氏菌(Salmondla)和亚利桑那菌(Arizona)。肠杆菌科中对氰化钾有抗性的其它细菌可用尿素酶、V-P、吲哚等生化试验加以鉴别。Kauffman等推荐,对在24小时内不发酵乳糖的肠杆菌科     

禽蛋表面肠杆菌的分布及其喹诺酮耐药基因的检测

调查北京市禽类市场禽蛋表面肠杆菌的分布,及其喹诺酮耐药基因携带状况。共采集禽类市场禽蛋表面涂抹物标本65份,经肠杆菌SS培养基上培养,根据形态和颜色不同,获得108个单菌落,鉴定为11个种或属,构成比最多的前3个种属分别是埃希氏菌属(42.6%),克雷伯菌(17.6%)和假单胞菌(12.0%)。在所有108株菌中,共30株菌(27.8%)检测到喹诺酮(qnr)耐药基因,其中qnrBm阳性率为23.2%,qnrAm阳性率为6.5%,但未检测到qnr Sm基因;qnrAm与qnrBm同时呈阳性的有2株菌。按种属不同,除泛菌属外,其他10个种属的细菌均检测到喹诺酮耐药基因,最多的为埃希氏菌属(8株),其次为柠檬酸菌属(6株),以及普罗威登斯菌(3株)和克雷伯菌(3株)。得出结论 :北京市禽类市场禽蛋表面携带的肠杆菌种类较多,喹诺酮耐药基因分布较广,相关部门应加强对禽蛋中肠杆菌的监测和用药管理。     

牙鲆迟钝爱德华氏菌感染症及其病原的研究

对 7起牙鲆迟钝爱德华氏菌感染病例进行了发病情况、临床特征、病理变化等方面的检验 ,经对细菌的分离与鉴定表明所检病例均为迟钝爱德华氏菌的单独感染 ,系统归纳了该感染症的主要特点。同时 ,对所分离后做纯培养的 130株迟钝爱德华氏菌进行了主要生物学性状、血清型的测定 ,表明除在生化试验的吲哚项目中表明有株间差异 (阴性的 2 0株、阳性的 110株 )外 ,130株对其他所测内容的结果一致 ,130株均为同种血清型。从每起病例分离并鉴定的各 1个代表菌株做对健康牙鲆的人工感染试验 ,表明了相应的原发病原学意义及较强的致病作用。药敏试验结果表明 ,对供试 37种抗菌药物中的头孢唑啉等 19种药物敏感、对青霉素G等 5种药物耐药、对氨苄青霉素等 13种药物表现了株间差异。经以荧光抗体技术对纯培养物、人工感染病死鱼肝脏中细菌的检验 ,初步表明了荧光抗体技术在对迟钝爱德华氏菌检验中作为辅助检验手段的可行性。     

Hui爱德华氏菌变异株C9605及对弊的致病性研究

从患白板综合症的病鳖分离到一株细菌（Ｃ９６０５）,该菌为革兰氏阴性,直杆状,周生鞭毛。接触酶阳性,氧化酶阴性,还原硝酸盐,对多粘菌素不敏感,不利用柠檬酸盐和丙二酸盐作唯一碳源,不从甘露醇、蔗糖、海藻糖、Ｌ－阿拉伯糖产酸。根据这些特性,菌株可归于Ｈｕｉ爱德华氏菌。但是该菌发酵木糖产酸,产生Ｈ２Ｓ,耐青霉素,故鉴定为Ｈｕｉ爱德华氏菌变异株。人工感染实验证实,该菌株是鳖白板综合症的病原菌。